UNIVERSIDAD AUTNOMA DEL ESTADO DE

HIDALGO
ESCUELA SUPERIOR DE APAN
LICENCIATURA EN INGENIERA EN TECNOLOGA
DEL FRIO
MATERIA: MICROBIOLOGA
CATEDRTICO: VCTOR HUGO PREZ ESPAA
EQUIPO 1:
CASTILLO MARTNEZ CAROLINA
FLORES JIMNEZ JOS ALBERTO
LPEZ JIMNEZ ZAIRA MALLELY
ORTZ TREJO ADRIANA
PRCTICA 2: MTODOS DE CULTIVO Y
AISLAMIENTO DE BACTERIAS
31 DE AGOSTO, 2015
1

Introduccin
BACTERIAS
Las bacterias poseen una estructura relativamente simple. Son microorganismos
procariotas, es decir, unos microorganismos unicelulares sencillos, sin membrana
nuclear, mitocondrias, aparato de Golgi ni retculo endoplsmico que se reproducen por
divisin asexual. La pared celular que rodea a las bacterias es compleja, y existen dos
formas bsicas: una pared celular grampositiva con una gruesa capa de pptidoglucano
y una pared celular gramnegativa con una delgada capa de peptidoglucano, as como
una membrana externa. Algunas bacterias carecen de pared celular y compensan su
ausencia sobreviviendo tan slo en el interior de clulas del organismo anfitrin o en un
ambiente hipertnico.
Para realizar una clasificacin preliminar de
las bacterias se utiliza su tamao (de 1 a 20
m o ms), forma (esferas, bastoncillos,
espirales) y disposicin espacial (clulas
aisladas, en cadenas y formando cmulos);
mientras que su clasificacin definitiva se
refiere a sus propiedades fenotpicas y
genotpicas.

Figura 1.1 Distintos tipos de

bacterias.

TCNICAS Y MEDIOS DE CULTIVO

Al sembrar una muestra en un medio de cultivo, las bacterias existentes en la muestra
empiezan a multiplicarse. Como la mayora de las bacterias se duplican cada 20-30
minutos, entre las 18 y las 24 horas se habrn desarrollado abundantemente. Ello
permitir su deteccin aunque su nmero inicial en la muestra fuera muy bajo y, por
tanto, no hubieran podido ser observadas en el examen microscpico. Adems el
aislamiento de las bacterias por cultivo permite su posterior identificacin y el estudio de
su sensibilidad a los antimicrobianos.

Los medios de cultivo deben contener los elementos nutritivos necesarios para permitir
la multiplicacin de las bacterias. Inicialmente pueden clasificarse en dos grupos:
medios lquidos y slidos.
AISLAMIENTO DE BACTERIAS
Habitualmente en las mezclas existe ms de un tipo de bacterias, por lo cual debemos
utilizar medios slidos para aislar (separar) e individualizar cada una de las diversas
bacterias existentes en la mezcla. Por ello, la siembra se efecta con un asa sobre la
superficie del agar contenido en una caja Petri (existen diferentes tcnicas para
sembrar sobre caja Petri. Vase figura 1.2), posteriormente las placas se llevan a la
incubadora generalmente de 18 a 24 horas, cada bacteria depositada sobre el agar se
multiplica, dando lugar a colonias, cuyo tamao es de varios milmetros, por lo que son
visibles a simple vista.
Al observar las colonias en los medios de cultivo debe evaluarse su tamao, la textura,
el brillo de la superficie y el aspecto de sus bordes, para constatar si existe slo un tipo
de colonia.

Figura 1.2 Diferentes tcnicas de sembrado de bacterias (izquierda),

tcnica estriado cruzado (derecha).

Objetivos
Aislar bacterias por medio de diferentes tcnicas de sembrado en medios de cultivo
slido, conocer los medios de cultivo que se requieren para aislar diferentes especies
bacterianas.

Desarrollo

de

la

actividad

prctica
Primero se sacaron los medios de cultivo que se encontraban a 4C dentro del
refrigerador (Agar Nutritivo, Luria Broth y Agar Dextrosa y Papa), y se llevaron a la
estufa; la cual estaba previamente calentada a una temperatura de 28C, durante 20
minutos. Mientras tanto se encendi la campana de flujo laminar tambin por 20
minutos, para poder desinfectarla y realizar ah la siembra en los medios de cultivo.
Posteriormente, de una muestra de pulque obtenida en la comunidad de Crdenas,
Hidalgo, se tomaron diferentes cantidades y se realizaron diluciones de la misma.

Para la primera dilucin, se agregaron 1ml de pulque ms 9 ml de agua

destilada y se deposit en un vaso de precipitado, a la cual llamaremos muestra
10-1 y se homogeniza.

Para la segunda dilucin, se tom 1 ml de la muestra 10 -1 y se deposit en un

vaso de precipitado, a la cual se le agregaron 9 ml de agua destilada. A esta
dilucin la llamaremos 10-2 y se homogeniza.

Para la tercera dilucin, se tom 1 ml de la muestra 10 -2 y se deposit en un

vaso de precipitado, a la cual se le agregaron 9 ml de agua destilada. A esta
dilucin la llamaremos 10-3 y se homogeniza.

Una vez preparadas las diluciones del pulque, y obtenida una muestra de Escherichia
coli; se realizar la siembra.
Se sembr Escherichia coli en cuatro cajas Petri que contenan medio de cultivo Luria
Broth (LB) aplicando la tcnica de estra cruzada (indicada en el manual de prcticas de
microbiologa) y por estra simple en los tubos de ensayo del mismo agar.
Utilizando la misma tcnica se sembr el pulque en agar dextrosa y papa (PDA)
contenido en cuatro cajas Petri. Los tubos de ensayo que contenan el mismo medio
fueron sembrados utilizando tcnicas de inoculacin y estriado simple.
Posteriormente, se sembraron las diluciones del pulque en tres cajas Petri y tres tubos
de cultivo que contenan agar nutritivo (AN), cada cual para una dilucin diferente. Los

tubos fueron sembrados mediante estriado simple, para el sembrado en cajas Petri se
utiliz una tcnica distinta:
o

Se tomaron 50 l de la muestra y se colocaron en el centro de la placa,

utilizando una varilla de vidrio con forma de esptula (la cual se debe esterilizar
con alcohol, hacerla pasar por la flama del mechero, y dejarla enfriar en un
costado de la placa Petri) se fue expandiendo la muestra por toda la caja Petri
hasta que fuera absorbida completamente por el medio de cultivo.

Para finalizar se etiquetaron los tubos y las cajas Petri en las cuales se sembr, se
llevaron a la estufa de incubacin a una temperatura de 28C, y se esperaron de 24 a
48 hrs para reportar resultados.

Resultados
CEPA
Escherichi
a coli
Pulque
Dilucin
10-1
Dilucin
10-2
Dilucin
10-3

COLOR

FORMA

TAMAO

BORDE

CONSISTENCI
A

LUZ
TRANSMITIDA
.

Blanco

Irregular

2mm

Lobulado

Butirosa

Opaca

Blanco
Amarillo

Irregular
Circular

2mm
2mm

Hmeda
Butirosa

Opaca
Traslucida

Blanco

Circular

2 mm

Entero
Entero
Entero

Blanco

Circular

Blanco

Circular

1mm

1mm

Hmeda

Entero

Hmeda

Entero

Hmeda

Opaca
Opaca

Opaca

Al haber transcurrido 48 horas, se pudo observar que las cajas presentaban diferentes
Tabla 1.3 Caractersticas observadas en las cajas Petri
caractersticas como el color, la forma, el tamao, la consistencia, entre otros; lo cual
depende principalmente de la muestra y el medio en que se sembr (Vase tabla 1.3).
De la misma manera, la morfologa que se observ fue distinta en cada medio (vase
figura 1.4).

Figura 1.4 Morfologa observada en diferentes medios.

Conclusiones
En base a lo observado en la prctica realizada se lleg a la discusin que en los
medios de cultivo Luria Broth (LB) sembrado por estra cruzada con Escherichia coli, se
not un crecimiento adecuado y la formacin de colonias blancas, de forma irregular
que no permiten el paso de la luz, esto nos indica que el sembrado de la bacteria fue
correcto y el tiempo de incubacin el adecuado ya que lo observamos a las 48 hrs por
que se encontraba a 28C en la estufa y por lo general Escherichia coli debe ser
incubado a 37C por 24 hrs, para poder notar su buen crecimiento.
En el medio de cultivo agar dextrosa y papa (PDA) se not el crecimiento de hongos, se
obtuvieron colonias blancas con borde regular que no permiten el paso de luz, se puede
asegurar que son hongos, ya que en este medio el pH es bajo, lo cual inhibe el

crecimiento de bacterias que pudieron estar presentes en el pulque utilizado para

sembrar en este medio.
En el agar nutritivo (AN) se observ la presencia de 2 colonias con caractersticas muy
diferentes, lo cual era de esperarse por que este medio de cultivo no es muy selectivo,
crecen todos los microorganismos que estn presentes en la muestra. Se puede decir
que las colonias de color blanco, forma irregular y que no permiten el paso de la luz son
los hongos, esto se puede afirmar en base a los resultados obtenidos en el agar
dextrosa y papa (PDA); el otro tipo de colonia presente es de forma circular, color
amarillo y permite el paso de la luz lo cual podramos decir que es una bacteria con la
caracterstica de producir etanol.

Cuestionario
1. Qu es el agar y de donde se obtiene?
El agar, o agar -agar, es un polisacrido que se obtiene de algas del gnero Gelidium,
algas que se han utilizado en la cocina tradicional japonesa, por sus propiededes
gelificantes, desde hace muchos siglos. Tambin se obtiene de otras algas, entre ellas
especies de los gneros Gracillaria , de las que procede actualmente la mayora del
agar, y de Gelidiella y Pterocladia, que aportan pequeas cantidades. Cules son los
nutrientes que proporciona a los microorganismos? El agar se considera formado por la
mezcla de dos tipos de polisacridos, la agarosa y la agaropectina. La agarosa es el
componente principal, representando alrededor del 70% del total. Agarosa y
agaropectina

se

diferencian

en

la

presencia

de

restos

de

sulfato

piruvato,relativamente abundantes en la agaropectina y muy escasos (idealmente,

ausentes) en la agarosa. Los restos de sulfato aparecen sobre unidades de galactosa,
que entonces ocupan el lugar de una anhidrogalactosa en la secuencia alterna.
2. Cul es la composicin qumica de los medios EMB, 110 y MM?
EMB:este medio (tambin denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo
de bacilos Gram negativos de rpido desarrollo y escasas exigencias nutricionales.
Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae. En el
medio de cultivo, la peptona es la fuente nutritiva y la lactosa es el hidrato de carbono
fermentable. La combinacin utilizada de eosina y azul de metileno, inhibe el desarrollo
de microorganismos Gram positivos y de bacterias Gram negativas fastidiosas, y

tambin, permite diferenciar bacterias fermentadoras y no fermentadoras de lactosa. El

agar es el agente solidificante.
110: el Agar Estafilococos 110 es utilizado para el aislamiento y diferenciacin de
estafilococos en base a la fermentacin de manitol, la formacin de pigmento y la
hidrlisis de gelatina. En 1942 Koch report que los estafilococos crecan
selectivamente en medios con una concentracin alta de cloruro de sodio.
Posteriormente Chapman, Lieb y Curcio reportaron que las cepas tpicas de
estafilococos patgenos fermentan el manitol, producen pigmento y licuan la gelatina.
Chapman utiliz estas propiedades para desarrollar un medio selectivo y diferencial
llamado Agar Estafilococos 110. En este medio la peptona provee la fuente de carbono,
nitrgeno, vitaminas y minerales. El extracto de levadura proporciona vitaminas del
complejo B. La alta concentracin de cloruro de sodio tiene un efecto en el desarrollo
selectivo de los estafilicocos. La lacosa y el D- manitol proporcionan la fuente de
energa. La gelatina es el sustrato para la enzima gelatinasa. El agar es usado como
agente solidificante.
3. Por qu el agar nutritivo es un medio de uso general para el cultivo de
bacterias?
Medio de cultivo nutritivo no selectivo, en el cual la pluripeptona y el extracto de carne
constituyen la fuente de carbono, nitrgeno y aportan nutrientes para el desarrollo
bacteriano. El agregado de cloruro de sodio mantiene el balance osmtico y el agar es
el agente solidificante. Puede ser suplementado con sangre ovina desfibrinada estril
para favorecer el crecimiento de microorganismos exigentes en sus requerimientos
nutricionales y permite una clara visualizacin de las reacciones de hemlisis.
4. Proponga algunas sustancias que se le agregaran para hacerlo selectivo para
bacterias Gram negativas
La bilis inhibe el crecimiento de las bacterias Gram positivas. Mientras que la azida
sdica inhibe a las bacterias Gram negativas.
5. Cul es la informacin que se obtiene de las siembras de cultivos bacterianos
en tubos con agar inclinado y en tubos con agar solidificado en forma recta?
Los medios slidos se pueden tener en placas especiales, tipo plato, llamadas placas
de Petri, as como en tubos de cultivo, en posicin inclinada (agar slant), para siembra
de microorganismos en la superficie. Los tubos inclinados son muy buenos para
almacenar cultivos puros. Tubos similares, pero en los que el medio se solidifica en
posicin recta, se utilizan para siembra de microorganismos a lo interno del medio (agar

deep tube), para estudiar los requerimientos de gas de los microorganismos. Las placas
de Petri ofrecen una gran superficie de cultivo, lo cual permite un mejor aislamiento y
estudio de microorganismos. Como se muestra en la figura 1.5.

Figura 1.5 Tipos de medios de cultivo.

Referencias
Patrick R. Murray, Ken S. Rosenthal, Michael A. Pfaller (2009): Microbiologa
Mdica. Sexta edicin. Editorial ELSEVIER
Guillem Prats (2005): Microbiologa Clnica. Primera edicin. Editorial Mdica
Panamericana.
Britania Lab, Fichas tcnicas (2010).
http://www.britanialab.com/productos/231_hoja_tecnica_es.pdf
Miguel Calvo (1997): Bioqumica de los alimentos.
Ilustracin 1

http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/azucares/agar.html
Microbiologa clnica (2013).
http://asignatura.us.es/mbclinica/docs/recursos/12/medios-de-cultivo.pdf