Professional Documents
Culture Documents
tros.
En la construccin de microscopios electrnicos (1), se han usado con
resultados satisfactorios ambos tipos de lentes: electrostticas y magnticas.
Con todo, la mayor parte de los microscopios electrnicos hoy da en uso son
magnticos; Un esquema clsico de estos aparatos esta representado en la
figura 2. Algunos instrumentos no poseen lente condensadora, otros en
cambio tienen dos, mientras otro grupo de aparatos posee solamente una
lente proyectora. Aunque los detalles de construccin varen de un tipo a
otro, se puede obtener una visin cualitativa de conjunto de sistema ptico.
La fuente de electrones (2)esta constituida por un hilo de volframio en
forma de horquilla, rodeado por una pantalla cilndrica polarizada
negativamente respecto al filamento( figura 3). Despus de atravesar el nodo
conectado a tierra, la mayor parte de los electrones del haz se pierden en las
paredes y aberturas excepto un estrecho cono que atraviesa el diafragma del
condensador.
La lente condensadora se usa tanto para controlar la intensidad luminosa,
como para variar la abertura de iluminacin relativa en el objeto. Los
dimetros de los diafragmas del condensador varan segn el tipo de instrumento, pero suelen estar comprendidos entre
0,1 y 0,5 mm. Despus de atravesar el objeto, donde muchos electrones se esparcen, el haz penetra en el campo de la
lente objetivo que produce una imagen aumentada del objeto. En el objetivo se suele colocar un diafragma de 10 a 100
de dimetro para interceptar los electrones esparcidos , pero generalmente esta precaucin se omite en el estudio de
muestras muy delgadas en las que el esparcimiento no es excesivo. Puesto que para las distancias usuales entre lente e
imagen, el aumento obtenido con la lente objetivo es del orden de X100 a X300, sera necesario el uso de una o mas
lentes protectoras que vuelvan a aumentar la imagen primaria. Algunos instrumentos llevan incorporada una pantalla
intermedia para facilitar la alineacin, pero no poseen en cambio este accesorio aquellos aparatos dotados de dos
lentes proyectoras. La imagen final se observa en una pantalla fluorescente , y separando esta pantalla del camino del
haz, se impresiona una placa fotogrfica con dicha imagen. Las dimensiones mas usuales para un microscopio de
transmisin pueden ser: Del filamento a la lente condensadora 15 cm, y otro tanto de esta ltima al objeto, mientras que
del objetivo a la pantalla que recoge la imagen final pueden haber unos 100 cm, el sistema completo deber ser rgido y
capaz de alcanzar un vaco de 0.0001 mmHg con ayudas de bombas de difusin rpidas en serie con bombas rotatorias.
Otras partes importantes importantes del aparato que no han sido representadas en los diagramas son la fuente de
alimentacin para crear un potencial del haz, fuentes de alimentacin para las lentes magnticas , medidores de vaco,
tornillos de alineacin, vlvulas de vaco , controles de aumento y enfoque, etc. De momento, nuestro inters mas
inmediato se centra en la tcnica de preparacin de
muestras.
Comparacin
entre
microscopia
electrnica
de
transmisin (MET) y microscopia electrnica de barrido
(MEB).
Preparacin de las muestras
El proceso comienza con el tejido altamente hidratado
y termina con el tejido virtualmente libre de agua y
preservado en una matriz de resina.
Existen muchos caminos para la preparacin de tejidos
para Microcopia electrnica de transmisin, pero los
mtodos siguen bsicamente ocho pasos:
1. Fijacin primaria: Busca preservar la estructura del tejido vivo, evitando los procesos autoliticos. Se realiza con
glutaraldehido CHO- CH2-CH2-CH2-CHO. Su accin se centra en las protenas as:
(COOH-protena-NH2)2 + CHO- CH2-CH2-CH2-CHO
Entonces:
COOH-protena-NH=CH-CH2-CH2-CH2-CH=N-proteina-COOH +H2O
La penetracin del glutaraldehido es lenta, esto quiere decir que 1 mm de tejido es atravesado en una hora por el
glutaraldehido.
2. Lavado: Normalmente se hace con un buffer.
Buffer: es necesario su uso debido a que el pH de los tejidos se baja drsticamente durante el proceso de fijacin. El
uso de buffer mantiene el pH fisiolgico (7,2 a 7,4) los sistemas de buffer ms comunes son: fosfato, s-collidine, trismaleato y cacodylate.
3. Fijacin secundaria: es llevada a cabo por la accin del tetrxido de osmio, el cual reacciona principalmente con los
lpidos. El tetrxido de osmio generalmente no penetra mas de 0,5 mm en una hora.
4. Deshidratacin: La filosofa de la deshidratacin es el reemplazo del agua usando etanol en series 70% 85% 95% y
etanol absoluto.
5. Infiltracin con solventes transicionales: procedimiento por el cual hay transmisin de fluidos gradualmente
reemplazado por soluciones intermediarias altamente miscibles con los agentes deshidratantes, la mayora de los
protocolos emplean un solvente transicional entre el deshidratante y la resina.
6. Infiltracin con resina: mezclas de propilen oxidado con Epoxy son introducidas reemplazando dentro de los tejidos
despus de la deshidratacin. La concentracin del solvente es minimizada gradualmente incrementando las
concentraciones de resina hasta llegar a la resina pura.
7. Inclusin: sumergir el tejido en la resina pura.
8. Polimerizacin de la resina: se logra acelerar el proceso de polimerizacin aumentando la temperatura.
Recipientes de uso comn para la inclusin de las muestras en MET. Normalmente las muestras se marcan con un trozo
de papel indicando algn tipo de convencin que ilustre posteriormente su contenido.
Los tejidos debidamente incluidos son cortados con el ultramicrotomo, dependiendo del tipo de microtomo utiliza
cuchillas de diamante o vidrio (la ms comn). Procesador automtico de tejidos.
3. Tcnicas yaplicaciones
La novedad(1) de las condiciones requeridas para la formacin de la imagen opto-electrnica, comparada con la rutina
establecida con los microscopios pticos radica en las dificultades inherentes de la formacin de una imagen por
electrones , los posibles efectos destructivos de la desecacin en vaco, y la bsqueda de contrastes en la imagen hacen
cada
vez
mas
difcil
esta
tarea.
Las suspensiones purificadas son contrastadas utilizando la tcnica de tincin negativa. Para esto, una gota de la
suspensin se coloca sobre papel parafinado (Parafilm ) y luego una rejilla de nquel, previamente recubierta con una
pelcula de Fomvar se deja flotar sobre la gota durante cinco minutos. El exceso de lquido se retira colocando papel de
filtro
en
los
bordes.
Posteriormente se realiza la tincin negativa con una solucin de fosfotungstato de potasio al 2% y pH 6,8. Para ello se
coloca una gota del contrastante sobre el papel parafinado y luego la rejilla con la muestra se deja flotar sobre ella
durante cinco minutos. Las rejillas se observan en un microscopio electrnico de transmisin. Para la observacin del
botonamiento de partculas virales, se emplea: una caja de plaqueo, a partir de la cual una porcin de agar, localizada
sobre una placa en la monocapa de clulas, se retira y fija con glutaraldehido al 2% en buffer fosfato pH 7,4 y posfija.
Despus del proceso de deshidratacin en concentraciones ascendentes de etanol, las muestras se incluyen en resina
LR-White . Se realizan cortes ultrafinos de 40 nm. que son contrastados con acetato de uranilo y citrato de plomo para su
posterior observacin en el microscopio electrnico de transmisin.
4. Ventajas ydesventajas.
Los elevados costos de los equipos y la debida adecuacin de una infraestructura para el buen funcionamiento hacen
que esta tcnica , se convierten en acceso de investigadores privilegiados . Si embargo, es comn contratar estos
servicios
por
horas
o
por
fotografas
requeridas.
Los costos de reactivos tambin dan un factor decisivo para la eleccin de esta tcnica. Aun cuando este proceso de
investigacin sea costoso , proporciona resultados muy precisos de amplia resolucin y magnificacin.
La tcnica de preparacin de las muestras cumple con protocolos establecidos, pero son vulnerables y variados al tipo
de
investigacin
que
se
realice
,contando
mas
con
la
experiencia
del
investigador.
La complejidad de los equipos , lo hacen susceptibles a la des calibracin. Nuevamente encontrar las condiciones
ptimas
requiere
de
un
proceso
tedioso
y
prolongado.
La manipulacin de reactivos se torna peligroso por la elevada condicin toxica de los mismos.
Las imgenes obtenidas son moncromticas y planas siendo necesario, en algunos casos, un tratamiento posterior
mediante anlisis de imgenes con un software especializado.
El microscopio electrnico de transmisin proyecta electrones a travs de una muestra muy delgada de tejido para
producir una imagen bidimencional en una pantalla fosforescente. La nitidez de un rea particular de la imagen es
proporcional al nmero de electrones que son transmitidos a travs de la muestra (Bozzula y Bartlerr, 1997).
ICROSCOPIO DE CAMPO IONICOmicroscopa de iones en campo (FIM) es una tcnica analtica empleada en ciencia de
materiales. El microscopio de iones en campo es una variedad de microscopio que puede ser usado para visualizar la ordenacin
de los tomos que forman la superficie de la punta afilada de una aguja de metal. Fue la primera tcnica con la que se consigui
resolver espacialmente tomos individuales. La tcnica fue desarrollada por Erwin Mller. En 1951 se publicaron por primera vez
imgenes de estructuras atmicas de tungsteno en la revista Zeitschrift fr Physik.