You are on page 1of 4

1.1.2.1.

Microscopia electrnica de transmisin


Introduccin.
El microscopio electrnico no es mas que uno de los muchos aparatos cuyo fundamento es la ptica electrnica. El
nombre que resulta justificado por la estrecha analoga existente entre su formulacin terica y la de la ptica clsica. No
hay posibilidad de estudiar la ptica electrnica sin enfrentarse con una de las consecuencias aparentemente
paradjicas de la fsica terica moderna: la dualidad onda-corpsculo, cuando los electrones inciden como paquetes de
ondas sobre los tomos de una muestra, las colisiones pueden representarse, y a veces con gran precisin como
colisiones del tipo bola de billar. Sin embargo, Si la muestra contiene un cristal en una cierta orientacin, los electrones
debern
representarse
por
ondas
para
dar
cuenta
de
las
reflexiones.
La prueba crucial para demostrar la existencia de las propiedades ondulatorias de los electrones fue la observacin de
la difraccin y de la interferencia de las ondas de los electrones.
Al final del siglo se haban reunido muchos datos sobre la emisin de la luz por los tomos de un gas al ser excitados por
una descarga elctrica. Observada a traves de un espectroscopio con una abertura en forma de rendija estrecha. Las
bandas formadas obedecen a las diferentes longitudes de onda que conforman el espectro luminoso. En similar forma y
utilizando el espaciado conocido de los tomos de un cristal se calculo la longitud de onda que poda producir dicho
mximo y se encontr la correspondencia con la energa de los electrones que eran utilizados. El electrn haba
adquirido
un
comportamiento
ondulatorio.
Este comportamiento de onda puede ser tratada en igual forma que el tratamiento hecho sobre la luz por medio de una
lente de vidrio. En contra posicin, el vidrio no actuara de igual forma sobre la onda de electrones, era necesario utilizar
otro
tipo
de
lente
(las
magnticas).
Los electrones procedentes de un filamento caliente se ven acelerados por una gran diferencia de tensin en el tubo. El
haz de electrones se hace paralelo mediante lentes de enfoque magntico. los electrones inciden sobre un blanco muy
delgado y luego se enfocan mediante una segunda lente magntica que es equivalente a la lente objetivo de un
microscopio ordinario. La tercera lente magntica juega el papel del ocular de un microscopio. Proyecta el haz de
electrones sobre una pantalla fluorescente donde se realiza la observacin de la imag2. Contextualizacin y
funcionamiento
del
microscopio
electrnico
de
transmisin.
En el campo de la ciencia fsica moderna es primordial entender el comportamiento tanto del haz de luz como el de
electrones, todas las aplicaciones pticas en cuanto a capturas y ampliacin de imgenes que usan este principio
prestan gran utilidad para el desarrollo de las ciencias que incursionan en el microcosmos.. Son diversas las tcnicas
que cumplen con estos propsitos, entre ellas, son dignas de ser citadas las siguientes:
2.1 Microscopia Confocal y de fluorescencia: propia para la observacin de imgenes topogrficas con carcter
tridimensional
de
sus
estructuras
en
diferentes
tipos
de
muestras.
2.2 Microscopia electrnica de Barrido y micro anlisis de rayos X: Explora las superficies de las muestras realizando un
paneo sobre la misma y capturando la radiacin reflejada la cual se codifica en datos computacionales con la idea de
reconstruir
la
imagen
del
espcimen.
2.3 Microscopia electrnica de Fuerza Atmica: Una aguja de punta muy fina casi a nivel atmico explora la superficie de
la muestra generando entre ambas un campo electro-magntico. El campo sufre variaciones correspondientes a las
variaciones de rugosidad de la superficie muestreada. Las variaciones electromagnticas ocasionadas generan una
informacin de corriente elctrica que debidamente tratada reconstruye la imagen de la superficie observada.
2.4 Microscopia electrnica de Efecto Tunel: Conserva el mismo principio que el microscopio de fuerza atmica salvo
que
la
intensidad
del
campo
es
mayor
y
realiza
exploraciones
bajo
la
superficie.
2.5 Microscopia electrnica de transmisin: A diferencia de los anteriores microscopios, este no explora superficies ,
por el contrario el haz de electrones incidente atraviesa la muestra o espcimen observado y la sombra de detalles finos
o ultra-estructura es capturada en una pantalla fosforescente con propiedades de emisin de luz, ubicada en la parte
inferior de la columna. El tener una adecuada preparacin de la muestra da lugar a una excelente definicin de imagen.
Son mltiples las facetas el las que interviene este tipo de microscopio. As, en control de calidad sealamientos
morfolgicos, conformacin de agregados, tcnicas forenses, determinacin de estratos en restauracin y diferenciacin
histolgica entre o

tros.
En la construccin de microscopios electrnicos (1), se han usado con
resultados satisfactorios ambos tipos de lentes: electrostticas y magnticas.
Con todo, la mayor parte de los microscopios electrnicos hoy da en uso son
magnticos; Un esquema clsico de estos aparatos esta representado en la
figura 2. Algunos instrumentos no poseen lente condensadora, otros en
cambio tienen dos, mientras otro grupo de aparatos posee solamente una
lente proyectora. Aunque los detalles de construccin varen de un tipo a
otro, se puede obtener una visin cualitativa de conjunto de sistema ptico.
La fuente de electrones (2)esta constituida por un hilo de volframio en
forma de horquilla, rodeado por una pantalla cilndrica polarizada
negativamente respecto al filamento( figura 3). Despus de atravesar el nodo
conectado a tierra, la mayor parte de los electrones del haz se pierden en las
paredes y aberturas excepto un estrecho cono que atraviesa el diafragma del
condensador.
La lente condensadora se usa tanto para controlar la intensidad luminosa,
como para variar la abertura de iluminacin relativa en el objeto. Los
dimetros de los diafragmas del condensador varan segn el tipo de instrumento, pero suelen estar comprendidos entre
0,1 y 0,5 mm. Despus de atravesar el objeto, donde muchos electrones se esparcen, el haz penetra en el campo de la

lente objetivo que produce una imagen aumentada del objeto. En el objetivo se suele colocar un diafragma de 10 a 100
de dimetro para interceptar los electrones esparcidos , pero generalmente esta precaucin se omite en el estudio de
muestras muy delgadas en las que el esparcimiento no es excesivo. Puesto que para las distancias usuales entre lente e
imagen, el aumento obtenido con la lente objetivo es del orden de X100 a X300, sera necesario el uso de una o mas
lentes protectoras que vuelvan a aumentar la imagen primaria. Algunos instrumentos llevan incorporada una pantalla
intermedia para facilitar la alineacin, pero no poseen en cambio este accesorio aquellos aparatos dotados de dos
lentes proyectoras. La imagen final se observa en una pantalla fluorescente , y separando esta pantalla del camino del
haz, se impresiona una placa fotogrfica con dicha imagen. Las dimensiones mas usuales para un microscopio de
transmisin pueden ser: Del filamento a la lente condensadora 15 cm, y otro tanto de esta ltima al objeto, mientras que
del objetivo a la pantalla que recoge la imagen final pueden haber unos 100 cm, el sistema completo deber ser rgido y
capaz de alcanzar un vaco de 0.0001 mmHg con ayudas de bombas de difusin rpidas en serie con bombas rotatorias.
Otras partes importantes importantes del aparato que no han sido representadas en los diagramas son la fuente de
alimentacin para crear un potencial del haz, fuentes de alimentacin para las lentes magnticas , medidores de vaco,
tornillos de alineacin, vlvulas de vaco , controles de aumento y enfoque, etc. De momento, nuestro inters mas
inmediato se centra en la tcnica de preparacin de

muestras.
Comparacin
entre
microscopia
electrnica
de
transmisin (MET) y microscopia electrnica de barrido
(MEB).
Preparacin de las muestras
El proceso comienza con el tejido altamente hidratado
y termina con el tejido virtualmente libre de agua y
preservado en una matriz de resina.
Existen muchos caminos para la preparacin de tejidos
para Microcopia electrnica de transmisin, pero los
mtodos siguen bsicamente ocho pasos:
1. Fijacin primaria: Busca preservar la estructura del tejido vivo, evitando los procesos autoliticos. Se realiza con
glutaraldehido CHO- CH2-CH2-CH2-CHO. Su accin se centra en las protenas as:
(COOH-protena-NH2)2 + CHO- CH2-CH2-CH2-CHO
Entonces:
COOH-protena-NH=CH-CH2-CH2-CH2-CH=N-proteina-COOH +H2O
La penetracin del glutaraldehido es lenta, esto quiere decir que 1 mm de tejido es atravesado en una hora por el
glutaraldehido.
2. Lavado: Normalmente se hace con un buffer.
Buffer: es necesario su uso debido a que el pH de los tejidos se baja drsticamente durante el proceso de fijacin. El
uso de buffer mantiene el pH fisiolgico (7,2 a 7,4) los sistemas de buffer ms comunes son: fosfato, s-collidine, trismaleato y cacodylate.
3. Fijacin secundaria: es llevada a cabo por la accin del tetrxido de osmio, el cual reacciona principalmente con los
lpidos. El tetrxido de osmio generalmente no penetra mas de 0,5 mm en una hora.
4. Deshidratacin: La filosofa de la deshidratacin es el reemplazo del agua usando etanol en series 70% 85% 95% y
etanol absoluto.
5. Infiltracin con solventes transicionales: procedimiento por el cual hay transmisin de fluidos gradualmente
reemplazado por soluciones intermediarias altamente miscibles con los agentes deshidratantes, la mayora de los
protocolos emplean un solvente transicional entre el deshidratante y la resina.

6. Infiltracin con resina: mezclas de propilen oxidado con Epoxy son introducidas reemplazando dentro de los tejidos
despus de la deshidratacin. La concentracin del solvente es minimizada gradualmente incrementando las
concentraciones de resina hasta llegar a la resina pura.
7. Inclusin: sumergir el tejido en la resina pura.
8. Polimerizacin de la resina: se logra acelerar el proceso de polimerizacin aumentando la temperatura.
Recipientes de uso comn para la inclusin de las muestras en MET. Normalmente las muestras se marcan con un trozo
de papel indicando algn tipo de convencin que ilustre posteriormente su contenido.

Los tejidos debidamente incluidos son cortados con el ultramicrotomo, dependiendo del tipo de microtomo utiliza
cuchillas de diamante o vidrio (la ms comn). Procesador automtico de tejidos.
3. Tcnicas yaplicaciones
La novedad(1) de las condiciones requeridas para la formacin de la imagen opto-electrnica, comparada con la rutina
establecida con los microscopios pticos radica en las dificultades inherentes de la formacin de una imagen por
electrones , los posibles efectos destructivos de la desecacin en vaco, y la bsqueda de contrastes en la imagen hacen
cada
vez
mas
difcil
esta
tarea.
Las suspensiones purificadas son contrastadas utilizando la tcnica de tincin negativa. Para esto, una gota de la
suspensin se coloca sobre papel parafinado (Parafilm ) y luego una rejilla de nquel, previamente recubierta con una
pelcula de Fomvar se deja flotar sobre la gota durante cinco minutos. El exceso de lquido se retira colocando papel de
filtro
en
los
bordes.
Posteriormente se realiza la tincin negativa con una solucin de fosfotungstato de potasio al 2% y pH 6,8. Para ello se
coloca una gota del contrastante sobre el papel parafinado y luego la rejilla con la muestra se deja flotar sobre ella
durante cinco minutos. Las rejillas se observan en un microscopio electrnico de transmisin. Para la observacin del
botonamiento de partculas virales, se emplea: una caja de plaqueo, a partir de la cual una porcin de agar, localizada
sobre una placa en la monocapa de clulas, se retira y fija con glutaraldehido al 2% en buffer fosfato pH 7,4 y posfija.
Despus del proceso de deshidratacin en concentraciones ascendentes de etanol, las muestras se incluyen en resina
LR-White . Se realizan cortes ultrafinos de 40 nm. que son contrastados con acetato de uranilo y citrato de plomo para su
posterior observacin en el microscopio electrnico de transmisin.
4. Ventajas ydesventajas.
Los elevados costos de los equipos y la debida adecuacin de una infraestructura para el buen funcionamiento hacen
que esta tcnica , se convierten en acceso de investigadores privilegiados . Si embargo, es comn contratar estos
servicios
por
horas
o
por
fotografas
requeridas.
Los costos de reactivos tambin dan un factor decisivo para la eleccin de esta tcnica. Aun cuando este proceso de
investigacin sea costoso , proporciona resultados muy precisos de amplia resolucin y magnificacin.
La tcnica de preparacin de las muestras cumple con protocolos establecidos, pero son vulnerables y variados al tipo
de
investigacin
que
se
realice
,contando
mas
con
la
experiencia
del
investigador.
La complejidad de los equipos , lo hacen susceptibles a la des calibracin. Nuevamente encontrar las condiciones
ptimas
requiere
de
un
proceso
tedioso
y
prolongado.
La manipulacin de reactivos se torna peligroso por la elevada condicin toxica de los mismos.
Las imgenes obtenidas son moncromticas y planas siendo necesario, en algunos casos, un tratamiento posterior
mediante anlisis de imgenes con un software especializado.

El microscopio electrnico de transmisin proyecta electrones a travs de una muestra muy delgada de tejido para
producir una imagen bidimencional en una pantalla fosforescente. La nitidez de un rea particular de la imagen es
proporcional al nmero de electrones que son transmitidos a travs de la muestra (Bozzula y Bartlerr, 1997).
ICROSCOPIO DE CAMPO IONICOmicroscopa de iones en campo (FIM) es una tcnica analtica empleada en ciencia de
materiales. El microscopio de iones en campo es una variedad de microscopio que puede ser usado para visualizar la ordenacin
de los tomos que forman la superficie de la punta afilada de una aguja de metal. Fue la primera tcnica con la que se consigui

resolver espacialmente tomos individuales. La tcnica fue desarrollada por Erwin Mller. En 1951 se publicaron por primera vez
imgenes de estructuras atmicas de tungsteno en la revista Zeitschrift fr Physik.

En que se basa el microscopio de campo ionico


Es un desarrollo del microscopio de emisin es el de campo inico, en el cual la punta esta rodeada por helio a baja presin. El
gas se ioniza en los planos atmicos de la punta y produce una imagen que puede tener un aumento hasta diez millones de
magnitudes: este tipo de microscopio se ha aplicado principalmente al estudio de metales y semiconductores, pero tambin se han
obtenido algunas imgenes biolgicas.
Un desarrollo ms del microscopio de campo inico es la sonda atmica. En este instrumento los tomos individuales se
remueven de la punta con campo elctrico pulsante. Los tomos pasan a travs de un espectrmetro de tiempo de vuelo, que
mide su energa y la relacin carga/masa. De esta manera, se puede determinar la naturaleza qumica de cada tomo en la
imagen del campo elctrico.
CONCLUSIN
Al contrario que los microscopios convencionales, donde la resolucin espacial se ve limitada por la longitud de onda de las
partculas empleadas en la visualizacin, el microscopio basado en el campo ionico funciona por proyeccin y alcanza
resoluciones atmicas, con una magnificacin aproximada de unos pocos millones de aumentos.
La microscopa de iones en campo (FIM) es una tcnica analtica empleada en ciencia de materiales. El microscopio de ionesen
campo es una variedad de microscopio que puede ser usado para visualizar la ordenacin de los tomos que forman la superficie
de la punta afilada de una aguja de metal. Fue la primera tcnica con la que se consigui resolver espacialmente tomos
individuales. La tcnica fue desarrollada por Erwin Mller. En 1951 se publicaron por primera vez imgenes de estructuras
atmicas de tungsteno en la revista Zeitschrift fr Physik.
En la FIM, se produce una aguja de metal afilada y se coloca en una cmara de ultra alto vaco, que despus se llena con un gas
visualizador tal como el helio o el nen. La aguja se enfra hasta alcanzar temperaturas criognicas (20-100 K). Luego se aplica un
voltaje positivo que va de 5.000 a 10.000 voltios sobre la punta. Los tomos de gas absorbidos por la punta se ven ionizados por
el fuerte campo elctrico que existe en las proximidades de ella. La curvatura de la superficie cercana a la punta provoca una
magnetizacin natural; los iones son repelidos bruscamente en direccin perpendicular a la superficie (un efecto de "proyeccin de
punto"). Se coloca un detector de modo que pueda recoger esos iones repelidos; y la imagen formada por todos los iones
repelidos puede tener la resolucin suficiente como para mostrar tomos individuales en la superficie de la punta.
Al contrario que los microscopios convencionales, donde la resolucin espacial se ve limitada por la longitud de onda de las
partculas empleadas en la visualizacin, el microscopio basado en FIM funciona por proyeccin y alcanza resoluciones atmicas,
con una magnificacin aproximada de unos pocos millones de aumentos.

You might also like