Professional Documents
Culture Documents
La Paz Bolivia
27 de abril del 2015
Introduccin
El objetivo de controlar el crecimiento microbiano es
reducir la carga microbiana o el nmero de
microorganismos viables presentes en un material,
alimento o en una solucin.
Introduccin
Esterilizacin: Eliminacin
microorganismos.
muerte
de
todos
los
Introduccin
Criterio de muerte de un microorganismo: Prdida
irreversible de la capacidad de reproduccin en un medio
adecuado. Tambin implica destruccin de la clula
Proliferacin: Desarrollo y crecimiento con incremento
del tamao poblacional del microorganismo
Supervivencia: No hay muerte ni proliferacin,
permaneciendo los microorganismos inactivos o inhibidos.
Introduccin
Sobrevivientes por
unidad de volumen
Logaritmo de los
sobrevivientes por
unidad de volumen
100%
Tiempo (horas)
Introduccin
Factores que afectan el control de los microorganismos
El nmero de microorganismos
El tiempo de exposicin.
La concentracin del agente de control
Condiciones ambientales locales
El tipo de microorganismos
La temperatura
El estado fsico de el microorganismo
Introduccin
El nmero de microorganismos
A mayor nmero de microorganismos o resistencia de la
poblacin se necesitar mayor tiempo de esterilizacin.
Para determinar el nmero de sobrevivientes es
necesario conocer el tamao inicial de la poblacin.
Para establecer los procedimientos de control hay que
considerar dos factores: la tasa de mortalidad y el
tamao de la poblacin inicial
Introduccin
Tiempo de reduccin
decimal (D)
Es el tiempo necesario
para
reducir
la
densidad
de
una
poblacin al 10% del
original a una T
determinada
Introduccin
Caso terico de desinfeccin
Tiempo Supervivientes
Muertes por
unidad de tiempo
Total
muertes
Porcentaje
total de
muertes
1.
1.000.000
2.
100.000
900.000
900.000
90,0000%
3.
10.000
90.000
990.000
99,0000%
4.
1000
9.000
999.000
99,9000%
5.
100
900
999.900
99,9900%
6.
10
90
999.990
99,9990%
7.
999.999
99,9999%
Introduccin
valor-Z (Z)
El valor-Z es el cambio
de temperatura que se
requiere para modificar
el valor D por un factor
de 10.
Introduccin
Introduccin
Efecto de la concentracin del agente de control
Efecto de diferentes concentraciones de fenol sobre una
poblacin de E. coli
Tiempo (minutos)
Introduccin
Condiciones Ambientales
El calor es ms eficaz en un medio cido que en uno
alcalino.
La consistencia del material, acuoso o viscoso, influye
marcadamente en la penetracin del agente.
Las concentraciones altas de carbohidratos aumentan,
por lo general, la resistencia trmica de los organismos.
Introduccin
Condiciones Ambientales
La presencia de materia orgnica extraa reduce la
eficacia de los agentes antimicrobianos :
No permite que el agente llegue al microorganismos
Se combina con el desinfectante y lo precipita
Se combina con el desinfectante y lo inactiva dejando libres
concentraciones tan bajas que no logran el efecto deseado sobre la
poblacin microbiana
Introduccin
La naturaleza del microorganismo
Desinfeccin por UV
Introduccin
La temperatura
La muerte de microorganismos como consecuencia de
un tratamiento a altas temperaturas sigue una cintica
exponencial.
N ufc
dN
dt
tiempo
= - KN
Introduccin
La temperatura
=
D =K
( )
( )
=
( )
Introduccin
La temperatura
Problema
Determinar el valor del tiempo de reduccin decimal a 116
C (D116) de un microorganismo a partir de los siguientes
datos de supervivencia al tratamiento
Duracin del tratamiento
(min)
Nmero de viables
(UFC/ml)
340.0
10
65.0
15
19.0
20
4.5
25
1.3
Introduccin
La temperatura
Problema
Se ha determinado que para esporas de Clostridium
botulinum suspendidas en buffer fosfato el D121 = 0.204
min, Cunto tiempo llevara reducir una poblacin de
1012 esporas de C. botulinum en buffer fosfato a 1 espora
a 121C?
t f 2,448 min
Introduccin
La temperatura
Problema
Para un microorganismo determinado el valor D104.4 es
113.0 min. y D121.1 es 2.3 min. Calcular el valor z.
Z 9,9o C
Introduccin
Agentes antibacterianos esterilizantes y/o desinfectantes
Agentes fsicos
Agentes fsicos
Calor:
Los microorganismos son susceptibles en distinto
grado a la accin del calor.
Provoca desnaturalizacin de protenas, fusin y
desorganizacin de membranas y procesos
oxidativos.
La efectividad del calor como mtodo de
esterilizacin depende de:
Temperatura
Tiempo de exposicin
Agentes fsicos
Calor Hmedo
El calor hmedo produce desnaturalizacin y
coagulacin de protenas. Estos efectos se debe
principalmente a dos razones:
El efecto del agua a altas temperaturas, ya que
produce reacciones de hidrlisis y desestabilizacin de
puentes de hidrgeno.
El vapor de agua posee un coeficiente de
transferencia de calor mucho ms elevado que el aire.
Agentes fsicos
El autoclave es el equipo
ms utilizado en los
laboratorios
para
esterilizar cultivos y
soluciones y que no se
desnaturalicen
a
temperaturas mayores a
100C.
Agentes fsicos
Los autoclaves de laboratorio :
El tiempo de exposicin depende del volumen del
lquido, de tal manera que para volmenes
pequeos (hasta unos 3 litros) se utilizan 20
minutos a 120 C; si los volmenes son mayores
debe alargarse el tiempo de tratamiento.
Usualmente 15 minutos a 121C
Agentes fsicos
Los autoclaves de laboratorio :
Condiciones :
Agentes fsicos
Pasteurizacin
LHT (low temperature holding)
30 minutos a 62.8C
HTST (high temperature short time)
15 segundos a 71.6C
UHT (ultra high temperature)
2 a 4 segundos a una temperatura que oscila entre 130 y
150C, seguido de un rpido enfriamiento, no superior a 32 C
Agentes fsicos
Pasteurizacin
Solo destruye patgenos (Coxiella
burnetti, Mycobacterium tuberculosis, etc.)
y reduce flora de deterioro.
NO ES UN PROCESO DE ESTERILIZACIN
Usos: leche, lcteos, jugos de fruta.
Agentes fsicos
Tindalizacin
100 C 30 min, 3 das sucesivos
Proceso discontinuo con perodos de incubacin intercalados
Usos: Esterilizacin de productos de baja resistencia trmica,
cuando no existe otra opcin.
Agentes fsicos
Ventajas
Rpido calentamiento y penetracin.
Destruccin de bacterias y esporas en corto tiempo.
No deja residuos txicos.
Hay un bajo deterioro del material expuesto.
Econmico.
Desventajas
No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones
con el agua.
Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metlicos.
Agentes fsicos
Calor Seco
El calor seco produce desecacin de la clula,
efectos txicos por niveles elevados de
electrolitos, procesos oxidativos y fusin de
membranas.
La accin destructiva del calor sobre protenas y
lpidos requiere mayor temperatura cuando el
material est seco o la actividad de agua del medio
es baja.
Agentes fsicos
Calor Seco
Indicadores:
Agentes fsicos
Agentes fsicos
Agentes fsicos
Ventajas
No es corrosivo para metales e instrumentos.
Permite la esterilizacin de sustancias en polvo y no
acuosas, y de sustancias viscosas no voltiles.
Desventajas
Requiere mayor tiempo de esterilizacin, respecto al
calor hmedo, debido a la baja penetracin del
calor.
Agentes fsicos
Radiaciones
Baja energa
Actividad
antimicrobiana
Alta energa
Agentes fsicos
Radiaciones LUV
La radiacin ultravioleta ha sido utilizada por su actividad
germicida esterilizante por ms de 30 aos.
La accin de los rayos ultravioleta se debe a la produccin
de ozono que logra la asepsia, ya que este gas conserva su
accin inhibidora hasta una dilucin de 1 x 40.000.
Agentes fsicos
Radiaciones LUV
Los
aminocidos
aromticos de las
protenas y las bases
puricas y primidinicas,
en particular la timina
del DNA, son los
principales compuesto
blancos afectados por
la accin bactericida de
la accin ultravioleta.
Agentes fsicos
Agentes fsicos
Radiaciones Ionizantes
Caractersticas:
Alta energa, baja longitud de onda
Gran poder de penetracin
Ionizan tomos y molculas
No requieren altas temperaturas
Tipos:
Rayos gamma (60Co o 137Cs)
Rayos catdicos (electrones acelerados)
Agentes fsicos
Radiaciones Ionizantes
Desventajas: Equipo especial, personal entrenado
No todos los materiales resisten el tratamiento
Reacciones no deseadas en alimentos
Agentes qumicos
Antispticos
Alcoholes
Iodo
Peroxido de hidrogeno
rgano-Mercuriales
Colorantes
Bifenoles
Diamidinas
Anilinas
Compuestos de Aminas Cuaternaria
Halofenoles
Agentes qumicos
Alcoholes
Lesionan la membrana celular de los microorganismos
y desnaturalizan protenas. Desorganizan la estructura
fosfolipdica de la membrana.
No destruyen esporas y tienen una accin germicida
lenta.
Los alcoholes de cadena corta tienen un efecto nocivo
mayor que los de cadena larga. Se utilizan en
concentraciones del 50 al 70%.
Los ms utilizados son el etanol e isoproplico.
McDonnell y Russell. (1999) Antiseptics and Disinfectants: Activity, Action, and Resistance. Clin. Microbiol. 12(1):147.
Agentes qumicos
Iodo
Es un agente oxidante que modifica grupos funcionales de
protenas y cidos nucleicos.
Inactiva protenas y enzimas por oxidacin de los grupos SH a S-S.
Se utiliza como desinfectante de la piel (tintura de iodo:
yodo molecular 2% y yoduro de sodio 2% en alcohol), es
irritante.
Es efectivo contra esporas en una concentracin de 1600
ppm de iodo libre.
A 0,25% presenta un valor D = 6,7 min para Bacillus subtilis y
D = 4,0 min para Staphylococcus aureus.
Amer, Mady, Yusef y Sabry. (2013) Determination of decimal reduction time (D-value) of chemical agents used in
hospitals for killing airborne isolated bacteria. Afr. J. Microbiol. Res. 7(26):3321.
Agentes qumicos
Perxido de Hidrgeno
Es un antisptico dbil, con capacidad oxidante y
formadora de radicales libres.
El perxido de hidrgeno gaseoso se utiliza como
desinfectante de superficies o decontaminante de
gabinetes biolgicos debido a que no posee las
propiedades txicas y cancerigenas del xido de etileno y
formaldehdo.
A 1,5% y pH=3,3 presenta un valor D = 55,2 min para Bacillus
subtilis y D = 3,4 min para Staphylococcus aureus.
Mazzola, Vessoni y S. Martins. (2003) Determination of decimal reduction time (D-value) of chemical agents used in
hospitals for disinfection purposes. BMC Infectious Diseases. 3(24):10.
Agentes qumicos
rgano-Mercuriales
Estos tipos de compuestos se combinan con los
grupos -SH de las protenas, inactivando enzimas.
Dentro de los mercuriales orgnicos se encuentran el
metafen y el mertiolate.
McDonnell y Russell. (1999) Antiseptics and Disinfectants: Activity, Action, and Resistance. Clin. Microbiol. 12(1):147.
Agentes qumicos
Colorantes
Los derivados del trifenilmetano bloquean la
conversin del cido UDP-acetilmurmico en UDPacetilmuramil-pptido.
Violeta de Genciana
McDonnell y Russell. (1999) Antiseptics and Disinfectants: Activity, Action, and Resistance. Clin. Microbiol. 12(1):147.
Agentes qumicos
Bifenoles
Los derivados de compuestos derivados de dos
fenoles unidos por diferentes puentes.
Aparentemente actuan a nivel de la membrana celular,
se vio que el triclosan desestabiliza la membrana
celular y el hexaclorofeno inhibe la cadena de
transporte de electrones
Triclosan
Hexaclorofeno
Agentes qumicos
Diamidinas
Son compuestos que vienen en forma de Isetionato,
su mecanismo de accin esta relacionado con el
ingreso de oxigeno en la bacteria pero no esta
descrito del todo.
Clnicamente son empleados en el tratamiento tpico
de heridas superficiales.
Dibromo propamidina
McDonnell y Russell. (1999) Antiseptics and Disinfectants: Activity, Action, and Resistance. Clin. Microbiol. 12(1):147.
Agentes qumicos
Anilidas
Son compuestos que destruyen el carcter
semipermeable de las membranas, generalmente se
usan en Javoncillos y desodorantes.
El compuesto mas empleado es el Triclocarban (3, 4, 4
Triclorocarbanilida) o TCC
Triclocarban
McDonnell y Russell. (1999) Antiseptics and Disinfectants: Activity, Action, and Resistance. Clin. Microbiol. 12(1):147.
Agentes qumicos
Compuestos de Aminas Cuaternaria
Son detergentes que producen dao a nivel de la
membrana celular de las bacterias.
Entre los ms empleados se encuentra el CTAB,
cetrimida y sales de Benzalkonium.
Cetrimida CTAB
Cloruro de Benzalkonium
McDonnell y Russell. (1999) Antiseptics and Disinfectants: Activity, Action, and Resistance. Clin. Microbiol. 12(1):147.
Agentes qumicos
Desinfectantes y/o Esterilizantes
Cloro y Compuestos clorados
Aldehdos
Oxido de Etileno
Compuestos Fenlicos
Biguanidinas
Agentes qumicos
Cloro y sus derivados
El cloro, los hipocloritos y las cloraminas son
desinfectantes que actan sobre protenas y cidos
nucleicos de los microorganismos.
Oxidan grupos -SH, y atacan grupos aminos, indoles y
al hidroxifenol de la tirosina.
El producto clorado ms utilizado es el hipoclorito de
sodio (lavandina), su actividad bactericida se debe al
cido hipocloroso (HClO) y el Cl2 que se forman
cuando el hipoclorito es diluido en agua.
McDonnell y Russell. (1999) Antiseptics and Disinfectants: Activity, Action, and Resistance. Clin. Microbiol. 12(1):147.
Agentes qumicos
Cloro y sus derivados
El hipoclorito de sodio se comercializa en soluciones
concentradas (50-100 g/l de Cloro activo) y Generalmente,
se utilizan soluciones con una concentracin del 0.1-0.5% de
Cloro activo.
Su actividad est influida por la presencia de materia
orgnica.
A 0,025% presenta un valor D = 20,6 min para Bacillus
subtilis y D = 4,7 min para Staphylococcus aureus
Mazzola, Vessoni y S. Martins. (2003) Determination of decimal reduction time (D-value) of chemical agents used in
hospitals for disinfection purposes. BMC Infectious Diseases. 3(24):10.
Agentes qumicos
Aldehdos
Agentes alquilantes que actan sobre protenas,
produce modificacin irreversible de enzimas e
inhibicin de la actividad enzimtica.
Se utilizan como desinfectantes y esterilizantes.
Destruyen esporas.
Glutaraldehido
Paraformaldehido
Formaldehido
Agentes qumicos
Aldehdos
El glutaraldehdo es el nico esterilizante efectivo
en fro.
El formaldehdo como gas se utiliza para
descontaminar edificios, ambientes, etc.
El formaldehdo gaseoso se obtiene por
calentamiento del paraformaldehdo, tiene la
desventaja de ser muy irritante, ser cancerigeno y
perder actividad en ambientes refrigerados.
Agentes qumicos
Oxido de Etileno
Agente alquilante se une a compuestos con
hidrgenos lbiles como grupos carboxilos, amino,
sulfhidrilos, hidroxilos, etc.
Utilizado en la esterilizacin gaseosa, generalmente en
industria farmacutica. Sirve para esterilizar material
termosensibles. Es muy peligroso
Agentes qumicos
Compuestos Fenlicos
Son desinfectantes que provocan lesiones en la
membrana citoplasmtica porque desordenan la
disposicin de las protenas y fosfolpidos.
El fenol no es usado a menudo como desinfectante
por ser muy irritante, por ser cancergeno y por el
resido que queda luego de tratar las superficies.
Agentes qumicos
Compuestos Fenlicos
Los derivados del fenol ms utilizados son el
hexaclorofeno y los cresoles.
Son efectivos a bajas concentraciones contra formas
vegetativas de bacterias.
No son efectivos contra esporas.
Agentes qumicos
Biguanidinas
Son compuestos que a bajas concentraciones afectan
la integridad de la membrana, y que a altas
concentraciones producen congelamiento del
citoplasma.
Entre los mas usados estn: Clorhexidina, Alexidina.
Clorhexidina
Agentes qumicos
Espectro de Actividad
Compuesto
Qumico
Amonio
cuaternario
Bacteria
Gram +
Gram -
Esporas
Hongos y
Levaduras
+++
+/-
+/-
+/-
Aldehdos
+/-
++
++
++
++
Cloro
+++
+++
++
Iodo
Tenso activos
+++
+
+++
+
++
-
++
+
+
-
Alcoholes
Mercuriales
+/-
+++
+/-
+/-
++
+/-
Fenoles
Virus
McDonnell y Russell. (1999) Antiseptics and Disinfectants: Activity, Action, and Resistance. Clin. Microbiol. 12(1):147.
McDonnell y Russell. (1999) Antiseptics and Disinfectants: Activity, Action, and Resistance. Clin. Microbiol. 12(1):147.
McDonnell y Russell. (1999) Antiseptics and Disinfectants: Activity, Action, and Resistance. Clin. Microbiol. 12(1):147.
McDonnell y Russell. (1999) Antiseptics and Disinfectants: Activity, Action, and Resistance. Clin. Microbiol. 12(1):147.
Agentes qumicos
EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
DE LOS DESINFECTANTES Y ANTISEPTICOS
Existen varios mtodos para determinar la actividad
antimicrobiana de los compuestos.
Tcnica de dilucin en tubo.
Tcnica de la placa de agar.
Agentes qumicos
Tcnica de dilucin en tubo
Primero se realizan diferentes diluciones del agente
qumico.
El mismo volumen de cada dilucin se dispensa en
tubos estriles.
A cada tubo se le aade la misma cantidad de una
suspensin del microorganismo utilizado como prueba
(0.5 de la escala de Mac Farland).
Estos tubos inoculados se incuban a la temperatura
ptima de crecimiento del microorganismo utilizado
como prueba durante 24 a 48 horas.
Agentes qumicos
Tcnica de dilucin en tubo
Al cabo del tiempo se examina el crecimiento por
presencia o ausencia de turbidez en el tubo
Crecimiento (+) turbidez
No crecimiento (-) ausencia de turbidez.
Agentes qumicos
Tcnica de la placa de agar
Se inocula una placa que contenga medio de
cultivo slido con el microorganismo utilizado
como prueba.
El agente qumico se coloca en el centro de la
placa, en un cilindro o impregnado en un disco de
papel.
Estas cajas se incuban a la temperatura ptima de
crecimiento del microorganismo utilizado como
prueba durante 24 a 48 horas.
Agentes qumicos
Tcnica de la placa de agar
Al cabo del tiempo se examina el crecimiento y se
mide el halo de inhibicin del crecimiento.
Sensible con halo de inhibicin alto.
Resistente con halo de inhibicin pequeo.
Agentes qumicos
Tcnica de la placa de agar
Agentes qumicos
Cepas control
Los controles biolgicos mas empleados son cepas de
la coleccin americana (ATCC)
Staphylococcus aureus ATCC 6538
Bacillus subtilis ATCC 6633
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
Entrada
de aire
Protege la
muestra, el
operador y el
medio ambiente
A
B
C
D
En descanso
>=0.5m
>=5.0m
350
0
3500
0
350000
2000
3500000
20000
En operacin
>=0.5m
>=5.0m
3500
0
350000
2000
3500000
20000
No definido
No definido
OMS. (2002) Clasificacin del Aire en la Unin Europea, gua para Buenas Prcticas de Fabricacin.
1
2
3
4
5
6
7
8
Cambios de Aire
por Hora
Riguroso
70 - 130
>750
Riguroso
70 - 130
>750
Riguroso
70 - 130
>750
Riguroso
70 - 110
500 - 600
Riguroso
70 - 90
150 - 400
Intermedio
25 - 40
60 - 100
Intermedio
10 - 15
25 - 40
3-5
10 - 15
Controles
Menos riguroso
OMS. (2002) Clasificacin del Aire en la Unin Europea, gua para Buenas Prcticas de Fabricacin.
Preguntas??