Utilizacin y evaluacin del mtodo molecular SDS-PAGE para la comparacin y

construccin de relaciones fenotpicas entre 4 especies de bacterias de la familia

Enterobacteriaceae.
Diego Andrs Martnez1, Andrs Felipe Zuluaga Zuluaga2, Santiago Ramrez Said3, Julin
Santamara Alvarez3
1

Departamento de Ingeniera Biomdica. 201317471, 2Facultad de Medicina, 3Departamento de Ciencias Biolgicas,

4
Departamento de Qumica, Universidad de Los Andes, Bogot, Colombia.

Resumen
Los rboles fenticos son herramientas utilizadas ampliamente en la biologa para realizar e
inferir relaciones entre organismos basados en sus fenotipos. La comparacin de protenas
y de cidos nucleicos extrados en un grupo de organismos permite establecer criterios
acerca de la relacin entre estos. Una tcnica recurrente para comparar estas
macromolculas es el SDS-PAGE el cual se fundamenta en la separacin de protenas,
otorgando a todas una misma carga neta y separndolas por su peso molecular. En este
caso, se utiliz un gel de poliacrilamida para separar protenas de cuatro especies
bacterianas, Escherichia coli (C600, K12y W) Proteus spp. Yersinia entercolitica y
Salmonella typhi, todas de la familia Enterobacteriaceae. Luego de separadas, se realiz
una matriz de caractersticas fenticas para construir un rbol fentico y poder dar cuenta de
las relaciones entre esta familia bacteriana.
Abstract
The phenetic trees are tools widely utilized in biology to construct and hypothesize
relationships between organisms based on their phenotypes. The comparison of proteins
and nucleic acids extracted from a group of organisms allows the establishment of criteria
to build the relationships between them. A recurrent technique to compare these
macromolecules is the SDS-PAGE which is based in the separation of proteins, by giving
them all the same net charge, and separating them only by their molecular weight. In this
case, a polycrilamide gel was used to separate proteins from four different bacterial
species, Escherichia coli (C600, K12y W) Proteus spp. Yersinia entercolitica y Salmonella
typhi, all of the latter coming from the Enterobacteriaceae family. After being separated, a
phenetic characteristic matrix was done in order to build a phenetic tree and for being able
to realize the relationships within this bacterial family.
Palabras clave: Bacterias, fentica, Proteoma, SDS-PAGE

I. Introduccin
Las bacterias fueron el primer organismo
en colonizar nuestro planeta y desde su
aparicin hace 3 billones de aos, han
sido de fundamental importancia para la
generacin de toda la vida que irradia hoy
en da el planeta. (Errington, J., 2013) Por
lo tanto, es muy fcil entender la
fascinacin que los humanos hemos

desarrollado por ellas, otorgndoles gran

utilidad, desde la industria alimentara
hasta la ambiental.
Como todos los seres vivos, los procesos
bioqumicos y biolgicos de las bacterias,
(que tanto importan a los humanos) son
orquestados por protenas. Por lo tanto el
estudio de las protenas de estos
organismos nos permite no solamente

aprender cmo se producen los

bioproductos en las bacterias pero
tambin nos informa acerca de su
ecologa, ciclo de vida y nicho en el
ambiente (Ceri, H. & Westra, Y., 1988).
Como organismos de tanta utilidad para el
hombre y de importancia para la vida en
general, es clara la razn por la cual un
estudio completo de sus mecanismos
proteicos es necesario.
Aunque hoy en da, la variedad de
procesos moleculares para el estudio de
las protenas en microorganismos es muy
amplia, uno de los mtodos ms
econmicos, sencillos y efectivos para
realizarlos es la electroforesis en gel, un
mtodo que permite la separacin de
protenas basada en su carga, propiedades
fisicoqumicas, su tamao y peso
molecular (Schagger, H & von Jagow, G.,
1987). Si se desea separar las protenas de
la muestra a estudiar en base solamente
de su peso molecular, se emplea
generalmente la tcnica del SDS-PAGE,
el cual gracias al SDS, se otorga una
misma carga negativa a todas las
protenas y estas pueden correr por el gel
solo dependiendo de su peso (Kresge, N.
Simoni, R & Hill, R., 2006).
Ahora bien, despus de correr las
protenas en el gel, falta todava la parte
ms importante, y es realizar las
relaciones feneticas entre las bacterias. La
utilidad al trabajar con protenas y cidos
nucleicos es que secuencias similares
tendrn
propiedades
fisicoqumicas
parecidas (mismas bandas en el gel) y por
lo tanto darn informacin acerca de los
linajes de dos bacterias, que seguramente
tuvieron un ancestro comn no muy
lejano, en comparacin con bacterias que
tienen menos bandas en comn entre s;
lo que significa que la divergencia de los
linajes fue ms ancestral y por lo tanto

existe una mayor diferencia en su

proteoma (Sayed, N. 2012).
Por ltimo es de gran importancia
reconocer que este mtodo molecular slo
nos permitir construir las relaciones
basadas en el tamao de las protenas y no
por su secuencia y funcin en s. Por lo
tanto, no se lleva a cabo un anlisis
funcional de las protenas y por lo tanto el
rbol fentico construido, se basara ms
que todo en caractersticas como
protenas de tamao parecido ms que
porque tengan funciones parecidas,
elemento que sera mucho ms
informativo para entender las relaciones
entre ellas).
En este orden de ideas, el objetivo de este
estudio es estudiar las relaciones fenticas
en base a las protenas de 4 especies de
bacterias, Escherichia coli (C600, K12y
W) Proteus spp. Yersinia entercolitica y
Salmonella typhi, para construir un rbol
fenetico y compararlo con las relaciones
ya conocidas en la literatura.
II. Materiales y Mtodos
II.I Extraccin de protenas
bacterianas
En la realizacin de la extraccin de
protenas en bacterianas, se deja crecer las
bacterias over night en un caldo LB con
determinada agitacin. Despus, se aade
una porcin del medio de cultivo al
eppendorf correspondiente de cada
bacteria.
El siguiente paso es la
centrifugacin de los eppendorfs y aadir
al sobrenadante en hipoclorito diludo, se
realiza un vrtex para el resuspendido de
la muestra. El Buffer que se realiza para
la muestra est compuesto por un
detergente (SDS) el cual ataca a los
enlaces apolares de las protenas,
ayudando a la lisis celular y a la carga (-)
que necesitamos en nuestra muestra de

protenas, glicerol el cual compite con el

glicerol de la membrana de la bacteria
ayudando a la lisis celular, y un colorante
de Azul de bromofenol el cual ayuda al
tinte de las protenas para visualizar el
frente de corrido en el gel. Seguido a esto
se
colocan
las
muestras
(con
perforaciones en las tapas de los tubos
eppendorf)
en una plancha de
calentamiento a 100C para ayudar a
romper los enlaces disulfuro de nuestras
protenas en remplazo de un reductor, en
el paso final en la preparacin de la
muestra es centrifugar nuestras muestras,
quitar el (moco) y el sobrenadante son
las protenas.
II.II Electroforesis
poliacrilamida

en

geles

de

Para la electroforesis en geles de

poliacrilamida. Se realiza el gel de
separacin y para esto se prepara una
solucin de persulfato de amonio (agua
con persulfato de amonio al 10%).
Despus, se marca un aforo para el gel y
se realiza una mezcla de solucin de
poliacrilamida, pH 8.8 y agua. A sta se le
adiciona persulfato de amonio al 10% y
TEMED. Se agita suavemente y se inserta
inmediatamente hasta el punto de aforo,
se cubre con agua desionizada. Una vez
estuvo polimerizado el gel se remueve el
agua volteando el montaje.
Para la realizacin del gel de stacking
primero se mezcla poliacrilamida con
solucin pH 6.8 y agua. A esto se le
adiciona persulfato de amonio al 10% y
TEMED. Se agita bien y se usa
inmediatamente. Se espera hasta que el
gel se polimerice.
Seguido se hace el corrido de extractos de
protena celular bacteriana ya extrada, al
gel hecho se utiliza de tcnica llamada
electroforesis denaturante SDS-PAGE.
Primero se realiza el montaje de la

cmara de electroforesis. Se empieza por

llenar la cmara interna con buffer de
electroforesis 1X hasta que se cubren
todos los pozos y la cmara externa
(deba estar aislada de la cmara interna).
Se siembra determinada porcin de cada
una de las muestras teniendo en cuenta el
orden aleatorio de sembrado. Se cierra la
cmara de electroforesis, y se inicia el
corrido con determinado voltaje segn lo
que se necesite, en este caso fue de 150V
durante 90 minutos.
II.III Tincin con Azul de Coomassie
Al terminar la electroforesis, se hace el
fijado. Se prepara la solucin de fijado.
Esta solucin se compuso de: 50% de
etanol, 10% de cido actico y 40% de
agua desionizada. Luego se vierte la
solucin de fijado en las cubetas de
tincin. Se retira el montaje de los
vidrios. Se separa y se descarta el gel de
stacking. Posteriormente, se hace un corte
en la esquina superior del gel de
separacin en donde se encontraba el
primer carril de sembrado. Este gel se
deposit en la cubeta con la solucin de
fijado y se mantuvo una media hora en
sta.
En la realizacin de la tincin con Azul de
Coomassie el cual tie las protenas con
especificidad. Se prepara la solucin de
tincin aadiendo cada uno de los
siguientes reactivos en su orden
respectivo: 50% de metanol, 10% de
cido actico, 40% de agua desionizada y
0.05% de Coomassie. sta solucin se
deja aproximadamente una hora en
agitacin continua. Despus de realizar la
tincin, se hace la destincin. En esta se
prepara la solucin de destincin
aadiendo cada uno de los siguientes
reactivos en su orden respectivo: 50% de
metanol, 10% de cido actico y 40% de
agua desionizada. Se descarta la solucin

de tincin en un recipiente de vidrio con

tapa (siempre intentando no botar el gel)
despus se procede a un enjuague con
agua desionizada. Posteriormente, se
agreg una porcin de la solucin de
destincin y se deja el gel en agitacin
constante. Se hace una revisin peridica
del gel hasta que se obtiene la intensidad
de bandas necesaria para hacer las
observaciones. Al encontrar una elevada
coloracin azul de fondo que compite con
las bandas se reemplaza la solucin de
destincin por una nueva. Cuando
finalmente se obtiene la intensidad de
bandas esperada, se hace el secado del gel
en papel celofn en fro.
Para el anlisis de las bandas que se
obtienen luego de la tincin se realiz una
matriz de 1 y 0. Posteriormente, a partir
de esta matriz se generaron 2 fenogramas
con el uso del programa PAUP*. Esto nos
permitir analizar la cercana con la
realidad de las relaciones fenotpicas
entre las especies de bacterias.
Finalmente, se elabor otra matriz que
relaciona las muestras pero en base a
informacin de los rasgos principales que
caracterizan a cada una de las especies
para realizar una comparacin y
desarrollar un posterior anlisis de
efectividad de la metodologa propuesta.
III. Resultados
Luego de realizar una plastificacin al gel
de poliacrilamida posterior al proceso de
tincin, se obtuvieron los resultados de la
figura 1.

Figura 1. Gel de poliacrilamida luego de la

electroforesis y su respectiva tincin. Se muestran las
especies que corresponden a cada uno de los pozos y las
bandas seleccionadas para la realizacin del fenograma.

Ya obtenidas las bandas, se selecciona el

mayor nmero de bandas para analizar, y
se realiza la matriz de 1 y 0 de la Tabla 1,
donde se muestra la presencia o ausencia
de cada banda en las seis bacterias. As, a
partir de sta se pudieron obtener los
fenogramas que relacionan los fenotipos
de los especmenes estudiados, en base a
dos mtodos: Neighbor Joining (figura 2)
y UPGMA (figura 3).
Bacte\n
um
E.coli
W
E.coli
K12
E.coli
C600
Proteus
Salmon
ella
Yersinia

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1
0

1 1 0 1 1 1 0 1 1 1
1 1 0 1 1 1 0 0 1 1
1 1 0 1 1 1 0 0 1 1
0 0 1 0 0 1 1 1 1 1
1 0 1 1 0 1 1 1 0 1
0 0 1 0 1 0 0 0 0 0

Tabla1. Matriz de muestras analizadas en el

gel

Figura 2. Fenograma de especmenes analizados en la

electroforesis con el mtodo Neighbor Joining

enterocolitica. Caracteristicas: (1) Gram negativa (-).

(2) Siderforos.(capacidad de la bacteria para quelar Fe)
(3) Catalasa (+). (4) Oxidasa negativa (-). (5) Actividad
ureasa. (6) Modificada genticamente. (7) Produccin
vitamina B12. (8) Produccin Fenialanina desaminasa.
(9)
Indol.
(Habilidad
de
romper
el indol del aminocido triptfano)
(10)-galactosidasa
en pared celular.

Figura 3. Fenograma de especmenes analizados en la

electroforesis con el mtodo UPGMA

El mtodo UPGMA es un algoritmo para

generar arboles filogenticos enraizados y
asume que la distancia evolutiva entre las
especies es la misma, este sistema se
reproduce hasta que todas las especies
quedan agrupadas unidas por nodos
internos. Por otro lado, Neighbor-joining
usa como principio el mayor acortamiento
posible de las distancias evolutivas entre
especies lo que genera un rbol ms
preciso y permite ver el cambio evolutivo
a partir de la longitud de las ramas.
Adicionalmente, Los mismos metodos
tambien fueron aplicados para obtener los
fenogramas
de
la
matriz
con
caracteristicas especificas de cada
especimen, los cuales se muestran en las
figuras 4 y 5.
Carcter

(1)

(2
)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7
)

(8)

(9)

(10)

E. coli W

E. coli K12

E. coli C600

Proteus
mirabilis

Salmonella
thypi

Yersinia
enterocolitic
a

Especie

Tabla 2. Matriz comparativa entre las especies

Escherichia coli (cepas W, K12 y C600), Proteus
mirabilis,
Salmonella
typhi
y
Yersinia

Figura 4. Fenograma de especmenes analizados por

bibliografia con el mtodo Neighbor Joining

Figura 5. Fenograma de especmenes analizados por

bibliografa con el mtodo UPGMA

IV. Discusin
Como se puede ver que los fenogramas de
las muestras no presentaron los resultados
esperados, que describen los fenogramas
de caraceriticas reales. Esto puede ser
consecuencia de errores en el manejo, as
como tambin en el sesgo que presenta la
escogencia de las bandas en el gel de
poliacrilamida teido. Adems, las
muestras de bacterias que se utilizaron en
la experimentacin fueron modificadas
genticamente, entonces no presentan las
membranas de pptidoglicano u oxidasa
negativa. Esto ltimo se puede inferir de
la tabla 1 y de la tabla 2. En la primera no
hay ninguna caracterstica que tenga
presencia en las 6 especies, mientras que
en la segunda las caractersticas 1 y 4 si
posee presencia en todos los especmenes.

Sin embargo tambin se presentaron

similitudes. La Yesenia entercolitica en
los fenogramas de ambos objetos de
anlisis (muestras y caractersticas reales)
se separaba de todas las dems especies,
como se evidencia en la figuras 3 y 5,
adems del corrido en el pozo 6 en el gel
de poliacrilamida, donde no se observan
gran cantidad de bandas.
Adicionalmente, en los fenogramas de las
figuras 2, 3 y 5, las muestras de E. coli se
encuentran muy relacionadas como se
esperaba. Asimismo, la mayora de las
bandas en el gel para estos mismos
especmenes fueron congruentes entre s.
Es decir que estaban presentes en los tres
pozos de corrido.
Segn
nuestro
anlisis
estndar
(caractersticas reales) las muestras de
Yersinia entercolitica deberan estar
relacionadas con las de Proteus spp. y
Salmonella typhi, sin embargo en los
fenogramas de las muestras analizadas se
encontraban separadas, para el caso del
mtodo UPGMA en la figura 3. Esto se
evidencia en que el corrido de la Yersinia
entercolitica haba poca presencia de
bandas, mientras que en la Proteus spp.
haba una sobrevisualizacin de las
bandas que no permita distinguirlas
correctamente. Dichos errores pueden ser
delegados a errores en la tincin y
destincin del gel, ya que el background
pudo no haberse retirado completamente
del gel.
Adicionalmente, en todos los fenogramas,
a excepcin de la figura 1, existe una
congruencia entre las muestras y la
literatura con la agrupacin entre las
muestras de E. coli y entre la Proteus spp.
y la Salmonella typhi.
Finalmente, se puede apreciar que
tambin hay presencia de bandas en la

mayora de los especmenes. Esto puede

relacionarse a caractersticas especficas
para esta familia de bacterias o de las
bacterias en general (Eubacteria).

V. Conclusiones
El gel al final dio el bandeado esperado lo
cual quiere decir que los procesos fueron
realizados de manera correcta y de la
manera ms exacta posible. El rbol
fnetico obtenido no se parece mucho al
filogentico en la literatura para esta
familia de bacterias tan importante para el
ser humano (Paradis, S., et al., 2005). Sin
embargo si se presentaron algunas
similitudes, ya sea por caractersticas
especficas de la familia a la que
pertenecen las especies o por relaciones o
agrupaciones de los especmenes en cada
uno de los resultados analizados.
Sin embargo, la informacin brindada por
las protenas denaturadas, aunque si
brinda cierta informacin acerca de las
relaciones fenotpicas de las bacterias, se
queda corta en muchos aspectos, ya que
elementos tan importantes como la
funcin de la protena se pierde y no se
pueden utilizar para la construccin del
rbol. Para experimentos futuros, se
recomienda utilizar otros mtodos de
anlisis molecular para generar arboles
ms acordes y que tengan en cuenta
factores de ms peso en la historia
evolutiva. Un estudio de ADN por
ejemplo, realizado con una PCR mediante
la realizacin de primers especficos para
genes, puede resultar ms esclarecente
aunque consumira ms tiempo y
recursos.
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