UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE MEDELLN

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE QUMICA
LABORATORIO DE BIOQUMICA

PRCTICA No 7. OBSERVACIN DE EFECTOS RELACIONADOS CON LA FOTOSNTESIS.

OBJETIVOS

Familiarizarse con la metodologa para aislar cloroplastos.

Comprobar la formacin de poder reductor en la etapa lumnica de la fotosntesis.
Conceptualizar sobre este esencial evento para la vida en el planeta.
FUNDAMENTO TEORICO
INTRODUCCION.
La fotosntesis es el origen de la mayor parte de la energa de la biosfera y se encarga de la fijacin del CO2
y de la produccin de prcticamente la totalidad del O2 en la atmsfera, a la par que produce el alimento
que sostiene la vida en el planeta.
El proceso, que ocurre en los cloroplastos de las plantas y algas superiores, comprende dos fases
independientes: la fase lumnica que se realiza en la membrana de los tilacoides, y la fase oscura que
ocurre en los estromas del cloroplasto.
Como reaccin neta de la fotosntesis se acepta la siguiente:

6CO2

6H2O

C6H12O6

6O2

Pero los detalles del evento indican que los tomos del O2 provienen nicamente del H2O, y que los
oxgenos del CO2 se integran a la molcula de la glucosa y a otras molculas de agua. Por ello la reaccin
dada realmente es una simplificacin de esta otra:

6CO2

12H2O

C6H12O6

+ 6H2O

6O2

LOS CLOROPLASTOS.
Estos son los orgnulos de las plantas y las algas, que funcionan como los verdaderos laboratorios del
proceso fotosinttico. En las plantas, la mayora de ellas se encuentra en las clulas situadas bajo la
superficie de las hojas, llamadas clulas mesfilas, y cada una puede contener entre 20 y 50 cloroplastos.
La estructura interna de un cloroplasto tiene cierta similitud con la de una mitocondria:

 Una membrana externa muy permeable.

Una membrana interna con permeabilidad selectiva, que encierra el compartimiento interno, en el cual
se encuentra lo siguiente:

a. El estroma, o matriz gelatinosa que contiene la mayora de las enzimas responsable de la fase oscura
de la fotosntesis.
b. Los tilacoides, embebidos en el estroma, que son una red de membranas internas plegadas en forma
de sacos o discos planos, que cuando se apilan forman una estructura llamada grana. En las membranas
del tilacoide se hallan los componentes necesarios para desarrollar la fase lumnica de la fotosntesis.

FASE LUMINOSA DE LA FOTOSINTESIS.

Es la etapa donde la energa solar se convierte en energa qumica. Los pigmentos de los cloroplastos
atrapan la energa solar e inducen la oxidacin de la molcula de agua, con la produccin concomitante de
energa qumica en forma de NADPH y ATP:
NADP+

NADPH
Luz

H2O
ADP + Pi

O2
ATP

Para que ello se realice, es necesario que ocurran los siguientes eventos:

a. Absorcin de energa solar por los pigmentos (P680 y P700) y su excitacin para formar especies con gran
poder reductor y especies con gran poder oxidante:

Especies excitadas con poder reductor

Especies positivas con gran poder oxidante.

b. Transporte de los electrones impulsados por la energa solar, a travs de una cadena de sustancias
entre las que se incluyen protenas y quinonas:
h

ACARREADORES
DE
ELECTRONES

e-

P680

P700

e-

ACARREADORES
DE
ELECTRONES

c. Rompimiento de la molcula de H2O para generar O2 y electrones que se transportan por la cadena:
+

2H2O

4H

+ 4e

+ O2

d. Recepcin de los electrones por parte del NADP+ para generar NADPH:
+

2NADP

+ 4H

+ 4e

2NADPH + 2H

e. Formacin de ATP a expensas del gradiente electro-qumico de protones que se va creando a medida
que los electrones fluyen desde el H2O hasta el NADP+:

ADP

ATP + H2O

+ Pi

El esquema completo de la fase luminosa se puede visualizar as:

4h

4h
2NADP+ + 2H+

2H2O
4e-

O2 + 4H

P68 0

ACA RR.

P70 0

ACA RR.

4e-

2NADPH

Que resumidamente se puede escribir as:

+

2H2O + 2NADP

8h

O2 + 2NADPH + 2H

El esquema se completa con la formacin del ATP:

+

2H2O + 2NADP

2ADP + 2Pi

8h

O2 + 2NADPH + 2H
2ATP + 2H2O

FASE OSCURA DE LA FOTOSINTESIS

Llamada as porque no requiere energa luminosa para su funcionamiento; tambin se le conoce como el
ciclo reductor de las pentosas fosfato, la va C3, el ciclo de Calvin-Benson. En esta fase las plantas utilizan
la energa qumica captada (en forma de NADPH y ATP) para incorporar el CO2 atmosfrico en molculas
de carbohidratos (sacarosa, almidn, celulosa):
+

NADP

NADPH
CO2

CH2O

ATP

ADP + Pi

Esta fase es realmente la suma de 4 etapas:

a. Etapa de carboxilacin. El CO2 se incorpora a una molcula de 5 carbonos (pentosa) llamada ribulosa1,5-bifosfato, para generar dos molculas de 3-fosfoglicerato (triosa):

CH2OP
COO

C O
H

C OH

C OH

+ CO2

CH 2 OP

Ru-1,5-BP (pentosa)

CHOH
CH 2 OP

H 2O

3-p-glicerato (triosa)

b. Etapa de reduccin. El 3-fosfoglicerato con el concurso de los productos de la fase luminosa a (ATP y
NADH), se reduce a gliceraldehdo-3-fosfato, que es otra triosa:

NADPH
COO

NADP

CHO

CHOH

CH2OP

CH 2 OP

ATP
3-p-glicerato
(triosa)

CHOH

ADP + Pi
gliceraldehido-3-p
(triosa)

De las molculas de gliceraldehdo-3-fosfato generadas, 1/6 parte se usa para sintetizar carbohidratos y
5/6 partes para regenerar Ru-1,5-BP y volver a iniciar el ciclo.

c. Etapa de sntesis. Parte del gliceraldehdo formado (1/6) lo usa la planta para sintetizar los
carbohidratos que requiere: fructuosa, glucosa, sacarosa, almidn y celulosa:

sacarosa
CHO
2

CHOH

almidn

C6H12O6

CH2OP
griceraldehdo-3-p
(Triosa)

celulosa
hexosas

d. Etapa de regeneracin. EL resto del gliceraldehdo formado en la etapa de reduccin (5/6), se utiliza
para regenerar Ru-1,5-BP (pentosa), que es la molcula que inicialmente fija el CO2 atmosfrica:

CH2OP
CHO
5

CHOH
CH2OP

C O
3

H C OH
H C OH
CH2OP

gliceraldehdo-3-p
(Triosa)

Ru-1,5-BF
(Pentosa)

Esta etapa es la que garantiza que el proceso fotosinttico se repita muchas veces (le da el carcter de
cclico), y que la sntesis de carbohidratos sea realmente apreciable.
El carcter cclico de la fase oscura de la fotosntesis se puede observar cuando se hace el balance de
carbono en la formacin de una molcula de glucosa (hexosa):

6CO2
CICLO DE CALVIN

6 Pentosas

12 Triosas

10 Triosas

2 Triosas
1 Hexosa

sacarosa

almidn

La formacin de una molcula de glucosa (6C) requiere la incorporacin de 6CO2 (6C) a 6 molculas de
Ru-1,5-BP (6 x 5 = 30C), para generar 12 molculas de triosas (12 x 3 = 36C). Dos molculas de triosas
(2 x 3 = 6C) se emplean para formar una molcula de glucosa (6C). las 10 restantes (10 x 3 = 30C) se
reordenan entre s para generar 6 molculas de pentosas (6 x 5 = 30C), que son las que asimilan el CO2,
para que el ciclo vuelva a empezar.
Para obtener la reaccin neta de la fase oscura se tendr que saber que para incorporar una molcula de
CO2 en una unidad bsica de carbohidrato (CH2O), se deber consumir 2 molculas de NADHP y 3 de ATP:

CO2 + 2NADPH + 3ATP + 3H2O

CH2O + 2NADP

+ 3ADP + 3Pi

VISION INTEGRADA DE LA FOTOSINTESIS Y SU EFICIENCIA ENERGETICA.

NADP

NA DP

NA DPH

H2 O

NADPH

O2

CO2

CH2 O

AT P

AT P
A DP + Pi

A DP + Pi

FASE LUMINOSA
(Tilacoides)

FASE OSCURA
(Estroma)

Este esquema permite visualizar para la fotosntesis la siguiente ecuacin simplificada:

CO2 + H2O

8h

O2 + CH2O

Es decir, se requieren 8 moles de fotones de energa para fijar un mol de CO2. Para fijar 6 moles de CO2 en
un mol de glucosa, se usan 48 moles de fotones, que cuando la luz es de 650 nm, equivalen a una energa
de 8.842 kJ segn la siguiente ecuacin:

hc

La realidad es que la formacin de una mol de glucosa a partir de CO2 y H2O solo necesita 2870 kJ, lo que
significa que el proceso fotosinttico solo aprovecha el 33 % de la energa que absorbe. Otra forma de
mirar la situacin es que con la energa que absorben los cloroplastos (8.842 kJ) se podran sintetizar 3
moles de glucosa, pero solamente se produce una. De manera que la eficiencia seria del 33 %.

MATERIALES Y REACTIVOS

Un bombillo de 100 W, centrfuga, 500 gramos de hojas frescas de espinacas o acelgas, hielo picado,
licuadora, gasa, papel aluminio.

Solucin de preparacin de cloroplastos: preparar 100 mL de una solucin con los siguientes
componentes: Tris 20mM (pH = 7.8), KCl 40 mM, sacarosa 4 mM.

Solucin de lavado de cloroplastos: se preparan 100 mL de solucin con estos componentes: KCl 40
mM (pH = 7.8), sacarosa 4 mM, MgCl2 2 mM.

2,6-Diclorofenolindofenol (PM=326,09 g/mol) (DCFIF) 0.01%.

PROCEDIMIENTO.
1.

PREPARACION DE CLOROPLASTOS.

1.1 Licue a velocidad mxima y durante 15 segundos 50 gramos de hojas frescas de espinacas o acelgas
en 75 ml de la solucin de preparacin de cloroplastos.
1.2 Filtre el material licuado a travs de una gasa pre-enfriada. Recoja el filtrado en tubos de centrifuga
llenndolos hasta sus 2/3 partes (todos los tubos deben ser llenados al mismo nivel)
1.3 Centrifugue el material a 2500 rpm durante 10 minutos. Descarte el sobrenadante cuidadosamente y
conserve el precipitado.
1.4 Disponga en un beaker con 30 mL de la solucin de lavado, y resuspenda all suavemente el precipitado
obtenido de todos los tubos. Centrifugue nuevamente a 2500 rpm durante 5 minutos.
1.5 Descarte el sobrenadante y conserve el precipitado. Repita el lavado del precipitado dos veces ms
(del numeral 1.4).
1.6 Resuspenda el precipitado en 40 mL de la solucin de lavado, tape con papel aluminio, marque como
Solucin de cloroplastos y conserve en un bao con hielo.

2.

CURVA DE CALIBRACION Y MEDICION DE DCFIF OXIDADO

2.1 Marque 6 tubos de ensayo como se indica en la siguiente tabla, cbralos con papel aluminio y agregue
lo indicado, tenga en cuenta que una gota equivale a 0.05 ml:

Blanco

Papel
aluminio
Si

Solucin
cloroplastos
1 ml

Si

1 ml

1 (0.05 ml)

2
3
4
5

Si
Si
Si
Si

1 ml
1 ml
1 ml
1 ml

3 (0.15 ml)
5 (0.25 ml)
7 (0.35 ml)
9 (0.45 ml)

Tubo

DCFIF(gotas)
0

Solucin
de
preparacin
4 ml
3ml+19 gotas
(3.95ml)
3ml+17 gotas (3.85ml)
3ml+15 gotas (3.75ml)
3ml+13 gotas (3.65ml)
3ml+11 gotas (3.55ml)

DCFIF(%)
inicial
0

Ai

Af

0.0003
0.0005
0.0007
0.0009
0.0011

2.2 Ajuste el colormetro a 610 nm y coloque a cero con la solucin de cloroplastos del tubo blanco y
realice las lecturas de absorbancia iniciales (Ai) de los 5 tubos restantes.
2.3 Quite el papel aluminio de los 5 tubos y expngalos durante 25 minutos, a la radiacin emitida por un
bombillo de 60 Watts. Fjese que los tubos queden a la misma distancia del bombillo.
2.4 Ajuste el colormetro nuevamente a 610 nm y coloque a cero con la solucin de cloroplastos del tubo
blanco y realice las lecturas de absorbancia finales (Af) de los 5 tubos y registre los datos en la tabla.
3.

COMPROBACION DEL PODER REDUCTOR GENERADO POR LA LUZ.

3.1 Marque 4 tubos de ensayo con los nmeros 1, 2, 3 y 4. Envuelva los tubos 3 y 4 con papel de aluminio,
y agregue lo indicado en la siguiente tabla:

Tubo

Papel
aluminio

Solucin
cloroplastos

1
2
3
4

No
No
Si
Si

1 ml
1 ml
1 ml
1ml

Solucin de preparacin
4 ml
3ml + 16gotas (3.8 ml)
3ml + 16gotas (3.8 ml)
4 ml

DCFIF

4 gotas (0.2ml)
4 gotas (0.2ml

Ai

Af

2.5 Ajuste el colormetro a 610 nm y coloque a cero con la solucin de cloroplastos del tubo blanco del
punto 2.1 y realice las lecturas de absorbancias iniciales (Ai) de todos los tubos (1 a 4).
3.2 Exponga los 4 tubos durante 25 minutos a la radiacin emitida por un bombillo de 60 Watts. Fjese
que todos los tubos queden a la misma distancia del bombillo, los tubos 1 y 2 sin papel aluminio y los
tubos 3 y 4 con papel aluminio.
3.3 Ajuste el colormetro a 610 nm y coloque a cero con la solucin de cloroplastos del blanco del punto
2.1 y realice las lecturas de las absorbancias finales (Af) para las soluciones de cloroplastos de todos
los tubos (1 al 4).
3.4 Observe y compare los colores de los 4 tubos al inicio y al final. Anote los resultados de la intensidad
de coloracin azul en una escala de 1 a 10 (10 si la coloracin es azul oscuro y 0 si la coloracin es
verde).
ESULTADOS Y PREGUNTAS
SOBRE EL PODER REDUCTOR GENERADO POR LA LUZ

1. Teniendo en cuenta los experimentos de la tabla 3.1 y Considerando que el DCFIF es un colorante que
cuando est oxidado es azul y cuando est reducido es incoloro que se indica en la siguiente reaccin:
O
Cl

Cl

2H

Cl

NH

N
Azul
OH

OH
Cl

.
2H

Incoloro
OH

Explique a que se debe la diferencia de absorbancias Ai y Af de los tubos 1, 2, 3 y 4.

Escriba la reaccin qumica que ocurrieron en los tubos 1, 2, 3 y 4.
Explique en cuales tubos se gener energa qumica (ATP y NADPH) a expensas de la energa lumnica.
Diga en cuales tubos los cloroplastos fijaron CO2 para iniciar la fase oscura de la fotosntesis.
2. Haga un anlisis con base en la visin integral de las dos fases de la fotosntesis; fase lumnica y fase
oscura que pudieron ocurrir en los tubos de ensayo.
3. Explique en qu consiste la reaccin de Hill e investigue qu herbicidas inhiben la fotosntesis mediante
la inhibicin de la reaccin de Hill.

SOBRE LA CUANTIFICACIN DE DCFIF OXIDADO

4. Explique para la tabla 2.1, porque los resultados de Ai y Af son diferentes si fueron medidos en las
mismas soluciones, solo que Af se midi despus de 25 minutos.
5. Considerando los datos de la tabla del punto 2.1, realice una grfica Ai vs DCFIF (%) inicial y obtenga la
pendiente de la regresin con su respectiva ecuacin.
6. Con la ecuacin obtenida cuantifique el % de DCFIF para los tubos (1 al 5) despus de que fueron
irradiados durante 25 minutos empleando la absorbancia final (Af) y de una explicacin de los
resultados.

BIBLIOGRAFIA
Prctica bioenergtica (fotosntesis). Dpto. de Biologa. U de A. (Gua
BOYER, R Conceptos de Bioqumica. Thomson Editores. Mxico. 2000
BOHINSKI, R. Bioqumica. Prentice Hall. Mxico. 1998
MATHEWS, C. y otros. Bioqumica. Addison Wesley. Madrid 2002

suelta).

Documento recopilado y organizado por profesores y monitores de la Escuela de Qumica