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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA
Escuela Acadmico Profesional de Farmacia y bioqumica

Farmacia y bioqumica carrera a la vanguardia de las ciencias de la salud, el

conocimiento libera nuestras capacidades y la buena enseanza se reflejar en nuestro
liderazgo profesional

USO Y CUIDADO DEL ESPECTROFOTMETRO DE

ABSORCIN UV-VISIBLE Y OBTENCIN DE
ESPECTROS
Curso: Q. Analtica Instrumental
Mg.: Carlos Casas, Norma Anglica

USO Y CUIDADO DEL ESPECTROFOTMETRO DE

ABSORCIN UV-VISIBLE Y OBTENCIN DE
ESPECTROS
1. OBJETIVO
Aprender el correcto manejo del espectrofotmetro de absorcin UV-visible.

2. PARTE EXPERIMENTAL
a) Preparar soluciones de concentracin adecuada cuya lectura de transmitancia
tenga valores entre 20%T a 70%T.
Se prepararn las siguientes soluciones a partir de una solucin patrn al 5%:
0.1 ug/ml
0.2 ug/ml
0.4 ug/ml
0.5 ug/ml
0.8 ug/ml

1 ug/ml
4 ug/ml
6 ug/ml
8 ug/ml
10 ug/ml

12 ug/ml
15 ug/ml
20 ug/ml
25 ug/ml
30 ug/ml

40 ug/ml
50 ug/ml
80 ug/ml
100 ug/ml
500 ug/ml

La solucin patrn es la Azosulfamida diluida al 5%, se coge una pipeta y se mide un

1ml, luego se lleva a una fiola de 100ml; se debe tener cuidado al momento de
vaciar el contenido de la pipeta a la fiola, ya que al ser una sustancia espesa se
quedar pegado por las paredes de la pipeta; por ello, se debe liberar la sustancia
lentamente. Posteriormente, se realizan los clculos para la preparacin de las
siguientes concentraciones, preparndose 100ml de solucin de mayor
concentracin y solo 10 ml de solucin de menor concentracin.
b) Realice las lecturas individuales desde 200 a 450 y de 450 a 850 nm, registrando
los valores de absorbancia y % de trasmitancia.
[]
0.1 ug/ml
0.2 ug/ml
0.4 ug/ml
0.5 ug/ml
0.8 ug/ml
1 ug/ml
4 ug/ml
6 ug/ml

%T
90.2
82.6
97.6
92.9
88.2
86.1
70.4
61.1

%A
0.0447
0.0777
0.0105
0.0319
0.0545
0.0649
0.1524
0.2139

[]
12 ug/ml
15 ug/ml
20 ug/ml
25 ug/ml
30 ug/ml
40 ug/ml
50 ug/ml
80 ug/ml

%T
35.4
29.2
19.5
13.2
9.4
4.1
1.3
0.2

%A
0.4509
0.5346
0.7099
0.8794
1.0268
1.3872
1.8860
2.6989

8 ug/ml
10 ug/ml

45.3
44.3

0.3439
0.3535

100 ug/ml
500 ug/ml

0
-

3. DISCUSIN
La absorcin de radiacin ultravioleta o visible proviene de la excitacin de los
electrones enlazantes y como consecuencia, las longitudes de onda de los picos de
absorcin pueden correlacionarse con los tipos de enlace que existen en las especies
de estudio. La espectrofotometra de absorcin molecular es por tanto valiosa para la
identificacin de los grupos funcionales de una molcula. Sin embargo, son ms
importantes las aplicaciones de la espectrofotometra de absorcin ultravioleta y
visible para la determinacin cuantitativa de compuestos que contienen grupos
absorbentes o tambin llamados CROMFOROS.
La azosulfamida es por tanto una sustancia en la que hay presencia estos grupos
cromforos, se logra tal evidencia por su notoria coloracin y debe ser as mismo una
sustancia qumicamente pura; tambin se debi a que todos los compuestos orgnicos
son capaces de absorber radiacin electromagntica porque todos contienen
electrones de valencia que pueden ser excitados a niveles de energa superiores.
Esta sustancia se utiliz al 5%, sin embargo segua siendo muy densa; es por ello que
en un principio cuando se prepar la primera dilucin de 500 ug/ml, se not que
qued sustancia en la pipeta que no haba llegado a pasar a la fiola, dndose a conocer
as la importancia de tomar en cuenta la accin de capilaridad al momento de liberar la
sustancia de la pipeta a la fiola. Esto hizo que la concentracin no se exacta, afectando
sucesivamente a la dems diluciones posteriores, pues todas partieron de ella; sin
embargo, ya en los resultados finales si fue notorio esa disminucin de %T en relacin
con la disminucin de la concentracin, esto nos lleva a decir que no eran necesarias
concentraciones exactas sino podan ser aproximadas.

4. CONCLUSIONES
Existe una interaccin de la energa radiante y la materia a travs de los espectros de
absorcin.

5. CUESTIONARIO
1. Cul es la diferencia entre un fotocolormetro y un espectrofotmetro?
Son equipos utilizados en el Laboratorio para el anlisis de muestras, basndose
en el principio que cada compuesto qumico absorbe o emite energa lumnica de
diferente longitud de onda. Esta longitud puede estar en el espectro de luz visible,
o en otra parte del espectro electromagntico.

La diferencia fundamental entre un espectrofotmetro y un fotmetro o

fotocolormetro, consiste en que el fotocolormetro trabaja nicamente en el
espectro de luz visible y selecciona una longitud de onda determinada mediante
filtros fijos.
En cambio, un Espectrofotmetro es capaz de trabajar, no solo con la luz visible
sino que en otras regiones del espectro electromagntico (ultravioleta e
infrarroja). Adems posee un monocromador para seleccionar la longitud de onda
deseada.
2. Explique las diferencias entre los instrumentos de un solo haz y de doble haz?
Los espectrofotmetros pueden ser de 1 solo haz (nico) o de doble haz; en un
instrumento de un solo haz toda la luz incide en la muestra (1 sola longitud de
onda), este tipo de instrumentos fue el primer diseo de todos, todava est en
uso para la enseanza. Los laboratorios industriales, en cambio, usan el
instrumento de doble haz que divide toda esta luz en dos haces antes de llegar a
la muestra, ya que uno de los dos se utiliza como referencia, mientras que el otro
incide en la celda que contiene a la muestra.
3. Cul es el criterio para seleccionar el uso de un instrumento de un solo haz o de
doble haz?
Los instrumentos de un haz operan en el intervalo aproximado de 190 nm a 800
nm; as mismo tienen un rendimiento energtico mayor, superiores cocientes
seal /ruido, y compartimientos de muestra menos repletos. Pero no es
recomendable en el proceso de registrar las seales de salida del detector,
sucesivamente para las soluciones de referencia y muestra para los posteriores
clculos de absorbancia y transmitancia, ya que no ha sido hasta la fecha muy
satisfactorio debido a la deriva o al ruido de parpadeo de las fuentes y detectores.
Los instrumentos de doble haz operan aproximadamente en un intervalo de
longitud de onda de 195 nm a 850 nm, una anchura de banda de 4 nm, con una
exactitud fotomtrica de 0,5% de transmitancia. Dichos instrumentos son muy
adecuados para trabajos cuantitativos, en los que con frecuencia no se necesita
obtener un espectro completo.
4. Defina cada trmino:
Exactitud Fotomtrica: La exactitud fotomtrica es el grado de concordancia entre
la absorbancia real y la absorbancia medida. El error cometido al leer una
absorbancia respecto de una de referencia se denomina inexactitud
fotomtrica.
Ruido: Se refiere a las variaciones al azar en la seal de salida del aparato, debidas
no solo a las fluctuaciones elctricas, sino tambin a otras variables, como el modo
en que el operador lee la lectura, la posicin de la celda en el haz de luz, la

temperatura de la disolucin, y la seal de salida de la fuente. El ruido se asocia a

cada componente de un instrumento (la fuente, el transductor de entrada, a los
elementos que tratan la seal y transductor de salida.
Ancho de banda: Rango de longitud de onda que es capaz de transmitir el
monocromador. El ancho de banda espectral prctico es el ancho de banda de un
instrumento operado a un periodo de integracin y una relacin seal a ruido fija.
Sistema dispersor: Sistema monocromador de la radiacin. El sistema dispersor
est compuesto por: Rendija, Lente, Dispersor (prisma, red, filtro bien de
absorcin o de interferencias), lente, rendija.
5. Qu es el error absoluto de un espectrofotmetro? Cul es su valor numrico?
La exactitud se expresa en trminos de errores absolutos y relativos. El error
absoluto de la media x del anlisis de un pequeo conjunto de replicados se
expresa mediante la relacin:

Donde:
xt es el valor aceptado como verdadero de la cantidad medida. Es habitual
expresar la exactitud en trminos de error relativo:

La mayora de las veces el error se expresa en tanto por ciento, aunque no es raro
expresarlo en tanto por mil.
Es importante llamar la atencin acerca del hecho de que tanto el error relativo
como el absoluto llevan un signo positivo para indicar que el resultado medido es
mayor que el valor verdadero y un signo negativo para indicar que el valor medido
es inferior que el verdadero
6. Deduzca matemticamente la frmula A = 2 - log 10% (T) Cul es el rango de
valores de la
transmitancia y absorbancia?
T= I / I0

%T = 100T

A = - log10 (T)

Donde:

A = - log10(I / I0)
A = log 10 (I 0 / I)
A = log 10 (1 / T)
A = log 10 (100 /% T)
A = log10(100) log10(%T)

T: transmitancia

A = 2 - log10(%T)

A: absorbancia
I: intensidad de luz

Los valores de transmitancia pueden ir de 0 a 1, cero si no pasa nada de luz y uno si

pasa toda la luz.
La absorbancia toma valores entre 0 e infinito. Obsrvese que la absorbancia
aumenta conforme disminuye la transmitancia.

Los instrumentos miden transmitancia, es decir, comparan la intensidad de luz

incidente y emergente. Tienen un procesador integrado que convierte los valores en
absorbancia. En general, los instrumentos comunes tienen una escala de absorbancia
de 0 a 2.
7. Cmo se califica el buen estado de la fuente luminosa de un
espectrofotmetro?
Dependiendo del tipo de espectrofotometra, la fuente luminosa puede ser una
lmpara con filamento de tungsteno para luz visible, o una lmpara de arco de
deuterio para luz ultravioleta. Algunos fabricantes han diseado
espectrofotmetros con lmparas intermitentes de xenn de alta duracin que
emiten luz en el rango de la luz visible y ultravioleta. La lmpara o lmparas vienen
montadas de fbrica en una base que permite asegurar una determinada posicin,
para que se mantengan las condiciones de ajuste ptico y enfoque cuando est en
operacin o se requiere reemplazarla. La energa radiante tpica que emite una
lmpara de tungsteno est entre los 2 600 y los 3 000K.
Para el funcionamiento de un espectrofotmetro se requiere una fuente de
suministro elctrico de acuerdo con las normas y estndares implementados en el
pas. En los pases americanos se utilizan, por lo general, voltajes de 110 V y
frecuencias de 60 Hz.
8. Cmo se hace la limpieza de las cubetas de muestras luego de ser usadas con
una solucin coloreada y grasa?
Los cidos grasos de las huellas dactilares son absorbentes significativos en la regin
UV, y si se dejan sobre las superficies pticas, pueden provocar resultados errneos.
Limpiar bien todas las huellas y contaminantes antes de emplear una celda de
muestra. Utilizar slo paos para lentes de alta calidad (ref. 9300-0761) y nunca
secar el interior de una celda con los paos para lentes. Secar el interior de la celda
con aire a presin, sin grasas, lo que evita que la celda se contamine con partculas
del pao, o aclarar la celda con una disolucin del blanco o de la muestra. Las
partculas flotantes en la celda desvan el rayo de luz y as conducen a un espectro
medido de muy baja calidad.

6. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
1. D. Skoog. Anlisis instrumental 4ta ed. Madrid: McGRAW-HILL; 1993. Pg: 166167
2. D. Olsen. Mtodos pticos de anlisis.(Citado en: 22 de agosto del 2015)
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3. Equipos y laboratorios de colombia. Colormetro y espectofotmetro.
(Actualizado en: 12 de julio de 2015; Citado en: 22 de agosto del 2015)
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4. Duymovich C., Acheme R. Espectrofotmetros y Fotocolormetros-Gua prctica
de actualizacin. Programa de Control de Calidad Instrumental. Acta Bioqum
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https://www.ucursos.cl/usuario/2775c7595e300ed228a801eb8341e457/mi_blog/r/Espectrof
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6. Sheffield Hallam University. Beers Law (citado el 25 de agosto 2015) Disponible
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7. Daz, N., Brcena A., Fernndez, E., Galvn, A., Jorrn, J., Peinado, J., Melndez,
F., Tnez, I. Espectrofotometra: Espectros de absorcin y cuantificacin
colorimtrica de biomolculas (Citado el 25 de agosto 2015) Disponible en:
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8. Espectrofotometra de absorcin ultravioleta-visible (citado el 25 de agosto
2015) Disponible en: http://ocw.usal.es/ciencias-experimentales/analisisaplicado-a-la-ingenieria-quimica/contenidos/course_files/Tema_3.pdf
9. Snchez, F. Espectrofotmetro de luz visible de bajo coste. (citado el 25 de
agosto 2015) Disponible en:
http://kikosanchezsalazar.es/espectrofotometro.pdf