Determinacin de la Actividad de Ureasa

Bioqumica

PRCTICA DE LABORATORIO N1
DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DE UREASA
I.

INTRODUCCIN.

Las enzimas son biocatalizadores especficos de naturaleza proteica

que actan acelerando las reacciones qumicas experimentando
cambios fsicos durante ellas, pero recuperando su estado original
cuando dichas reacciones han culminado. De manera general, una
reaccin qumica catalizada por una enzima se representa de la
siguiente manera:
SUSTRATO + ENZIMA
+ PRODCUTO

COMPLEJO ENZIMA - SUSTRATO

ENZIMA

La ureasa, aislada y cristalizada en 1926 por el bioqumico

estadounidense J.B. Summer, se puede aislar de vegetales, mohos y
bacterias, no encontrndose presente en las clulas de mamferos.
Esta enzima acta sobre enlaces carbono-nitrgeno ( C-N) diferente
de los enlaces peptdicos y cataliza la siguiente reaccin: UREA + H 2O
CO2 + 2NH3, pudiendo ser inhibida por iones plata, mercurio, y
otros metales pesados. Se seala que un reductor suave como el
sulfito produce su inactivacin reversible. Una unidad de ureasa se
define como aquella que libera un micromol de amonaco a partir de
urea, por minuto, bajo condiciones de ensayo especficas de pH y
temperatura ( Ph 7.2 y 37 C).
El objeto de la presente experiencia es demostrar la actividad
enzimtica, determinando para ello la actividad de ureasa.
II.

MATERIALES.
1. Material Biolgico: Enzima Ureasa.
2. Material y Equipo de Laboratorio:
Gradillas para tubos.
Tubos de ensayo de 13 x 100 mm. (07).
Pipetas de 1 ml. (0.2; una al 1/100), 2ml, 5ml y 10 ml.
Bao Mara a 37 C.
Goteros o pipetas descartables de plstico.
Pizeta con agua destilada.
Espectrofotmetro o Fotocolormetro.
3. Reactivos:
Buffer Tris-HCL 0.05 M, pH 7.2

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III.

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Solucin de urea 0.075 M en buffer Tris- HCl 0.05 M, pH

7.2
Solucin de ureasa 0.05 %
Solucin de HgCl2 1%
Solucin de rojo de metilo 0.04%

PROCEDIMIENTO.
A. SISTEMA DE INCUBACIN:

COMPONENTES(ml) Y PROCESO

TUBO 1

TUBO2

Buffer Tris - HCl 0.05 M pH 7.2

0.5

0.5

Urea 0,075M bufferada

3.0
3.0
Mezclar y pre-incubar a 37C por 5 minutos
Ureasa 0.05%
----0.5
Incubar a 37C por 15 minutos
Mezclar suavemente e incubar a 37C por 15 minutos
HgCl2 1 %, mezclar

2 gotas

2 gotas

Ureasa 0.05 %

0.5

-----

Mezclar, preparar y seguir con los siguientes sistemas

B. VALORACIN DE LA ACTIVIDAD DE UREASA POR EL

MTODO DE LOS PRODUCTOS FORMADOS:
1. CUANTIFICACIN DE PRODUCTO FORMADO. REACCIN
DE NEUTRALIZACIN:
Se pasa 2ml. De contenido del tubo 1(Control o Blanco) a otro
tubo marcado (1B), se aade una gota del indicador rojo de
metilo al 0.04 % y se titula con HCl 0.05N (usar pipeta de 1 ml.
Graduada al 1/100). El punto final es la aparicin de un color
rosa plido. Se anota el volumen del cido gastado, el cual se
restar del valor de titulacin a obtener en el tubo 2. Este tubo
blanco represente el cido necesario para neutralizar los
componentes del medio inicial.

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Luego se pasa 2ml del contenido del tubo 2 (Problema) a otro

tubo marcado (2B) y se procede a titular como en el paso
anterior. Como se produce una base en esta reaccin, el tubo
experimental problema (tubo 2) necesita cido para lograr la
neutralizacin.
CLCULOS:
Se calculan los resultados en trminos de velocidad de reaccin
o actividad enzimtica expresados como micromoles de rea
desdoblados por minuto a 37C (unidades de ureasa).

Velocidad=(Vol. HCl gastado(problema) Vol. HCl(blanco) (Molaridad de

HCl)(1000)(4)
(15 minutos) (2) (2)

Expresar la actividad de ureasa en trminos de unidades

enzimticas (unidades de ureasa), considerando, adems de la
temperatura y el tiempo, la cantidad (en peso) de ureasa
empleada y el Ph.
2. CUANTIFICACIN DE PRODUCTO FORMADO. MTODO
COLORIMTRICO

ESPECTROFOTOMTRICO),

REACCIN DE NESSLER:

COMPONENTES (mL)
Tubo

BLANCO

del

sistema

de -----

0.1

-------

incubacin
Tubo 2 del

sistema

de ------

------

0.1

incubacin
Agua destilada

4.5

4.4

4.4

Reactivo de Nessler

0.5

0.5

0.5

Dejar en repodo durante 10 minutos y leer en fotocolormetro

con filtro verde, o en espectrofotmetro a 540 nm.
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CLCULOS:
a) CORRECCIN DE LECTURAS:
Restar lectura del tubo blanco de reactivos de las lecturas de
los tubos 1 (control o blanco) y 2 (problema). Luego, restar la
lectura del tubo 1 de la lectura del tubo 2.
b) VELOCIDAD DE REACCIN O ACTIVIDAD DE UREASA:
Se determina en trminos de mg de NH 3 producido por mL,
mediante la siguiente frmula:

Velocidad = (Lectura del tubo2) (Factor de calibracin)

= mg NH3/mL
Factor

de

calibracin:

fotocolormetro

0.06

Klett-Summerson,

37
y

mg

NH 3/mL

para

espectrofotmetro

Spectronic-20, respectivamente.
Determinar

las

Unidades

de

Ureasa

en

trminos

de

micromoles de NH3 producidos pro minuto, a 37C y a pH

7.2, considerando la cantidad (en peso) de ureasa utilizada.
IV.- CUESTIONARIO:
1.- EXPLICAR EL DISEO EXPERIMENTAL. CUAL ES EL PROPSITO DE
CADA TUBO? CUL ES EL TUBO CONTROL? ES NECESARIO MS
DE UN TUBO CONTROL?
EXPLICAR EL DISEO EXPERIMENTAL.
El propsito de esta prctica es demostrar la actividad enzimtica
determinando la actividad de la ureasa. Sabemos que las enzimas son
biocatalizadoras especficos de naturaleza proteica que actan acelerando
las reacciones, uno de los factores que afectan es el tiempo de incubacin
en los dos tubos y que se expreso en trminos de velocidad.

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Una vez obtenidos los tubos 1 y 2 por sistema de incubacin procedemos a

la valoracin de la actividad de la ureasa por el mtodo de productos
formados. Primero lo haremos por reaccin de neutralizacin donde
tomamos 1 mL de cada tubo para colocarlos en los tubos 1(B) y 2(B)
donde luego aadimos 1 gota de rojo de metilo al 0.04% y lo titulamos con
HCL 0.05Nobservando como punto final un rosa plido que indicara por
finalizada la titulacin. En el tubo (B) observamos que necesito mas acido
para lograr neutralizarse. Con los datos obtenidos en esta experiencia se
precedi a calcular los resultados en trminos de velocidad de reaccin o
actividad enzimtica expresados como micro moles de urea desdoblados
por minuto a 37C (unidades de ureasa) con un pH optimo de 7.2
Segundo por reaccin de Nessler donde haremos tres tubos: Blanco, 1 y 2
de acuerdo a los componentes indicados, dejaremos en reposo por 10
minutos y lo leeremos en fotocolormetro con filtro verde, o un
espectrofotmetro a 540 nm. Lo cual nos permiti hacer clculos en
correccin de lecturas y hallar la velocidad de reaccin o actividad de
ureasa
CUAL ES EL PROPSITO DE CADA TUBO?
En el primer tubo se demostr que cuando existe un inhibidor
enzimtico en el sistema, la reaccin no se da, quedando la enzima
inactiva.
En el segundo tubo se demostr que a condiciones especificas, se forma
amoniaco debido a la actividad de la enzima.
CUL ES EL TUBO CONTROL?
El tubo control viene a ser el tubo 1 en el cual no hubo ninguna
reaccin enzimtica, el cual nos sirve para la comparacin del
tubo 2
ES NECESARIO MS DE UN TUBO CONTROL?
En este caso si hubiera sido necesario un tubo donde hubiera
tenido todos los reactivos excepto la ureasa, para as verificar si
verdaderamente el inhibidor enzimtico inactiva al 100% a la
enzima.
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2.- OBSERVE LAS REACCIONES EN LOS TUBOS DE TITULACIN Y

ANOTAR SUS OBSERVACIONES.
Luego de haber realizado el sistema de incubacin de los tubos 1 y 2,
agregamos en los tubos 1(B) y 2(B) 2mL de stos para agregarles rojo de
metilo al 0.04 % se observ que en ambos la solucin torn amarillenta.
Despus se procedi a titular con HCl hasta que dio en ambos una coloracin
rosa plido que es el punto final.
Las observaciones en el tubo 1(B) fueron que con solo 0.15 mL se torn color
rosa plido lo que se indic como tubo control, en el tubo 2(B) para que se torne
rosa plido en la titulacin de HCl requiri 0.56 mL lo que se indic como un
tubo problema que requiere de ms acido para poder neutralizarse.
3.- CALCULE LAS UNIDADES DE LA UREASA A PARTIR SUS
RESULTADOS.
Velocidad =

(Vol. HCl gastado

(problema)

Vol. HCl gastado

(blanco)

(molaridad HCl) (100) (4)

(15 minutos) (2) (2ml.)
Velocidad = X u moles de rea desdobladas/minuto, a 37C, pH 7.2
Unidad de ureasa: Cantidad de ureasa necesaria para desdoblar
1 u mol de rea/minuto, a 37C, pH 7.2

Si:

X u moles rea desdobladas

Y = (X u moles rea)
0.5 ml. de ureasa

Y u moles rea desdobladas

100 ml. de ureasa

(100 ml.)

0.5 ml
Y = u moles de rea.

Si:
Y u moles rea son desdobladas

0.05 g. Zureasa
= (Y moles rea)

Z u moles rea son desdobladas

100 g. ureasa

Por tanto: Si 1 unidad de ureasa

X unidad ureasa

100 g

(0.05 g)
Z = u moles rea

1 u mol rea
Z u moles rea

Cantidad de ureasa a partir de nuestros resultados :

Vol. Hcl gastado TUBO 1 = 0.15 m l

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Vol. Hcl gastado TUBO 2 = 0.56 m l

Velocidad = (0.56 0.15) (0.05) (1000) (4)
(15 minutos) (2) (2)
Velocidad = 1.36 u moles de rea desdobladas/minuto.

Y = (1.36 u moles de rea) (100 ml)

(0.5)
Y = 272 u moles de rea.

Z = (272 u moles rea) (100 g.)

(0.05 g.)
Z = 544000 u moles rea.
X = (1 unidad de ureasa) (544 u moles rea)
(1 u mol rea)
X = 544000 unidades de ureasa.
4.- CUL ES LA FUNCIN DEL HGCL2 EN ESTE ENSAYO?
La funcin del Hg CL2 en experimentacin del sistema de incubacin es
detenerla actividad enzimtica de la ureasa. El HgCl2 cumpli la funcin de
inhibir o neutralizar el proceso de la reaccin.
5. DISEAR TABLA CON SUS RESULTADOS:
VELOCIDAD

1,36 moles de urea desdoblada/min

272 unidades molesde rea

544000 unidades moles de urea

544000 unidades de ureasa

6. A QU DATOS EXPERIMENTALES PUEDE REMITIRSE PARA

AFIRMAR QUE LAS ENZIMAS SON DE NATURALEZA PROTEICA?
SEGN ELLO, QU PRECAUCIONES SE DEBEN TOMAR PARA
MANIPULAR LAS ENZIMAS?
Como el objetivo de nuestra practica es demostrar la actividad enzimtica
determinando para ello la actividad de la ureasa, por conocimiento
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sabemos que las enzimas son biocatalizadores especficos de naturaleza

proteica que actan acelerando las reacciones qumicas en este caso uno
de los factores que afectan esta actividad enzimtica es el tiempo de
incubacin en los tubos 1 y 2 ( con los componentes indicados en cada
uno de ellos) que nos permiti expresar esta actividad en trminos de
velocidad; es decir, la cantidad de producto formado por unidad de
tiempo que generalmente se determina en micromoles de producto
formado por minuto, teniendo en cuenta un pH optimo de 7.2 y un
temperatura de37C.Una vez obtenidos los tubos 1 y 2 por sistema de
incubacin procedemos a la valoracin de la actividad de la ureasa por el
mtodo de productos formados. Primero lo haremos por reaccin de
neutralizacin donde tomamos 1 mL de cada tubo para colocarlos en los
tubos 1(B) y 2(B) donde luego aadimos 1 gota de rojo de metilo al
0.04% y lo titulamos con HCL 0.05N observando como punto final un rosa
plido que indicara por finalizada la titulacin. En el tubo (B) observamos
que necesito mas acido para lograr neutralizarse.
Con los datos obtenidos en esta experiencia se precedi a calcular los
resultados en trminos de velocidad de reaccin o actividad enzimtica
expresados como micromoles de urea desdoblados por minuto a 37C
(unidades de ureasa) con un pH optimo de 7.2.Segundo por reaccin de
Nessler donde haremos tres tubos: Blanco, 1 y 2 de acuerdo a los
componentes indicados, dejaremos en reposo por 10 minutos y lo
leeremos en el fotocolormetro con filtro verde, o un espectrofotmetro a
540 nm. Lo cual nos permiti hacer clculos en correccin de lecturas y
hallar la velocidad de reaccin o actividad de ureasa.
El xito del trabajo con enzimas depende del cuidado con que se

eviten las condiciones en las cuales son inestables:

Deben evitarse altas temperaturas y acidez o alcalinidad
extremas. Durante el aislamiento y la purificacin conviene, en
general, trabajar entre 0 y 4 oC y evitar pH mayor que 9 o
menor que 5.

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Debe evitarse la formacin de espuma, ya que la misma es

indicador de desnaturalizacin proteica.

Los solventes orgnicos inactivan

muchas

enzimas

temperatura ambiente; de modo que los fraccionamientos con

los mismos deben llevarse a cabo a baja temperatura y sta no
debe elevarse hasta que el solvente se haya eliminado o diluido

a concentraciones inocuas.
Deben tomarse tambin varias precauciones en lo que se
refiere a las condiciones de la reaccin:
Elegir pH y temperatura en las zonas de mayor estabilidad de
la enzima
Llevar a cabo la reaccin a temperatura constante.
Elegir un buffer adecuado para evitar cambios de pH
Evitar la introduccin de trazas de otras enzimas (por ejemplo
saliva).
Elegir una cantidad de enzima adecuada para obtener
variaciones apropiadas de la magnitud a medir.

7) EXPLIQUE EL FUNDAMENTO DE LA VALORACIN DE LA ACTIVIDAD

DE UREASA MEDIANTE EL MTODO DELOS PRODUCTOS FORMADOS
UTILIZANDO LA REACCIN DE NEUTRALIZACIN.
A partir del experimento realizado se puede concluir que la ureasa
aceler la reaccin ya que cuando se aplic el amortiguador a ambos
tubos; el tubo 2, el cual contena la enzima tena como producto:
AMONIACO y dixido.
Esto se vio evidenciado en el proceso de titulacin, cuando el tubo 2
requiri un mayor gasto para neutralizar la base formada (amoniaco).
9) CMO SE DENOMINA LAS SUSTANCIAS SOBRE LAS CUALES
ACTAN LAS ENZIMAS? EXPLIQUE LOSMECANISMOS.
Las sustancias sobre las cuales actan las enzimas se denomina
SUSTRATO, pero debemos tener en cuenta que estas no alteran el
equilibrio de la reaccin, solamente aumentan la velocidad con que
estas se producen, actuando como catalizadores. Generalmente, las

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enzimas se nombran aadiendo la terminacin "asa" a la raz del

nombre de la sustancia sobre la que actan.
Mecanismos de control de la actividad enzimtica:

La temperatura: Si se suministra a una reaccin enzimtica

energa en forma de calor, al ser captada por las molculas es
transformada en energa cintica. Ello favorece la movilidad de
estas molculas y por tanto el nmero de encuentros se
incrementa. Si la temperatura es excesiva, la enzima, cuya
estructura es protenica, se desnaturaliza perdiendo totalmente

sus propiedades, de forma que la actividad enzimtica

PH: Todas las enzimas tienen dos valores lmite de pH entre los
cuales son efectivas. Traspasados estos valores, la enzima se
desnaturaliza y deja de actuar. Entre estos dos valores
extremos se sita un pH en el cual la enzima alcanza una
efectividad mxima: Es el llamado pH ptimo. Este es
independiente del punto isoelctrico de la molcula enzimtica,
es decir, cuando sta no tiene carga global, ya que hay tantos
radicales cidos como bsicos. El pH ptimo est condicionado
por el tipo de enzima y de sustrato, debido a que el pH influye

en el grado de ionizacin de los radicales del sustrato.

Concentracin del sustrato: En toda reaccin enzimtica, si se
incrementa la concentracin del sustrato se produce un
aumento de la velocidad de formacin del producto, tiende a
restablecer el equilibrio qumico entre la concentracin del

sustrato y la del producto. En este proceso la enzima no vara.

Activadores: Algunos iones favorecen la unin de la enzima con
el sustrato; por ejemplo, la enzima fosforilasa, que regula la
formacin de ATPa partir de ADP y un grupo fosfato (H3PO4) y
que se suele representar como Pi (Fosfato orgnico), se ve

activada por la presencia de iones magnesio Mg+ 2.

Inhibidores: Hay inhibicin cuando disminuye la actividad y la
eficacia de una enzima. Las sustancias distintas del sustrato
que tienen este efecto se denominan inhibidores

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La inhibicin irreversible o envenenamiento de la enzima tiene lugar

cuando el inhibidor se fija permanentemente al centro activo
inutilizndolo al alterar su estructura. La inhibicin reversible tiene
lugar cuando no se inutiliza el centro activo, sino que solo se impide
su normal funcionamiento.
V.-CONCLUSIONES:

El tubo 1 (B) se indic como un tubo control ya que slo contiene una
cantidad de sustancia que luego se procedi a cuantificar y se tom de

referencia al medir la muestra real.

El tubo 2(B) se indic como tubo problema porque se form una base,
por lo cual ste

requiri de ms cido, lo cual se us

cuantificacin de la velocidad de reaccin.

VI.- ANEXOS.

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Tubo11

Control

para la

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