DESEMPENHO DE DIFERENTES MEIOS DE CULTURA

UTILIZADOS NA AVALIAO DE FUNGOS PRESENTES EM

AMBIENTES DE PRODUO DE ALIMENTOS

MRCIO ADRIANI GAVA

Dissertao apresentada Escola Superior

Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz,
Universidade de So Paulo, para obteno
do ttulo de Mestre em Cincias, rea de
Concentrao: Microbiologia Agrcola.

PIRACICABA
Estado de So Paulo - Brasil
Fevereiro - 2002

DESEMPENHO DE DIFERENTES MEIOS DE CULTURA

UTILIZADOS NA AVALIAO DE FUNGOS PRESENTES EM
AMBIENTES DE PRODUO DE ALIMENTOS

MRCIO ADRIANI GAVA

Bilogo

Orientador: Prof. Dr. CLUDIO ROSA GALLO

Dissertao apresentada Escola Superior

Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz,
Universidade de So Paulo, para obteno
do ttulo de Mestre em Cincias, rea de
Concentrao: Microbiologia Agrcola.

PIRACICABA
Estado de So Paulo - Brasil
Fevereiro 2002

Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)

DIVISO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAO - ESALQ/USP

Gava, Mrcio Adriani

Desempenho de diferentes meios de cultura utilizando na avaliao de
fungos presentes em ambientes de produo de alimentos / Mrcio
Adriani Gava. - - Piracicaba, 2002.
50 p. : il.
Dissertao (mestrado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de
Queiroz, 2002.
Bibliografia.
1. Contaminao de alimento 2. Meio ambiente 3. Microbiologia de
alimentos 4. Processamento de alimento I. Ttulo
CDD 614.3

Permitida a cpia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte O autor

AGRADECIMENTOS
Ao Professor Dr. Cludio Rosa Gallo pela orientao, apoio e
ensinamentos;
BIOAGRI LABORATRIOS LTDA pelo financiamento da
pesquisa;
Aos Professores Dr. Luiz Eduardo Gutierrez, Dra Marlia Oetterer
e Dra Silene Bruder Sarmento pelas correes e sugestes;
Engenheira Florestal Izabel Christina Gava de Souza pela
colaborao nas anlises estatsticas e sugestes;
Dra. Mrcia Regina de Camargo

Ranzani pelo apoio

laboratorial e sugestes;
Camila Frutoso no auxlio laboratorial;
Ao Marcos Favarim no auxlio na coleta de amostras;
A todos que de uma forma ou de outra contriburam na realizao
deste trabalho.

SUMRIO
Pgina
LISTA DE QUADROS .........................................................................

iv

RESUMO ..........................................

SUMMARY.................................

xii

1 INTRODUO..................................................................................

2 REVISO DE LITERATURA............................................................

2.1 Qualidade microbiolgica do ar em ambientes interiores............

2.2 Mtodos para avaliar a qualidade do ar.....................................

3 MATERIAL E MTODOS .............................................................

11

3.1 Material..........................................................................................

11

3.1.1 Amostrador microbiolgico de ar................................................

11

3.1.2 Meios de Cultura.........................................................................

12

3.2 Mtodos.........................................................................................

16

3.2.1 Coleta das amostras...................................................................

16

3.2.2 Incubao...................................................................................

17

3.2.3 Contagem de unidades formadoras de colnias de fungos

e bactrias..................................................................................

17

3.2.4 Avaliao estatstica dos resultados de contagem....................

18

3.2.5 Avaliao qualitativa dos resultados .........................................

18

3.2.5.1 Identificao dos fungos presentes.........................................

18

3.2.5.2 Avaliao dos meios de cultivo e identificao dos fungos

fungos patognicos e toxignicos e estudo de bactrias........

19

4 RESULTADOS E DISCUSSO......................................................

20

4.1 Avaliao quantitativa..................................................................

20

4.2 Avaliao qualitativa ....................................................................

27

4.3 Avaliao da contagem total de bactrias....................................

37

4.4 Avaliao ambiental das instalaes amostradas........................

38

5 CONCLUSES .............................................................................

40

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS...................................................

42

APNDICES.......................................................................................

47

LISTA DE QUADROS
Pgina
1 Unidades formadoras de colnias/m3 (valores mdios) em
diferentes meios de cultura, nos ambientes de produo de
doce de leite e de amendoim............................................................... 22
2 Unidades formadoras de colnias/m3 (valores mdios) em
diferentes

meios

de

cultura,

nos

ambientes de

empacotamento e de produo de embutidos..................................... 23

3 Contagem em ufc/m3, de fungos, em diferentes meios de
cultura envolvendo todos os ambientes e pocas de coleta............... 24
4 Unidades formadoras de colnias/m3 (valores mdios de
cinco

repeties) nos meios

de

cultura

DRBC e

Sabourand, nos ambientes de produo de doce de leite

e de amendoim...................................................................................... 26
5 Unidades formadoras de colnias/m3 (valores mdios de
cinco repeties) nos meios
Sabourand,

de

nos ambientes de

cultura

DRBC e

empacotamento e de

produo de embutidos........................................................................ 26

vii

6 Gneros de fungos desenvolvidos em diferentes meios de

cultura no ambiente de produo de doce de leite............................ 28

7 Gneros de fungos desenvolvidos em diferentes meios de

cultura no ambiente de produo de amendoim............................... 29

8 Gneros de fungos desenvolvidos em diferentes meios de

cultura no ambiente empacotamento de embutidos............................ 30

9 Gneros de fungos desenvolvidos em diferentes meios de

cultura no ambiente de produo de embutidos................................ 31

10 Dimetro e cor das colnias de Aspergillus parasiticus

ao longo do perodo de incubao...................................................... 33

11 Dimetro e cor das colnias

de Aspergillus fumigatus

ao longo do perodo de incubao...................................................... 33

12 Dimetro e cor das colnia de Aspergillus niger ao

longo do perodo de incubao.......................................................... 34

13 Dimetro e cor das colnias de Aspergillus flavus ao

longo do perodo de incubao.......................................................... 34

14 Dimetro e cor das colnias de Fusarium verticulloides

ao longo do perodo de incubao...................................................... 35

15 Dimetro e cor das colnias de Fusarium moniliforme

ao longo do perodo de incubao...................................................... 35

viii

16 Dimetro e cor das colnias de Stachybotrys chartarum

ao longo do perodo de incubao...................................................... 36

17 Dimetro e cor das colnias de Histoplasma capsulatum

ao longo do perodo de incubao...................................................... 36
18 Unidades formadoras de colnias/m3 (valores mdios) de
bactrias nos diferentes ambientes amostrados (mdias
de trs repeties).............................................................................. 37

19 Correo estatstica Feller............................................................... 48

DESEMPENHO DE DIFERENTES MEIOS DE CULTURA

UTILIZADOS NA AVALIAO DE FUNGOS PRESENTES EM
AMBIENTES DE PRODUO DE ALIMENTOS
Autor: MRCIO ADRIANI GAVA
Orientador: Prof.Dr.CLUDIO ROSA GALLO

RESUMO
O presente estudo foi dividido em duas fases; a primeira visou
avaliar o desempenho de diversos meios de cultura, para fungos, no ar de
ambientes de produo de alimentos, atravs da resposta de contagem e
identificao dos gneros que podem conter espcies indesejveis;
tambm foi avaliada a condio ambiental juntamente com a contagem
total de bactrias. O ambiente de duas reas foi utilizado para a pesquisa,
uma indstria de doces, produo de doce de leite e doce de amendoim,
na Cidade de Ribeiro Preto (SP) e, outra, uma indstria de embutidos,
nos setores de empacotamento e produo, na Regio de Piracicaba (SP).
Os

meios

de

cultura

utilizados

foram:

Dichloran

Rose

Bengal

Chloramphenicol gar (DRBC), Sabouraud Dextrose a 4% gar, Malt

gar (MA), Malt Extract Agar Yeast and Molds (MEAYM), Plate Count
gar-Cloranfenicol (PCA-Cloranfenicol), Dichloran 18% Glycerol gar
(DG 18), Batata Dextrose gar (BDA) e Oxytetracycline Glucose Yeast

Agar (OGY); para a contagem de bactrias foi utilizado o meio Plate

Count Agar (PCA). Cada um dos pontos foi amostrado em triplicata
utilizando um amostrador de impactao linear. A segunda fase do projeto
avaliou os meios de cultura Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol
gar (DRBC), Sabouraud Dextrose a 4% gar selecionados da primeira
fase. Novas coletas foram realizadas amostrando cinco repeties em
cada um dos pontos, que permaneceram os mesmos da primeira fase. Em
paralelo foram utilizadas culturas puras de Aspergillus flavus, Aspergillus
fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus parasiticus, Fusarium moniliforme,
Fusarium

verticulloides,

Histoplasma

capsulatum

Stachybotrys

chartarum, inoculando os dois meios selecionados e avaliando o

desenvolvimento desses fungos ao longo do perodo de incubao de sete
dias, a 28C, para servir de parmetro de comparao com as coletas de
ar realizadas no mesmo perodo, a fim de se verificar se algum desses
fungos indesejveis estaria presente nas amostras de ar. De acordo com
os resultados obtidos, os meios DRBC e Sabouraud Dextrose a 4% gar,
foram, estatisticamente, melhores que os demais meios testados,
apresentando um maior nmero de unidades formadoras de colnias/m3.
O meio de Extrato de Malte diferenciou estatisticamente dos demais e teve
o menor desempenho para a quantificao desses microrganismos no ar.
A recomendao do melhor meio para identificao de fungos no ar de
indstrias alimentcias no foi conclusiva, com exceo do

PCA-

Cloranfenicol que apresentou baixa diversidade de gneros, sendo

considerado reprovado. No geral foi observado um nmero elevado de
unidades formadoras de colnias de fungos e bactrias/m3 durante as
amostragens. A avaliao quali-quantitativa dos ambientes estudados
sugere que esses no se encontram em condies adequadas, sendo
necessria a elaborao de um padro referencial para o monitoramento
da indstria alimentcia em nosso pas. O amostrador utilizado nas coletas

xi

promoveu rapidez nas coletas e proporcionou a expresso dos resultados

em medidas confiveis, por ser um equipamento que permite calibrao
em seu sistema de aspirao de ar.

PERFORMANCE OF DIFFERENT CULTURE MEDIA USED IN

THE EVALUATION OF FUNGI FOUND IN FOOD PRODUCTION
ENVIRONMENTS
Author: MRCIO ADRIANI GAVA
Adviser: Prof.Dr.CLUDIO ROSA GALLO

SUMMARY
The present study consisted of two phases. The first one aimed at
evaluating the performance of different culture media for fungi found in the air
of food production environments, through the results of counting and identifying
genders that may contain undesirable species. The environmental condition was
also evaluated along with a total bacteria counting. The present work took place
in two different places, an industry which produces sweets made from milk or
peanuts, in Ribeirao Preto city (SP) and, in the packing and production
sections of a meat encased products industry located in Piracicaba region
(SP). The culture media used were: Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol
Agar (DRBC), Sabouraud Dextrose 4% Agar (MA), Malt Extract Agar
Yeast and Molds (MEAYM), Plate Count Agar Chloramphenicol
Chloramphenicol),
Dextrose

Dichloran 18% Glycerol Agar

Agar

(BDA)

(PCA-

(DG 18), Potato

and

xiii

Oxytetracycline Glucose Yeast Agar (OGY). The medium used for the bacteria
counting was Plate Count Agar (PCA). Three replicates of each sampled spot
were obtained by using a linear impacting sampler. The second phase of this
project evaluated the following culture media, selected during the first phase of
this study: Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC) and
Sabouraud Dextrose 4% Agar. New sample collections (five replicates) were
carried out for each of the spots selected. The sampled spots were the same for
both phases. In a parallel manner, pure cultures of Aspergillus flavus,
Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus parasiticus, Fusarium
moniliforme,

Fusarium

verticulloides,

Histoplasma

capsulatum

and

Stachybotrys chartarum were employed to inoculate the two selected media.

The development of these fungi was evaluated throughout a 7-day-incubation
period, at 28C, to function as a comparative reference for the air samples
obtained in the same period in order to verify if any of these undesirable fungi
was present in the air samples. According to the results obtained, DRBC and
Sabouraud Dextrose 4% Agar media were statistically superior than the others,
presenting a higher number of colony forming units/m3. The Malt Extract
medium was statistically different from the others and showed the worse
performance as to the quantification of microorganisms present in the air. There
was no conclusive recommendation as to the best medium for the identification
of fungi found in the air of food industries, except for PCA-Chloramphenicol,
which showed low diversity of genders and was discarded. In general, a high
number of fungi and bacteria colony forming units/m3 was observed during the
sampling procedures. The qualitative-quantitative evaluation of the environments
studied suggests that they do not present adequate conditions, evidencing the
need for the establishment of a referential standard in order to monitor food
industries in our country. The sampler used in this work allowed a quick sample

xiv

collection and a reliable expression of results, as this equipment enables the

calibration of its air intake system.

1 INTRODUO

A contaminao microbiolgica do ar tem sido pouco enfatizada

na comunidade cientfica brasileira. O falecimento do Sr. Ministro Srgio
Motta, em abril de 1998, despertou discusso sobre o assunto, uma vez
que se suspeitou de infeco generalizada induzida por microrganismos
de risco sade, presentes no ar de seu gabinete.
Considerando a preocupao mundial com a qualidade do ar de
ambientes climatizados e a ampla e crescente utilizao de sistemas de ar
condicionado no pas, em funo das condies climticas, o Ministrio da
Sade prope, atravs da portaria n0 3.523/GM de 28 de agosto de 1998,
que sejam determinados padres de qualidade do ar em ambientes
climatizados, bem como, o seu monitoramento.
Recentemente, a Resoluo RE n o 176 de 24 de outubro de
2000, estabeleceu critrios para monitoramento sobre a qualidade do ar
interior em ambientes climatizados artificialmente, definindo a identificao
das fontes poluentes de natureza biolgica, qumica e fsica, e mtodos
analticos, alm de recomendaes para controle. Para padres biolgicos
estabelecido um limite mximo de 750 unidades formadoras de colnias
por m3 (ufc/m3) para fungos, desde que no ocorram espcies patognicas
e toxignicas. Para coleta foi adotado um amostrador de ar de impactao
com acelerador linear, e indicado os seguintes meios de cultivo: gar
Extrato de Malte, gar Sabouraud Dextrose a 4%, gar Batata Dextrose
ou outro, desde que cientificamente validado.

Observa-se que em termos de meios de cultura indicados a

resoluo inconsistente, pelo fato de no haver uma especificao de
um meio padro, o que poderia ocasionar interpretaes distintas das
condies de um mesmo ambiente. Estudos quanto comparao dos
meios de cultura recomendados para contagem e identificao de fungos
citados acima e outros meios de importncia tornam-se necessrios.
A World Health Organization (1988) discutindo sobre a qualidade
do ar de ambiente interno, relata que a contaminao microbiolgica, em
ambientes interiores de edifcios, tida como responsvel substancial nas
faltas ao trabalho. Relata, ainda, que na populao em geral, verifica-se
uma mdia normal de 5 a 10 dias/ano de restrio de atividade per capita,
devida infeces agudas e episdios alrgicos, os quais poderiam ser
reduzidos, significativamente, com o controle dos contaminantes. Alguns
fatores referentes arquitetura das edificaes, como lotao e
recirculao de ar podem, tambm, promover a

dissiminao de

patgenos pelo ar, quando emitidos pelos ocupantes que sofrem de

tuberculose, sarampo, varicela e outras doenas.
Componentes dos sistemas de ventilao como torres de
refrigerao,

aparelhos

de

ar

condicionado,

umidificadores

desumidificadores podem promover o crescimento de fungos, bactrias e

outros microrganismos. Estes microrganismos podem atingir patamares
elevados de crescimento quando o ambiente proporciona condies de
umidade e temperatura ideais. Alm de reaes de irritaes e alergias
aos ocupantes, nos casos de ambientes de manipulao de alimentos,
podem interferir na qualidade do produto final.
A preocupao com a sanidade dos alimentos tem sido cada vez
mais colocada em destaque. A manipulao de alimentos em ambientes
sem controle dos contaminantes pode se tornar potencial de risco, devido
contaminao propagar-se atravs dos produtos.

Baseado em especificaes de monitoramento de reas comuns,

esta

pesquisa

visa

contribuir

para

controle

de

contaminantes

microbiolgicos do ar na rea alimentcia.

Os objetivos desta pesquisa foram:
a) aferir o desempenho de diversos meios de cultura para o crescimento
de fungos, em relao resposta de contagem e identificao dos
gneros que podem conter espcies indesejveis, incluindo os meios
recomendados pela Resoluo do Ministrio da Sade;
b) expressar dentro de um campo amostral, as condies ambientais onde
ocorre a manipulao de alimentos nas indstrias, tendo como produtosbase derivados do leite, do amendoim e embutidos crneos da indstria
frigorfica.

2 REVISO DE LITERATURA
2.1 Qualidade microbiolgica do ar em ambientes interiores
Os efeitos na sade associados aos microrganismos presentes
nos ambientes interiores tm mostrado a necessidade de monitoramento do
ar de interiores e motivado as pesquisas de mtodos de deteco e
identificao de microrganismos.
Lacaz (1970) cita que, em 1924, Van Leewen estudou as relaes
clnicas entre asma e clima na Holanda, atribuindo grande importncia
etiolgica aos esporos de fungos e bactrias do ar como agentes
extrnsecos causadores da chamada asma climtica. O autor revisando
sobre os contaminantes biolgicos do ar verificou que numerosos fungos na
poeira

no

alergizantes.

ar
De

desempenham
acordo

com

papel

importante

Feldman

(1995),

como
um

elementos

programa

de

monitoramento para contaminantes do ar como poeira, esporos de

Aspergillus fumigatus e endotoxinas pode ser um instrumento valioso na
sade pblica e ambiental.
Segundo Pelczar et al. (1981) o grau de contaminao do ar
interno influenciado por fatores, tais como as taxas de ventilao, o
nmero de pessoas que ocupam o ambiente, a natureza e o grau de
atividade exercida por esses indivduos.
Como componentes biolgicos do ar em ambientes internos,
aclimatados artificialmente, Kulcsar Neto & Siqueira (1998) citam os
microrganismos

como

cohabitantes,

apresentando-se

em

curva

exponencial de crescimento. Os autores mostram que h prevalncia de

bactrias, como: Legionella pneumophila, Bacillus sp, Flavobacterium sp,
Pseudomonas

aeruginosa,

tuberculosis,

Neisseria

Actinomyces

thermophilia;

Staphylococcus

meningitidis,
e

de

aureus,

Streptococcus
fungos,

como:

Mycobacterium
pneumoniae

Paracoccidioides

brasiliensis, Histoplasma capsulatum, Cephalosporium sp, Aspergillus sp,

Penicillium sp, Cladosporium sp e Fusarium sp.
Segundo Brickus & Aquino Neto (1999) a baixa qualidade do ar
de interiores tem sido relacionada com efeitos adversos sade humana,
levando a Organizao Mundial de Sade (OMS) a classificar a Sndrome
do Edifcio Doente (SED) como um problema de sade pblica. Os
sintomas decorrentes da sndrome podem estar ligados a poluentes de
origem qumica ou biolgica, sendo eles: irritao e obstruo nasal,
desidratao e irritao da pele, irritao e secura na garganta, irritao e
sensao de secura nas membranas dos olhos, dor de cabea, letargia e
cansao generalizado, levando perda de concentrao.
Kulcsar Neto & Siqueira (1998) citam que os padres referenciais
para analisar os resultados de qualidade microbiolgica do ar de interiores
so

classificados

em

relativos,

qualitativos,

quantitativos,

qualitativos/quantitativos e ocupacionais. Com base nesta extensa reviso

e considerando a necessidade de serem implantados procedimentos que
visem minimizar o risco potencial sade dos ocupantes, que tm
permanncia prolongada nestes ambientes, os autores recomendam a
adoo de parmetros qualitativos e quantitativos que permitam uma
interpretao cientfica sobre a qualidade do ar de ambientes interiores e a
correta tomada de deciso quanto interveno, mais especificamente,
com relao a sistemas de ar condicionado, ventilao e aquecimento.
Segundo Padro Referencial Brasileiro Microbiolgico (1998), o
Conselho Cientfico da Brasindoor (Sociedade Brasileira de Meio Ambiente

e de Qualidade do Ar de Interiores) aprovou, em 1998, o seguinte

referencial brasileiro para ambientes:
a) Qualitativo: no so admitidos nos ambientes interiores:
-Fungos

Histoplasma

Paracoccidioides

capsulatum,

brasiliensis,

Aspergillus

Cryptococcus
parasiticus,

neoformans,
A. flavus,

A.

fumigatus, Stachybotrys atra e Fusarium moniliforme.

-Bactrias Legionella pneumophila
b)Quantitativo: Valor Mximo Aceitvel=750ufc/m3 de ar.
c)Relativo: Classificao dos ambientes dentro dos valores mximos
aceitveis. O valor mximo relativo dado pela seguinte expresso:
Ar ambiental Interior(I) = Ar ambiental Exterior(E).1,5; ento os ambientes
so classificados em: a) Ambientes em boas condies I/E < 1,5; b)
Ambientes em regulares condies I/E = 1,5-2,0; e c) Ambiente em ms
condies I/E > 2,0.
Ezeonu et al.(1994) colonizaram com fungo, em laboratrio,
materiais de isolao acstica e fibra de vidro trmica usados no
aquecimento, ventilao e sistemas de ar condicionados. A mistura de
fungos, principalmente Aspergillus versicolor, Acremonium obclavatum e
Cladosporium herbarum produziu odores volteis, incluindo 2-etil hexanol,
ciclohexano, e benzeno. Segundo o autor, o benzeno classificado como
um composto qumico perigoso pela Environmental Protection Agency e
Occupational Safety and Health Administration, o ciclohexano e 2-etil
hexanol so conhecidos como irritantes dos olhos e da pele. Este estudo
demonstrou que fungos nos sistemas de aquecimento, ventilao e ar
condicionado podem desempenhar um papel significativo nos problemas
de sade nos ocupantes de edifcios com essas caractersticas.
Macneil et al.(1995) revisam mtodos moleculares na deteco
de fungos e bactrias comuns no ar de interiores. Segundo os autores as
tcnicas moleculares para deteco e identificao de bactrias esto

desenvolvidas e disponveis para uma variedade de espcies. Para a

deteco e identificao de fungos tem sido tratada com limites, pois
vrios gneros comuns no ar de interiores no so detectados por essas
tcnicas.
Angulo-Romero et al.(1996) estudaram a presena de fungos no
ar interno de doze escolas na Espanha durante dois anos. Foram
coletadas 456 amostras usando um aspirador de p e analisadas para
cultura de fungos. Das colnias isoladas 38% pertenciam a patognicos
capazes de causar infeces ou doenas de hipersensibilidade. Dos 91
gneros identificados, os mais freqentes foram Alternaria, Aspergillus e
vrias espcies de Penicillium. Os autores observaram tambm que a
maioria destes fungos apresentou variaes sazonais na concentrao, a
qual foi mais abundante entre os meses de abril e outubro.
Poucos estudos sobre o monitoramento microbiolgico do
ambiente de indstrias alimentcias tm sido observados na literatura.
Ligugnana e Fung (1990) desenvolveram um programa de
amostragem para mostrar o impacto das atividades dos trabalhadores e da
higiene do local na qualidade microbiana do ar e superfcies no ambiente
de trabalho na indstria de alimentos. Foram utilizados o amostrador de ar
SAS e o mtodo Agar contact plate. Foram avaliados: o efeito da limpeza
das mos e utenslios na carga microbiolgica nas superfcies de trabalho,
efeito de desinfetantes aerossis nos microrganismos transportados pelo
ar nos ambientes fechados, efeito da fumigao na reduo de fungos,
nvel de higiene do ar em ambientes crticos como enchimento estril e
empacotamento de yogurt, deteco de microrganismos especficos pelo
meio seletivo, e efeito da variao da umidade relativa na qualidade
microbiana do ar. Os autores observaram que, para obter melhores
resultados importante que os empregados tenham boa vontade e
entendam as razes dos procedimentos especficos de higiene.

Sveum et al (1992) citam que o ar ambiente em reas de

empacotamento de alimentos tido como um ponto crtico de controle.
Kurata (1994) cita que a qualidade do ar em reas de
empacotamento um fator crtico no processamento de alimentos
deteriorveis e, portanto, mtodos de monitoramento do ar devero ser
estabelecidos

com

limites

apropriados

de

nveis

viveis

de

microrganismos. O autor apresenta um plano de monitoramento de

microrganismos transportados pelo ar em ambientes interiores de
empacotamento na indstria alimentcia. Os amostradores do ar so
Brotest RCS e o RCS Plus, e os meios de cultura agar HS (rose bengal
agar) e DG18 (dichloran 18% glycerol). O autor prope a seguinte
classificao para a qualidade do ar em reas de processamento e
empacotamento de alimentos de acordo com o nmero de unidades
formadoras de colnias de fungos (ufc/m3):
Categoria

ufc/m3

I - condio microbiolgica limpa

0 - 10

II - condio microbiolgica sub-limpa

11 - 50

III - condio normal do ambiente interior

51 - 100

IV condio ruim do ambiente interior

> 100

Padres brasileiros para qualidade microbiolgica do ambiente

de indstrias alimentcias no existem em legislao. O trabalho de Kurata
(1994) define padres que podem servir de base para elaborao de
padres nacionais, entretanto, devemos considerar nossas condies
ambientais tropicais, o que torna estudos em nossas condies ambientais
indispensveis.

2.2 Mtodos para avaliar a qualidade do ar

Segundo Flannigan & Miller (1994), muitos trabalhos tm sido
publicados sobre a presena de fungos no ar de interiores e relatam o
nmero de unidades formadores de colnias (cfu/m3 de ar), alguns
relatam sobre gneros e poucos sobre a identificao de espcies,
especialmente de gneros mais complexos como Aspergillus, Fusarium e
Penicillium. Os autores ressaltam que ateno insuficiente tem sido dada
com relao ao desempenho do amostrador, tempo de permanncia dos
esporos no ar entre as coletas, meio de cultura utilizado e a identificao
dos fungos.
Os microrganismos viveis do ar podem ser determinados por
uma srie de mtodos como: sedimentao, impactao em superfcies
slidas, filtrao, centrifugao e precipitao eletrosttica (Pelczar et al.,
1981; Sveum et al., 1992). Dentre estes, os mais utilizados so os de
sedimentao e impactao em superfcies slidas. Os mtodos de
sedimentao possuem vrias desvantagens, incluindo a quantificao de
microrganismos no ar, ou seja, o nmero de partculas viveis/m3 de ar,
com

baixa

correlao,

quando

comparada

com

outros

mtodos

quantitativos. J o mtodo de impactao, permite que sejam coletados

volumes conhecidos de amostras, possibilitando a quantificao por m3.
A World Health Organization (1988), no que se refere qualidade
do ar de ambiente interno, ressalta que os mtodos de amostragem para
plen, bactrias especficas e vrus esto prximos da padronizao, o
que no ocorre para fungos, micotoxinas e outros materiais biolgicos.
Este fato permanece nos dias atuais.
Pitt & Hocking (1997) citam que o mtodo mais simples para
amostragem do ar o da sedimentao. Entretanto, os autores ressaltam
que a amostragem volumtrica do ar, atravs de um equipamento de
impactao, um indicador mais confivel da qualidade do ar.

10

Visando

estabelecer

padronizao

na

amostragem

de

microrganismos transportados pelo ar, Buttner & Stetzenbach (1993),

conduziram um experimento em laboratrio para determinar a recuperao
desses microrganismos utilizando um marcador biolgico como controle.
Quantidades conhecidas de esporos de Penicillium chrysogenum foram
produzidas e inoculadas em uma rea fechada, seguido de coletas com
diferentes equipamentos impactadores, como: Andersen six stage,
Surface Air System, Burkart e Depositional. Os

amostradores

Andersen e Burkard recuperaram o mais alto nmero de esporos

comparados com a medida padro de P. chrysogenum.
A importncia do mtodo de amostragem, seja para buscar
padres ambientais ou selecionar meios de cultivo, que o mesmo
permita reduzir ao mnimo as variveis da coleta, como: volume amostrado
e tempo de coleta. Dentre os mtodos mais utilizados o de impactao
proporciona coletas pontuais e rpidas com volumes definidos, elevando a
confiana dos dados obtidos.

3 MATERIAL E MTODOS

3.1 Material

3.1.1 Amostrador microbiolgico de ar

Empregou-se um amostrador microbiolgico de ar da marca

MERCK denominado MAS-100 (Figura 1), um instrumento do tipo
impactador, que aspira o ar atravs de uma placa perfurada. O ar
aspirado, que contm as partculas presentes no ar ambiente, atinge
diretamente a superfcie de uma placa de Petri de 90 mm, que aps o ciclo
de coleta ter-se completado incubada e as colnias so contadas e
expressas como unidades formadoras de colnias (ufc/m3).
Caractersticas do equipamento: taxa nominal do fluxo de ar = 100 L/min
2,5%; nveis de volumes de amostras de ar pr-definidos: 10, 20, 50, 100,
200, 250, 500, 750 e 1000 litros; nveis de volumes de amostras de ar
usados nas coletas: variaram de 100 a 500L, sendo que a maioria das
coletas foi efetuada em 250L. A escolha esteve em funo da
contaminao esperada nos ambientes estudados. De qualquer forma, as
coletas por amostrador de ar tipo impactador no devem exceder 10
minutos sob pena de secagem do meio de cultura. O equipamento
compensa para os fatores que podem interferir no fluxo de ar escolhido
tais como, o volume de gar na placa de Petri ou variao no dimetro da
mesma.

12

3.1.2 Meios de Cultura

Os meios de cultura foram elaborados conforme especificado a

seguir:

A) Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC) (Food and drug

administration, 1998; Pitt & Hocking, 1997)
Glicose.................................................................................................10,0 g
Peptona Bacteriolgica..........................................................................5,0 g
Fosfato de Potssio, monobsico..........................................................1,0 g
Sulfato de Magnsio, heptahidratado.....................................................0,5 g
Rosa bengala (soluo 5%., p/v)........................................................0,5 mL
Dicloran (2,6-dicloro-4-nitroanilina) (soluo 0,2%,p/v, em etanol).....1,0 mL
Cloranfenicol..........................................................................................0,1 g
gua destilada...........................................................................................1 L
gar......................................................................................................15,0 g
pH final 5,6
Os ingredientes foram misturados, o meio foi aquecido at
dissoluo do gar, completando o volume para 1000mL e esterilizado em
autoclave a 121C por 15 minutos; esfriado em banho maria a 50C e
distribudo em placa (15 a 20 mL por placa) sob condies asspticas.
O DRBC um meio especialmente indicado para analisar amostras
contendo fungos que se espalham como Mucor e Rhyzopus, pois, o
dichloran e a rosa bengala, efetivamente, diminuem o crescimento dos
fungos de crescimento rpido e, propiciam a deteco de outros
propgulos de fungos e leveduras, que tm menor taxa de crescimento.

13

B) Dichloran 18% Glycerol Agar (DG18) (Food and drug administration,

1998; Pitt & Hocking, 1997)
Glicerol............................................................................................220,0 g
Glicose..............................................................................................10,0 g
Peptona..................................................................................................5,0 g
Fosfato de potssio monobsico............................................................1,0 g
Sulfato de magnsio heptahidratado......................................................0,5 g
Dicloran (0,2%, p/v, em etanol)...........................................................1,0 mL
gar......................................................................................................15,0 g
Cloranfenicol..........................................................................................0,1 g
gua destilada...........................................................................................1 L
pH final 5,6
Os

ingredientes

acima

foram

misturados

fervidos

at

dissoluo do gar, e em seguida o volume acertado para 1000 mL com

gua destilada. Adicionou-se 220 g de glicerol e o meio foi esterilizado a
121C por 15 min. Foi submetido a resfriamento a 50C e distribudo em
placas de Petri sob condies asspticas. A baixa atividade de gua desse
meio reduz interferncia de bactrias e fungos de crescimento rpido.

C) Plate Count Agar (PCA) (Food and drug administration, 1998; Pitt &
Hocking, 1997)
Triptona..................................................................................................5,0 g
Extrato de levedura................................................................................2,5 g
Dextrose.................................................................................................1,0 g
gar......................................................................................................15,0 g
gua destilada...........................................................................................1 L
pH final 7,0 0,2
Os ingredientes foram dissolvidos e o meio aquecido at
dissoluo do gar, resfriado e adicionado de 100 mg de cloranfenicol por

14

litro, para deteco de fungos e leveduras, e, sem antibitico para

contagem de bactrias mesfilas aerbias. Em seguida foi autoclavado a
121C por 15 minutos, resfriado a 50C e distribudo em placas de Petri
sob condies asspticas.
D) Malt Agar (MA) (Food and drug administration, 1998; Pitt & Hocking,
1997)
Extrato de malte, em p.......................................................................20,0 g
gar......................................................................................................20,0 g
gua destilada...........................................................................................1 L
Os ingredientes foram misturados, fervidos para dissoluo do
gar e o meio foi esterilizado a 121C por 15 minutos. Em seguida foi
esfriado a 50C e

distribudo em placas de Petri sob condies

asspticas.
E) Malt Extract Agar - Yeast and Molds (MEAYM) (Food and drug
administration, 1998; Pitt & Hocking, 1997)
Extrato de malte, em p.......................................................................20,0 g
Glicose.................................................................................................20,0 g
Peptona..................................................................................................1,0 g
gar......................................................................................................20,0 g
gua destilada...........................................................................................1 L
pH final 5,4
Os ingredientes foram misturados, fervidos para dissoluo do
gar e o meio foi esterilizado a 121C por 15 minutos. Em seguida foi
resfriado a 50C e

distribudo em placas de Petri sob condies

asspticas. (Esse meio recomendado para Aspergillus e Penicillium).

15

F) Batata Dextrose Agar (BDA) (Food and drug administration, 1998; Pitt
& Hocking, 1997)
Infuso de batata....................................................................................4,0 g
Dextrose...............................................................................................20,0 g
gar......................................................................................................20,0 g
gua destilada...........................................................................................1 L
pH final 4,0 4,5 0,2
O meio foi preparado e esterilizado conforme indicao do
fabricante. Aps esterilizao foi adicionado cerca de 1 mL de soluo de
cido tartrico a 10%, para cada 100 mL de meio, a fim de se obter pH
4,0-4,5.
G) Sabouraud Dextrose a 4% Agar (Food and drug administration, 1998)
Polipeptona ou neopeptona.................................................................10,0 g
Dextrose...............................................................................................40,0 g
gar......................................................................................................15,0 g
gua destilada...........................................................................................1 L
pH final 5,6 0,2
Meio normalmente indicado no cultivo e identificao de fungos
patognicos (Lacaz et al., 1998).
H) Oxytetracycline Glucose Yeast Agar (OGY) (Pitt & Hocking, 1997)
Glucose................................................................................................20,0 g
Extrato de Levedura...............................................................................5,0 g
gar......................................................................................................15,0 g
gua destilada...........................................................................................1 L
Os ingredientes foram misturados, fervidos para dissoluo do gar
e o meio foi esterilizado a 121C por 15 minutos. Esfriado a 50C, foi
adicionado de 10 mL de oxitetraciclina esterilizada por filtrao e, em
seguida distribudo em placas de Petri sob condies asspticas.

16

3.2 Mtodos

A metodologia descrita est distribuda em duas fases de

execuo. A primeira fase props avaliar o desempenho dos meios de
cultura, atravs de parmetros utilizados para a escolha de um meio
potencialmente melhor, a ser utilizado na enumerao total e a presena
de interferentes (fungos de crescimento rpido).
Tambm foi avaliada a presena de bactrias totais mesfilas
aerbias, em Plate Count Agar (PCA), visando conhecer as condies do
ambiente em relao a esse grupo de microrganismos e, ainda, fornecer
dados para uma possvel relao com o desenvolvimento de fungos nos
meios estudados.
A

segunda

fase

foi

realizada

utilizando

os

dois

meios

estatisticamente eleitos como os melhores. Em paralelo foi avaliado

nesses meios o crescimento de algumas espcies patognicas e
toxignicas durante a fase de incubao estipulada de cinco a sete dias.
De acordo com Padro Referencial Brasileiro Microbiolgico
(1998), entre os fungos patognicos no admitidos nos ambientes esto:
Histoplasma capsulatum, Cryptococcus neoformans e Paracoccidiodes
brasiliensis. Entre os fungos toxignicos no admitidos nos ambientes
esto: Aspergillus fumigatus, A. parasiticus, A. flavus, Stachybotrys atra e
Fusarium moniliforme.

3.2.1 Coleta das Amostras

A amostragem foi realizada em dois locais distintos de

processamento de alimentos, a saber: indstria de doces (produo de
doce de leite e de doce de amendoim) e frigorfico (empacotamento e
produo de embutidos crneos). Na primeira fase foram realizadas

17

coletas peridicas em diferentes pocas: indstria de doces entre maio de

2000 e janeiro de 2001; frigorfico entre setembro de 2000 e janeiro de
2001. Coletou-se de cada ambiente trs placas para cada meio de cultura
mencionado no item 3.1.2. J na segunda fase foram realizadas coletas
entre junho e julho de 2001 nos mesmos locais da primeira fase, porm
utilizando-se somente os dois meios selecionados, Sabouraud e DRBC,
coletando-se cinco placas para cada meio de cultura em cada um dos
pontos amostrados.

3.2.2 Incubao

Aps as coletas, as placas foram incubadas em estufa tipo BOD.

Para a contagem total de fungos e a avaliao do crescimento de espcies
toxignicas e patognicas empregou-se a temperatura de 281C por
cinco a sete dias; na contagem total de bactrias mesfilas a temperatura
de 361C por 24-48 horas.

3.2.3 Contagem de unidades formadoras de colnias de fungos e

bactrias

O nmero de unidades formadoras de colnias foi contado em

cada placa e o resultado foi corrigido com a ajuda de uma tabela de
correo estatstica "Feller" (Quadro 19) e, em seguida calculou-se o
nmero de ufc/m3.
O mtodo de correo estatstica baseia-se no seguinte princpio:
quanto maior a quantidade de microrganismos em cada amostragem,
maior a probabilidade de que vrios microrganismos entrem pelo mesmo
orifcio da placa perfurada. Foi utilizada uma tabela de converso para
clculo, aplicando-se a frmula Feller citado por MERCK (s.d.).

18

3.2.4 Avaliao estatstica dos resultados de contagem

Os dados de ufc/m3 (unidades formadoras de colnias por m3)
foram submetidos a teste diagnstico, visando verificar a homogeneidade de
varincia, segundo Nogueira (1991). Diante dos resultados obtidos nesta
anlise, os dados foram transformados em

ufc / m 3 . A anlise da varincia

foi realizada no esquema do delineamento inteiramente casualizado, por

ambiente avaliado, e considerando todos os ambientes, segundo o modelo
matemtico:

Yij = u + ti + eij , sendo:

Yij= o valor observado no i-simo meio de cultura da j-sima
repetio;
u = a mdia geral dos valores observados;
ti = o efeito do i-simo tratamento;
eij = erro aleatrio atribudo observao Yij.
Detectada a significncia do Teste F, as mdias dos tratamentos
foram comparadas atravs do Teste de Tukey (5% de significncia).
As

anlises

foram

realizadas

atravs

dos

procedimentos

estatsticos SAS (Statistical Analysis System).

3.2.5 Avaliao qualitativa dos resultados

3.2.5.1 Identificao dos fungos presentes

Seguiu-se a identificao direta nos meios utilizados, aps o

perodo de incubao estabelecido. As colnias foram observadas em
estereomicroscpio para observao do tipo e local das estruturas

19

esporulantes. Para o exame microscpico foram preparadas lminas em

gua e/ou coradas com lactofenol com pequenos pedaos das bordas das
colnias, levando parte do miclio e das estruturas de frutificao, para
observao das caractersticas morfolgicas: tipo de miclio (septado ou
no); estrutura (tamanho, cor e textura) do conidiforo e condios/
esporngios e esporangiforos e estruturas de resistncia (clamidosporos)
ou estruturas contendo esporos como clestotcio.
Esses dados foram comparados s chaves de classificao
dadas por Barnett & Hunter (1972), Pitt & Hocking (1997), Lacaz et al.
(1998).

3.2.5.2 Avaliao dos meios de cultivo e identificao dos fungos

patognicos e toxignicos e estudo de bactrias

Foram adquiridas culturas puras das espcies de fungos

patognicas e toxignicas.
Durante as coletas da segunda fase foi conduzida, em paralelo, a
inoculao das placas contendo os meios DRBC e Sabouraud com
culturas puras de Aspergillus flavus, A. fumigatus, A. niger, A. parasiticus,
Fusarium

moniliforme, F. verticulloides,

Histoplasma

capsulatum

Stachybotrys chartarum. As placas foram incubadas durante sete dias em

estufas separadas daquelas das coletas e monitoradas com relao ao
crescimento e caractersticas morfolgicas dos fungos durante o perodo
de incubao. Esse acompanhamento teve como objetivos facilitar a
identificao de uma possvel presena destes fungos nos ambientes
avaliados e certificar o crescimento dos mesmos nos meios DRBC e
Sabouraud.

4 RESULTADOS E DISCUSSO

4.1 Avaliao quantitativa

De acordo com os resultados obtidos, observa-se que houve

diferena significativa na maioria dos locais amostrados entre os meios
utilizados (Quadros 1 e 2), com exceo dos pontos produo de doce de
leite da terceira coleta (Quadro 1) e empacotamento de embutidos da
primeira coleta (Quadro 2). A primeira amostragem aponta o meio DRBC
com melhor desempenho na indstria de doces nos dois pontos
amostrados, rea de produo de leite e amendoim (Quadro 1), tendo
como meio de menor contagem de fungos o Extrato de Malte.
Na necessidade de trabalhar com um nmero maior de meios de
cultura, optou-se por utilizar meios reconhecidos na rea de alimentos.
Desta forma foram conduzidas amostragens com os seguintes meios:
DRBC, DG18, PCA-Cloranfenicol, BDA, MA e MEAYM. Duas amostragens
foram conduzidas com os meios acima, uma correspondente primeira
coleta da rea frigorfica (Quadro 2) e uma outra representando a
segunda, da indstria de doces (Quadro 1). Na indstria de doces, o meio
DRBC foi o que apresentou melhor desempenho, porm no houve
diferena estatstica com o DG18 na rea de produo de doce de
amendoim. Os meios MA, MEAYM e BDA aparecem significativamente,
como os de menor performance quando testados em ambientes de
produo de doces em geral (Quadro 1).

21

Quando a Resoluo RE n0 176 de 24 de outubro e 2000 do

Ministrio da Sade do Brasil foi publicada, concluiu-se que era importante
a incluso do meio Sabouraud Dextrose a 4% gar, indicado juntamente
com BDA e MA, como os principais meios para amostragem de ar.
Portanto,

aquele

meio

foi

incorporado

nas

demais

coletas.

comportamento desses meios na indstria de doces apresentou diferena

significativa apenas na rea de amendoim, indicando o meio de MA e BDA
como os de menor desempenho (Quadro 1). J nas coletas da rea
frigorfica, o meio DRBC, embora aparea como o melhor na segunda
coleta

na

rea

de

empacotamento

de

embutidos,

no

difere

estatisticamente do meio Sabouraud Dextrose a 4% gar na rea de

produo de embutidos, sendo os de menor desempenho o PCACloranfenicol, BDA, MA e MEAYM (Quadro 2).

22

ufc/m 3

Data
De coleta

Ambiente

Meio de
Cultura

Mai/00

Produo de

DRBC

1170

Doce de Leite

Produo de
Doce de Amendoim

Ago/00

Produo de
Doce de Leite

Jan/01

BDA

680

OGY

652

MA

440

DRBC

1030

BDA

872

ab

OGY

860

ab

MA

536

DRBC

6926

DG18

4611

PCA-Clor

4315

BDA

3510

bc

MA

2961

bc

MEAYM

2385

Produo de

DRBC

5080 a

Doce de Amendoim

DG18

4238 ab

PCA-Clor

3696 abc

BDA

2698 bcd

MEAYM

2141 cd

Produo de
Doce de Leite

Produo de
Doce de Amendoim

MA
SABOURAUD
PCA-Clor
DRBC
MEAYM
BDA
DG18
MA
DRBC
SABOURAUD
PCA-Clor
DG18
MEAYM
MA
BDA

1931
1196
1033
883
770
740
673
613
1270
1106
1070
1036
893
596
380

d
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
ab
ab
bc
c

Quadro 1 Unidades formadoras de colnias/m 3 (valores mdios) em

diferentes meios de cultura, nos ambientes de produo
de doce de leite e de amendoim.
1

Mdias seguidas da mesma letra na coluna no diferem entre si pelo teste

de Tukey ( 5% de significncia)

23

ufc/m 3

Data
De coleta

Ambiente

Meio de
cultura

Set/00

Empacotamento de
Embutidos

MEAYM
DG18
DRBC
PCA-Clor
BDA
MA
MEAYM
BDA
PCA-Clor
DRBC
DG18
MA
DRBC
DG18
SABOURAUD
BDA
MEAYM
MA
PCA-Clor
SABOURAUD
DRBC
DG18
MEAYM
MA
BDA
PCA-Clor
SABOURAUD
DRBC
PCA-Clor
MA
MEAYM

563
530
523
470
383
230
2300
1573
1210
1003
910
390
2246
1130
1126
1106
906
656
623
5703
5696
3040
2456
2143
1876
1503
1410
510
473
453
366

a
a
a
a
a
a
a
ab
b
b
b
c
a
b
b
b
b
b
b
a
ab
bc
c
c
c
c
a
b
b
b
b

BDA
DG18
SABOURAUD
DRBC
MEAYM
PCA-Clor
MA
BDA
DG18

336
300
2550
1023
866
796
730
523
490

b
b
a
ab
b
b
b
b
b

Produo de
Embutidos

Dez/00

Empacotamento de
Embutidos

Produo de
Embutidos

Jan/01

Empacotamento de
Embutidos

Produo de
Embutidos

Quadro 2 - Unidades formadoras de colnias/m 3 (valores mdios) em

diferentes meios de cultura, nos ambientes de
empacotamento e de produo de embutidos.
1

Mdias seguidas da mesma letra na coluna no diferem entre si pelo teste

de Tukey ( 5% de significncia)

24

O Quadro 3 apresenta as contagens obtidas para os diferentes

meios de cultura, em ufc/m3, envolvendo todos os ambientes e pocas de
coleta, podendo observar que os meios DRBC e Sabouraud Dextrose a
4% gar se apresentam como os melhores para a realizao de contagem
de fungos no ar. Por outro lado, o meio de Malte mostrou-se,
significativamente, como o menos indicado para o mesmo propsito.

Meio de
Cultura

Nmero de
repeties

DRBC

36

2280

a1

SABOURAUD

18

2182

DG18

30

1696

ab

PCA-Clor

30

1519

ab

MEAYM

30

1365

ab

BDA

36

1223

ab

Mdia
em ufc/m3

MA
36
973
b
Mdia Geral
1564
Coeficiente de Variao em %
43,92
Teste F
3,54**
3
Quadro 3 - Contagem em ufc/m , de fungos, em diferentes meios
de cultura envolvendo todos os ambientes e pocas de
coleta.
1

Mdias seguidas da mesma letra na coluna no diferem entre si pelo teste

de Tukey ( 5% de significncia)

25

O meio DRBC teve o mesmo desempenho em outros estudos,

como nos desenvolvidos por King et al.(1979), motivo pelo qual este meio
foi adotado pelos principais guias de microbiologia de alimentos (Acuff,
1992; Tournas et al.,1998). Estes resultados eram esperados devido sua
composio, que tem como inibidores a Rosa Bengala e o Dichloran,
restringindo o tamanho das colnias e o Chloramphenicol como inibidor de
bactrias. Esses fatos podem estar justificando que, em termos numricos,
o meio MA tenha tido o menor desempenho, uma vez que certos gneros
como, Crysonilia, Mucor e Rhizopus microrganismos que tm crescimento
rpido, estiveram presentes, crescendo descontroladamente e dificultando
o desenvolvimento de outros gneros presentes.
Os resultados obtidos na segunda fase do projeto com os meios
DRBC e Sabouraud esto apresentados nos Quadros 4 e 5. De modo
geral os meios no diferiram estatisticamente durante as amostragens nas
indstrias de doces e frigorfico. O meio DRBC apresentou melhor
desempenho em duas coletas na rea de empacotamento de embutidos e
em uma coleta na rea de produo de doce de leite. Tal fato pode estar
relacionado com a peculiaridade do meio em restringir o crescimento de
bactrias, proporcionando melhor desenvolvimento dos fungos, uma vez
que uma alta incidncia de bactrias principalmente na rea de produo
de embutidos, foi verificada durante a primeira fase do projeto (Quadro
18).

26
Data de
Coleta
20/06/01

Ambiente
Produo de doce de
amendoim
Produo de doce de
leite

27/06/01

Produo de doce de
amendoim
Produo de doce de
leite

04/07/01

Produo de doce de
amendoim
Produo de doce de
leite

Meio de
cultura
DRBC
SABOURAUD
DRBC
SABOURAUD
DRBC
SABOURAUD
DRBC
SABOURAUD
DRBC
SABOURAUD
DRBC
SABOURAUD

ufc/m

370
408
412
432
440
452
658
460
1210
903
688
588

a
a
a
a
a
a
a
b
a
a
a
a

Quadro 4 - Unidades formadoras de colnias/m3 (valores mdios de cinco

repeties) nos meios de cultura DRBC e Sabouraud, nos
ambientes de produo de doce de leite e de amendoim.
1

Mdias seguidas da mesma letra na coluna no diferem entre si pelo teste de

Tukey ( 5% de significncia)

Data de
Coleta
20/06/01

Ambiente
Empacotamento de
Embutidos
Produo de
Embutidos

27/06/01

Empacotamento de
Embutidos
Produo de
Embutidos

04/07/01

Empacotamento de
Embutidos
Produo de
Embutidos

Meio de
Cultura
DRBC
SABOURAUD
DRBC
SABOURAUD
DRBC
SABOURAUD
DRBC
SABOURAUD
DRBC
SABOURAUD
DRBC
SABOURAUD

ufc/m
442
282
512
518
498
466
722
475
1654
828
1454
1068

a
b
a
a
a
a
a
a
a
b
a
a

Quadro 5 - Unidades formadoras de colnias/m 3 (valores mdios de cinco

repeties) nos meios de cultura DRBC e Sabouraud, nos
ambientes de empacotamento e de produo de embutidos.
1

Mdias seguidas da mesma letra na coluna no diferem entre si pelo teste de

Tukey ( 5% de significncia)

27

4.2 Avaliao qualitativa

A avaliao qualitativa visou na primeira fase, identificar os

gneros de maior ocorrncia e presentes no perodo estipulado de
incubao, isto , foram identificados somente aqueles que apresentaram
suas estruturas de frutificao necessrias para sua identificao.
Assim, os Quadros de 6 a 9 apresentam os gneros de fungos
encontrados nos meios avaliados. O gnero Cladosporium, comum em
ambientes interiores que no apresentam problemas de sade (Lacaz,
1970; Padro Referencial Brasileiro Microbiolgico, 1998), foi encontrado
nos ambientes avaliados crescendo em 100% dos meios testados. Dos
gneros encontrados nos perodos de avaliao, apenas dois deles podem
conter espcies toxignicas indesejveis para qualquer ambiente (Padro
Referencial Brasileiro Microbiolgico, 1998), a saber: Aspergillus e
Fusarium. Quanto ao outro gnero toxignico citado, o Stachybotrys e os
patognicos dos gneros Histoplasma, Cryptococcus e Paracoccidioides,
esses no puderam ser detectados em nenhum dos meios empregados no
perodo de avaliao considerado, porque se estiveram presentes, no
apresentaram
identificao.

as

caractersticas

morfolgicas

necessrias

sua

MEIOS DE CULTURA
% M/G

%C/TC

GNEROS

MA

MEAYM

BDA

DRBC

DG18

PCA-Clor

SABOURAUD

Aspergillus

100

75

Cladosporium

100

87

Chrysonilia

86

56

Trichoderma

86

50

Mucor

43

31

Penicillium

86

56

Paecilomyces

14

Rhizopus

14

Total de Coleta/Meio

Quadro 6 - Gneros de fungos desenvolvidos em diferentes meios de cultura no ambiente de produo de doce de leite.
1

%M/G = % de meios de cultura que permitiu o crescimento do gnero em relao ao nmero total de meios de cultura testados.

%C/TC = % de coletas onde ocorreu a presena do gnero em relao ao nmero total de coletas realizadas.

MEIOS DE CULTURA
% M/G

%C/TC

GNEROS

MA

MEYAM

BDA

DRBC

DG18

PCA-Clor

SABOURAUD

Aspergillus

100

88

Cladosporium

100

100

Chrysonilia

57

31

Trichoderma

71

50

Mucor

71

31

Penicillium

71

62

Paecilomyces

14

Rhizopus

71

31

Fusarium

14

Aerobasidium

14

Total de Coleta/Meio

Quadro 7 - Gneros de fungos desenvolvidos em diferentes meios de cultura no ambiente de produo de doce de amendoim.
1

%M/G =% de meios de cultura que permitiu o crescimento do gnero em relao ao nmero total de meios de cultura testados.

%C/TC = % de coletas onde ocorreu a presena do gnero em relao ao nmero total de coletas realizadas.

MEIOS DE CULTURA
% M/G

%C/TC

GNEROS

MA

MEAYM

BDA

DRBC

DG18

PCA-Clor

SABOURAUD

Aspergillus

43

22

Cladosporium

100

100

Chrysonilia

71

39

Trichoderma

28

11

Alternaria

28

11

Mucor

28

11

Penicillium

86

50

Paecilomyces

14

Rhizopus

14

Curvularia

43

22

Total de Coleta/Meio

Quadro 8 - Gneros de fungos desenvolvidos em diferentes meios de cultura no ambiente de empacotamento de embutidos.
1

%M/G = % de meios de cultura que permitiu o crescimento do gnero em relao ao nmero total de meios de cultura testados.

%C/TC =% de coletas onde ocorreu a presena do gnero em relao ao nmero total de coletas realizadas.

MEIOS DE CULTURA
% M/G

%C/TC

GNEROS

MA

MEAYM

BDA

DRBC

DG18

PCA-Clor

SABOURAUD

Aspergillus

57

28

Cladosporium

100

100

Chrysonilia

28

17

Trichoderma

28

11

Alternaria

57

22

Mucor

14

Penicillium

100

72

Paecilomyces

57

22

Rhizopus

14

Curvularia

57

22

Total de Coleta/Meio

Quadro 9 - Gneros de fungos desenvolvidos em diferentes meios de cultura no ambiente de produo de embutidos.
1

%M/G =% de meios de cultura que permitiu o crescimento do gnero em relao ao nmero total de meios de cultura testados.

%C/TC = % de coletas onde ocorreu a presena do gnero em relao ao nmero total de coletas realizadas.

32

Face diversidade de gneros identificados em cada um dos

meios utilizados, torna-se difcil afirmar qual meio seria o mais indicado
para o isolamento de determinado gnero de fungo. Somente em termos
quantitativos que este trabalho permite identificar meios melhores para o
isolamento de fungos.
Os Quadros de 10 a 17 mostram que espcies indesejveis
como Aspergillus flavus, A. fumigatus, A. niger, A. parasiticus, Fusarium
moniliforme, F. verticulloides, Histoplasma capsulatum e Stachybotrys
chartarum podem crescer nos meios Sabourand e DRBC, isto quando
inoculadas sem a presena de outros gneros de fungos. Para a
identificao de fungos, de grande importncia se conhecer a ocorrncia
de diferentes cores e tonalidades das colnias em cada meio de cultivo,
devido ao grande valor das caractersticas morfolgicas/culturais na
identificao dos mesmos.
Na segunda fase, a espcie Aspergillus flavus foi isolada a partir
do meio Sabouraud no ambiente da indstria de alimentos, na rea de
processamento de doces de amendoim, sendo identificada no meio
Aspergillus Flavus Parisiticus gar (Vanderzant & Splittstoesser, 1992).

Espcie
Meio de Cultura
Incubao em dias
dimetro da colnia
cor
Meio de Cultura
Incubao em dias
dimetro da colnia
cor

1
4,2mm

2
1,51cm

branco

branco

1
8,8mm
branco

2
2,63cm
branco

Aspergillus parasiticus
DRBC
3
4
5
6
7
2,1cm
2,8cm
3,0cm
3,83cm
4,12cm
amarelo
amarelo
amarelo
amarelo
marrom
claro
claro
SABOURAUD
3
4
5
6
7
4,43cm
5,33cm
tomou a placa
branco
branco
branco
amarelo
amarelo

Quadro 10 - Dimetro e cor das colnias de Aspergillus parasiticus ao longo do perodo de incubao.

Espcie
Meio de Cultura
Incubao em dias
dimetro da colnia
cor
Meio de Cultura
Incubao em dias
dimetro da colnia
cor

Aspergillus fumigatus
DRBC
3
4
5
5,5mm
1,08cm
2,16cm
rosa
branco
branco
SABOURAUD
3
4
5

6
2,8cm
branco

7
3,0cm
branco

7
tomou a
placa
branco

1
0
.

2
0
.

8,0mm

2,1cm

3,33cm

5,41cm

6,6cm

branco

branco

branco

branco

branco

Quadro 11 - Dimetro e cor das colnias de Aspergillus fumigatus ao longo do perodo de incubao.

Espcie
Meio de Cultura
Incubao em dias
dimetro da colnia

1
5,7mm

cor

branco

Meio de Cultura
Incubao em dias
dimetro da colnia

1
9,0mm

2
3,1cm

cor

branco

amarelo
claro

2
1,25cm
amarelo
claro

Aspergillus niger
DRBC
3
4
5
2,52cm
3,74cm
5,0cm
amarelo
amarelo
preto
claro
claro
SABOURAUD
3
4
5
6,0cm
7,71cm
centro
centro
amarelo
amarelo
com pontos com pontos
preto
pretos e
pretos e
borda
borda
branca
branca

6
7
tomou a placa
preto

preto

6
tomou a placa

preto

preto

6
4,06cm

7
4,06cm

marrom

marrom

6
4,95cm

7
4,95cm

marrom

marrom

Quadro 12 - Dimetro e cor das colnias de Aspergillus niger ao longo do perodo de incubao.

Espcie
Meio de Cultura
Incubao em dias
dimetro da colnia

1
3,1mm

cor

branco

Meio de Cultura
Incubao em dias
dimetro da colnia

1
5,5mm

2
1,64cm

cor

branco

branco

2
8,5mm
amarelo
claro

Aspergillus flavus
DRBC
3
4
5
1,35cm
2,1cm
3,17cm
amarelo
amarelo
amarelo
claro
claro
SABOURAUD
3
4
5
2,45cm
3,48cm
4,0cm
amarelo
amarelo
amarelo
claro
claro

Quadro 13 - Dimetro e cor das colnias de Aspergillus flavus ao longo do perodo de incubao.

Espcie
Meio de Cultura
Incubao em dias
dimetro da colnia
cor
Meio de Cultura
Incubao em dias

1
3,0mm
branco

2
6,7mm
branco

dimetro da colnia

3,0mm

1,67cm

2,89cm

3,91cm

4,45cm

4,72cm

cor

branco

branco

rosa claro

rosa claro

rosa claro

Fusarium verticulloides
DRBC
3
4
5
1,2cm
1,76cm
2,04cm
rosa claro rosa claro rosa claro
SABOURAUD
3
4
5

6
2,55cm
lils

7
3,43cm
lils

lils

7
tomou a
placa
lils

6
3,31cm

7
3,93cm

amarelo
claro

amarelo

Quadro 14 - Dimetro e cor das colnias de Fusarium verticulloides ao longo do perodo de incubao.

Fusarium moniliforme
DRBC
3
4
5
1,84cm
2,37cm
2,52cm
centro
centro
centro
branco e
branco e
branco e
borda rosa borda rosa borda rosa
SABOURAUD
3
4
5

Espcie
Meio de Cultura
Incubao em dias
dimetro da colnia

1
3,0mm

2
1,1cm

cor

branco

branco

Meio de Cultura
Incubao em dias

dimetro da colnia

4,2mm

2,47cm

4,1cm

5,76cm

6,95cm

7,52cm

cor

branco

branco

branco

branco

branco

amarelo
claro

Quadro 15 - Dimetro e cor das colnias de Fusarium moniliforme ao longo do perodo de incubao.

7
tomou a
placa
amarelo
claro

Espcie
Meio de Cultura
Incubao em dias
dimetro da colnia
cor
Meio de Cultura
Incubao em dias
dimetro da colnia
cor

1
1,6mm
levemente
marrom

2
4,3mm
levemente
marrom

1
1,6mm
levemente
marrom

2
4,0mm
levemente
marrom

Stachybotrys chartarum
DRBC
3
4
5
6,1mm
6,5mm
6,5mm
marrom
marrom
marrom
claro
claro
claro
SABOURAUD
3
4
5
6,4mm
7,9mm
7,9mm
marrom
marrom
marrom
claro
claro
claro

6
8,87mm

7
8,87mm

marrom

marrom

6
10,17mm

7
10,17mm

marrom

marrom

Quadro 16 - Dimetro e cor das colnias de Stachybotrys chartarum ao longo do perodo de incubao.

Espcie
Meio de Cultura
Incubao em dias
dimetro da colnia

1
1,9mm

2
6,1mm

Histoplasma capsulatum
DRBC
3
4
5
1,4cm
1,59cm
1,89cm

cor

branco

branco

branco

branco

branco

Meio de Cultura
Incubao em dias
dimetro da colnia

1
3,4mm

2
6,85mm

3
1,15cm

SABOURAUD
4
2cm

5
2,31cm

cor

branco

branco

branco

branco

branco

6
1,89cm
levemente
verde

7
2,0cm
levemente
verde

6
2,31cm
levemente
verde

7
2,7cm
levemente
verde

Quadro 17- Dimetro e cor das colnias de Histoplasma capsulatum ao longo do perodo de incubao.

37

4.3 Avaliao da contagem total de bactrias

Tendo em vista, que poucos pesquisadores no mundo sugeriram

padres referenciais em relao qualidade microbiolgica do ar, para
estruturas bacterianas, a presente pesquisa, coletou dados que podem vir
a ser teis, por ocasio de estudos para estabelecimento de padres
nacionais.
Segundo Padro Referencial Brasileiro Microbiolgico (1998), os
ambientes no apresentam situaes problemticas, quando bactrias
Gram-positivas, como Micrococcus sp, Streptococcus sp e Staphylococcus
sp predominarem no ambiente, em populaes abaixo de 200 ufc/ m3.
Apesar de no ter sido realizado o teste Gram, os ambientes avaliados
apresentaram populaes de bactrias que merecem ateno especial
pelos altos valores observados.
No Quadro 18 so apresentadas as contagens de bactrias
(ufc/m3) nos ambientes estudados.

Data de

Ambientes

coleta

Doce de leite

Doce de amendoim

Mai/00

622

645

Ago/00

331

223

Jan/01

426

446

Data de

Ambientes

coleta

Produo de Embutidos

Empacotamento de Embutidos

Set/00

820

906

Dez/00

2380

2926

Jan/01

3946

2456
3

Quadro 18 - Unidades formadoras de colnias/m (valores mdios) de bactrias

nos diferentes ambientes amostrados (mdias de trs repeties).

38

Nos ambientes estudados foram encontrados mdias, entre as

trs coletas, de 449 e 2239 ufc de bactrias/m3, para indstria de doces e
frigorfico,

respectivamente. Os dados encontrados sugerem que novos

estudos sejam realizados, no sentido de caminhar para um padro

referencial que possa ser utilizado no monitoramento dos ambientes de
processamento de alimentos.

4.4 Avaliao ambiental das instalaes amostradas

O parmetro empregado na avaliao ambiental restringiu-se

aos resultados de contagem de propgulos de fungos, em valores
absolutos, considerando-se que um ambiente est em boas condies, se
apresentar valor de contagem igual ou menor que 750 ufc/m3 e no houver
espcies toxignicas e ou patognicas (Resoluo no 176).
Partindo deste princpio, os meios de cultura que apresentaram
baixa contagem estariam na maioria dos casos avaliando os ambientes
amostrados como em boas condies (Quadros 1 e 2), o que de fato no
o real, pois quando se consideram as contagens em DRBC e Sabouraud
Dextrose a 4% Agar, esses mesmos ambientes tornam-se passveis de
avaliao quanto fonte de contaminao e preocupao quanto
possibilidade de ocorrncia de patgenos indesejveis.
Devido ao fato destes ambientes no serem totalmente
climatizados, a relao ambiental externo/interno no foi considerada.
As altas contagens de fungos encontradas constituem-se em
fato preocupante, pois, apesar de muitos no pertencerem a gneros com
potencial de patogenicidade e/ou toxicidade, a ocorrncia de A. flavus
torna o ambiente de risco para os produtos e manipuladores, e a
preocupao ainda mais relevante. A presena do gnero Aspergillus na
rea de produo de doces, principalmente na rea de produo do doce

39

de amendoim, onde a espcie toxignica A. flavus esteve presente, tornase preocupante pelo fato de que os esporos e fragmentos de miclio
podem conter altas concentraes de toxinas, sendo a inalao desses na
colheita do milho e do amendoim, ou no trabalho em plantas de
processamento, relatada na induo do cncer de fgado, alm de
toxicidade aguda (World Health Organization, 1988).
De acordo com os padres de Kurata (1994) os ambientes
estudados

estariam

altamente

comprometidos,

pois

classificou

os

ambientes de processamento e empacotamento de alimento como ruins

acima de 100 ufc/m3. As contagens de fungos no presente trabalho
variaram de 230 a 6926 ufc/m3, encontradas nos meios MA e DRBC,
respectivamente.
Considerando as condies dos ambientes estudados no
presente trabalho, torna-se necessrio que padres brasileiros de
contaminao biolgica em ambientes industriais sejam estabelecidos
para seu monitoramento. Alm disso, a arquitetura das instalaes deve
ser revista, com solues principalmente para pequenas e mdias
empresas dentro da realidade do nosso pas, visando minimizar tanto os
efeitos nocivos sade, como econmicos que este quadro pode
representar.
Os ambientes estudados no apresentam um fluxograma que
proporcione condies satisfatrias no processamento e empacotamento
dos produtos, tanto na indstria de doces como no frigorfico. Na indstria
de doces o recebimento da matria-prima para o doce de amendoim, ou
seja, o amendoim em gros recebido e processado na mesma planta em
que os doces so processados e empacotados. Ainda, circuladores de ar
ajudam a dispersar as fontes poluentes por toda a fbrica. J no frigorfico,
a alta umidade faz desenvolver fontes de contaminao microbiana pelo
teto e parte das paredes que no possuem revestimento apropriado.

5 CONCLUSES

De acordo com os resultados obtidos, pode-se concluir que entre

os meios utilizados para quantificao de fungos no ar, Dichloran Rose
Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC) e Sabouraud Dextrose a 4% Agar
devem ser recomendados para a avaliao quantitativa de fungos, no ar,
de ambientes interiores. Sugere-se que a Resoluo 176 de 28 de outubro
de 2000 seja revista quanto recomendao do meio de Malte para
coletas ambientais, pois o mesmo se apresentou como o de menor
desempenho dentre todos os meios avaliados.
Dentre os meios estudados no foi possvel concluir sobre o
melhor para a identificao de fungos, no entanto, pode-se recomendar o
meio DRBC, principalmente em situaes de alta concentrao de
bactrias e fungos de crescimento rpido que podem comprometer a
avaliao. Ainda, reprova-se o PCA- cloranfenicol que apresentou a mais
baixa diversidade de gneros.
A dificuldade na identificao dos gneros e espcies presentes
em tempo reduzido problemtica, uma vez que, respostas para medidas
corretivas de controle devem ser imediatas. Assim, estudos na rea
molecular,

como

desenvolvimento

de

primers

especficos

para

identificao de fungos de interesse sade, tornam-se uma ferramenta

indispensvel para auxiliar o monitoramento dos ambientes.
A necessidade de caminhar para um padro referencial nacional
para monitoramento microbiolgico de ambientes de processamento e

41

empacotamento de alimentos indispensvel e urgente, uma vez que a

avaliao quali-quantitativa dos ambientes estudados mostrou que estes
no se encontram em boas condies ambientais, quanto contaminao
microbiana.
No geral, as instalaes estudadas devem ajustar o fluxograma
do processo industrial, como separar as reas de recebimento de matriaprima, processamento e empacotamento, pois no apresentam condies
satisfatrias que permitam evitar a contaminao cruzada. A arquitetura
destes ambientes deve ser revista, principalmente nas reas de produo
e empacotamento que no apresentam nenhum tipo de barreira fsica e
revestimento de paredes e pisos que promovam a melhoria na qualidade
microbiolgica do ar.
O amostrador de impactao utilizado promoveu rapidez e
proporcionou a expresso dos resultados em medidas confiveis, por ser
um equipamento que permite calibrao em seu sistema de aspirao de
ar.

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(European Series, 31)

APNDICES

48

APNDICE 1

Pr

Pr

Pr

Pr

Pr

Pr

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
37
38
39
40
41
42
43

51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
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141

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366
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397
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464
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474
477
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484
487
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494
497
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301
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33
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340
341

Quadro 19 Correo estatstica Feller.

r = Nmero de unidades formadoras de colnias em 90 mm Petridish.
Pr = Probabilidade estatstica total.

Pr
557
561
565
569
573
578
582
586
591
595
599
604
608
613
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637
642
647
652
657
662
667
673
678
684
689
695
701
706
712
718
724
730
737
743
749
756
763

Pr

351
352
353
354
355
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357
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361
362
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370
371
372
373
374
375
376
377
378
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380
381
382
383
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388
389
390
391

836
844
853
861
870
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888
897
907
917
927
937
947
958
969
981
992
1005
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1030
1043
1057
1071
1086
1102
1118
1134
1152
1170
1189
1209
1230
1252
1276
1301
1327
1356
1387
1420
1456
1496

49

42
43
44
45
46
47
48
49
50

44
45
47
48
49
50
51
52
53

92
93
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99
100

104
106
107
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110
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112
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142
143
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146
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148
149
150

175
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181
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188

192
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200

261
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267
269
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273
275
277

242
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244
245
246
247
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249
250

371
373
376
378
381
384
386
389
391

292
293
294
295
296
297
298
299
300

522
526
530
534
537
541
545
549
553

Quadro 19 Correo estatstica Feller.

r = Nmero de unidades formadoras de colnias em 90 mm Petridish.
Pr = Probabilidade estatstica total.

342
343
344
345
346
347
348
349
350

769
776
783
791
798
805
813
820
828

392
393
394
395
396
397
398
399
400

1541
1591
1648
1715
1795
1895
2028
2228
2628

50

APNDICE 2

Figura 1 - Amostrador microbiolgico de ar da marca MERCK

denominado MAS-100.