OBTENCIN DE QUITOSANO SOLUBLE EN AGUA MEDIANTE REACCIN DE MAILLARD

Mara E. Vazquez Montalbetti Estudiante de Ing. Qumica, Facultad Regional Villa Mara, UTN.
TUTORA: Noelia L. Vanden Braber CONICET, Instituto A.P. de Ciencias Bsicas y Aplicadas,
UNVM
e-mail: emi_v11@hotmail.com
Resumen
El objetivo de este trabajo fue mejorar la solubilidad del quitosano (Ch) a pH neutro o ligeramente
bsico por medio de su funcionalizacin a travs de una reaccin de Maillard (RM) empleando
glucosamina como azcar reductor. Se estudiaron muestras de Ch de diferente peso molecular.
La solubilidad del quitosano funcionalizado (WSCh) a pH 7,40, result significativamente mayor
que la del Ch nativo. Esta solubilidad expresada como % de masa retenida en un filtro de 22 m,
aument de 0,01 a 43,40 % en el caso de Ch Low M.W. y de 6,19 a 80,61 % en el caso de Ch
Medium M.W. El grado de deacetilacin (%GDA) disminuy en un 6,64 % y 8,73 % para los Ch
Low y Medium M.W. respectivamente, lo cual no representa una variacin significativa, por lo que
se espera que las propiedades derivadas de la presencia de los grupos amino sean conservadas.
Los rendimientos de reaccin fueron del 25 y 30 %, expresado como masa de producto liofilizado
obtenido sobre masa de Ch ms glucosamina iniciales para Ch Low y Medium M.W
respectivamente. En sntesis la funcionalizacin de Ch por RM con glucosamina es un mtodo
sencillo, de alta confiabilidad, excelente repetibilidad, que da buenos rendimientos y una mejora
significativa de la solubilidad del polmero.
Palabras clave: quitosano soluble en agua, glucosamina, reaccin de Maillard
Introduccin
El quitosano (Ch) es un biopolmero natural,
biocompatible y biodegradable, formado por unidades
de -(14)-2-acetamido-D-glucosa y -(14)-2amino-D-glucosa. Es obtenido por deacetilacin
alcalina de quitina, polmero que se encuentra en
abundancia en las cscaras de crustceos y otras
fuentes como hongos y levaduras (Kim K. W et al.,
2007). En los ltimos aos se han estudiado
intensamente sus aplicaciones en los campos de la
biomedicina y la qumica debido a las funciones
biolgicas
que
posee:
actividad
antitumoral,
antimicrobiana, antioxidante, antimutagnica y efecto
Figura 1: A) Quitina 100% acetilada.
inmunoestimulante (Aranaz, M. et al., 2009).
B) Quitosano
El Ch posee tres tipos de grupos funcionales reactivos,
un grupo amino (-NH2) o acetamido (-NHCOCH3) y dos grupos hidroxilos (-OH) en C-2, C-3 y C-6,
respectivamente. La mayora de las reacciones de funcionalizacin del quitosano involucran
reacciones especficas del grupo amino primario, un nuclefilo potente que puede experimentar Nacilacin, cuaternizacin, aminacin reductiva y reacciones Schiff entre otras, lo que permite
incluir grupos funcionales diferentes (Rinaudo M., 2006; Dutta P. et al., 2004). Tambin pueden
darse modificaciones por reacciones inespecficas en los hidroxilos particularmente aquel en C6 y
C3, siendo stas generalmente esterificaciones y eterificaciones. Mediante estas modificaciones
es posible obtener una variedad de productos con propiedades antibacteriales, antifngicas,
antivirales, anticidas, antiulcerosas, que adems son no txicos, no alergnicos, completamente
biocompatibles y biodegradables. Debido a la insolubilidad y poca reactividad de la quitina, la
atencin est centrada en la funcionalizacin de Ch con el fin de obtener molculas derivadas, con
estructuras bien definidas que posean propiedades avanzadas especficas (Pillai C.K.S. et al.,
2009).
La disolucin de Ch slo es posible en medio cido, en ciertos cidos orgnicos como frmico,
actico, propinico, lctico, ctrico y succnico, y determinados cidos inorgnicos como clorhdrico
y ntrico (Chung Y.C. et al., 2005). Su solubilidad depende principalmente de tres factores: el grado

de deacetilacin, la distribucin de grupos acetoamido en la cadena principal y el peso molecular

(Peniche C., et al., 2001; Kubota N, et al. 1997; Kurita K, et al., 1991; Domard A. et al., 1983;
Muzzarelli R.A.A., 1983).
La solubilidad de Ch puede ser mejorada a pH neutro y/o ligeramente bsico a travs de la
incorporacin de glucosamina por reaccin de Maillard (RM) (Ying et al., 2011; IIina et al., 2008;
Chung et al., 2006;Chung et al., 2005; Tanaka et al., 1993) la cual fusiona el grupo amino del
biopolmero con el grupo carbonilo del azcar reductor, liberando una molcula de agua. La
solubilidad se ve incrementada por el aporte de nuevos grupos hidroxilos y un grupo amino por
parte de la glucosamina adicionada. El empleo de glucosamina frente a otros azcares es
conveniente porque a priori no altera el grado de deacetilacin de la molcula, factor primordial si
se desean conservar las propiedades biolgicas, fisiolgicas y farmacolgicas, en su mayor parte
relacionadas con el comportamiento catinico del quitosano (Aranaz I.et al., 2009).
Materiales y mtodos
Reactivos
Se empelaron dos tipos de quitosano marca Sigma Aldrich: peso molecular bajo (Low M.W.) y
medio (Medium M.W.), clorohidrato de D-(+)-glucosamina marca Sigma Aldrich y reactivos marca
Cicarelli para la preparacin de buffers y soluciones de valoracin.
Funcionalizacin de Ch por reaccin de Maillard
Este procedimiento fue ajustado conforme a Chung, Y.C. et al., 2005. Se parti de una solucin al
1% P/V de quitosano en cido actico 0,2 M, a la cual se le aadi glucosamina al 1% P/V,
manteniendo la mezcla en un orbital shaker, en estufa (Estufa de secado y esterilizacin DALVO Instrumentos OJALVO S.A.) a 65C durante 48 horas. Una vez terminado el perodo de
incubacin, la muestra fue centrifugada (Centrfuga ThermoSCIENTIFIC SORVALL ST 16R.) a
5.000 rpm durante 20 min. El sobrenadante fue dializado contra agua destilada a travs de una
membrana de dilisis con un corte de peso molecular de 12.000 14.000 Da (Sigma Aldrich),
durante 96 h y luego secado por liofilizacin (Liofilizador L-T8 RIFICOR) partiendo del producto
previamente congelado a - 40 C.
Determinacin del grado de deacetilacin por titulacin potenciomtrica
El protocolo fue basado en la publicacin de Balazs N. et al., 2007. Se pesaron 0,10 g de Ch o
WSCh y se disolvieron en un exceso conocido de HCl, se aadi NaCl para ajustar la fuerza
inica de la solucin y fue agitado durante 5 hs hasta lograr la solubilizacin total del polmero.
Una alcuota de 20 mL fue titulada potenciomtricamente con NaOH 0,1N previamente valorado.
La curva de dicha titulacin presenta dos puntos de inflexin; el primero, corresponde a la
neutralizacin del exceso de HCl y el segundo, la de Ch o WSCh protonado. La diferencia de
ambos da el valor neto de NaOH requerido para calcular el N de grupos amino. Las ecuaciones
(1) a (3) son las necesarias para el clculo del %GDA.

(1)
(2)
(3)

Determinacin de peso molecular de Ch

Se realizaron diluciones seriadas de Ch comercial desde 0,0625 % P/V hasta 0,5 % P/V utilizando
como disolvente buffer CH3COOH 0,25 M / CH3COONa 0,25 M. Se emple un viscosmetro tipo
Ubbelhode, con un dimetro de capilar de 3 mm, para medir el tiempo de cada del solvente puro

(t0) y de las soluciones seriadas (t) entre los dos aforos del instrumento. El ensayo se realiz a
temperatura constante a 25C. Los valores obtenidos se relacionan con la viscosidad por medio
de coeficientes de viscosidad especfica (sp) y viscosidad reducida (red), definidas por las
expresiones (4) y (5) respectivamente.
(4)
(5)
Para calcular la viscosidad intrnseca se representa grficamente la viscosidad reducida frente a la
concentracin del polmero disuelto y se realiza la regresin lineal correspondiente. La viscosidad
intrnseca es el valor de la ordenada al origen de dicha recta (Berghoff, C. F., 2011). Una vez
calculada la viscosidad intrnseca, se puede determinar el peso molecular viscosimtrico (Mv) de
un polmero a partir de la ecuacin de MarkHouwinkKuhnSakurada (MHKS) (6).
(6)
Donde K y a son constantes empricas vlidas slo para un sistema establecido de
solventepolmero, las cuales dependen de la naturaleza del polmero, del sistema de disolvente
utilizado y temperatura (Knaul, J. Z. et al., 1998).
Caracterizacin de WSCh por espectrometra de absorcin en IR
sta es la tcnica ms comnmente empleada para caracterizar molculas funcionalizadas de Ch
ya que permite detectar modificaciones en la estructura molecular mediante el anlisis detallado
de las diferentes bandas del espectro (Garca-Bermejo A. B. et al., 2012; Rodrguez Hamamura N.
et al., 2010). El equipo utilizado fue un Nicolet Nexus equipado con un detector MCT, con un
promedio de 20 espectros, resolucin de 2 cm-1, perteneciente a CIQUIBIC (CONICET) FCQ
UNC. El grado de acetilacin fue calculado a partir de los espectros IR tomando como banda
caracterstica a la localizada a 1.380 cm, y como referencia la banda a 1.420 cm, obteniendo una
correlacin lineal que viene expresada por la ecuacin (7).
(7)
Prueba de solubilidad a pH fisiolgico para WSCh.
La solubilidad fue determinada conforme a Chung, Y-C. et al., 2005. Se disolvieron 0,01 g de Ch o
WSCh en 5 mL de buffer fosfato pH 7,40 y se sometieron a agitacin durante 5 h en un shaker
climatizado a 25 C. Posteriormente las muestras fueron filtradas bajo vaco a travs de un filtro de
papel de 22 m previamente tarado en un vidrio de reloj. El papel de filtro fue secado en estufa a
105 C durante 1 h y luego enfriado en un secador durante 20 min para finalmente pesarlo a
temperatura ambiente.
Debido a que no se obtiene una solucin saturada de Ch o WSCh, no es posible expresar
solubilidad de la manera convencional como g/L. El resultado se expresa como % masa/masa y se
calcula como indica la ecuacin (8).
(8)
Resultados
Funcionalizacin de Ch por reaccin de Maillard
Durante el transcurso de la reaccin se tomaron alcuotas a tiempo 0, 24 y 48 horas para evaluar
la absorbancia a 420 nm (contra un blanco de cido actico) como un indicador del estado de
avance de la reaccin. Una vez finalizada la dilisis se midi la absorbancia a 420 nm, contra
blanco de cido actico para corroborar la variacin en la pigmentacin del producto final. Los

rendimientos de reaccin rondan el 25%, expresado como masa de WSCh liofilizado obtenido
sobre masa de Ch ms glucosamina iniciales. Estos resultados se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1: Rendimientos de la funcionalizacin de Ch con glucosamina por RM.

Ch Low MW
Ch Medium MW

0h
0,098
0,111

Absorbancia
24 h
48 h
post-dilisis
(a)
0,288 0,722
0,670
(a)
0,520 0,569
0,510
(a)

Rendimiento
gChF/(gCh+gGlucosamina)
0,252
0,308

Dilucin 1:3

Determinacin del grado de deacetilacin

La representacin grfica de la segunda derivada de la funcin que representa la curva de pH vs
volumen de NaOH gastado, permite determinar los puntos de inflexin (V1 y V2) de las curvas de
titulacin para las muestras de Ch y WSCh analizadas. En la Tabla 2 se muestran los clculos y
los resultados de la determinacin del grado de deacetilacin.
Tabla 2: Clculo del % GDA de Ch y WSCh por el mtodo de la titulacin potenciomtrica.
NNaOH (meq/mL)
V1 (mL)
V2 (mL)
Masa Ch en alcuota (g)
Moles (-NH2) / g Ch
Moles (-NHCOCH3) / g Ch
% GDA

Ch Low MW
0,0906
0,9848
2,0876
0,0200
0,0050
0,0010
83,89

Ch Med. MW
0,0906
1,1291
2,1862
0,0208
0,0046
0,0013
78,41

WSCh Low MW
0,0980
2,8914
0,9472
0,0045
0,7290
1,9442
77,25

WSCh Med. MW
0,0980
1,6603
2,4930
0,0205
0,0040
0,0018
69,68

Los resultados obtenidos en la determinacin del % GDA por valoracin potenciomtrica son
consistentes lo que demuestra que esta tcnica es confiable y se puede utilizar como mtodo
estndar para evaluar todas las muestras de Ch y WSCh. Estos valores fueron contrastados con
los % GDA determinados por espectrometra IR (ver Tabla 5) y se encontr una gran
correspondencia entre los mismos, lo que aumenta la confiabilidad del mtodo.

reducida (L/g)

Determinacin del peso molecular del Ch por viscosimetra capilar

La representacin grfica de la viscosidad reducida frente a la concentracin del polmero se
muestra en la Figura 2.
1,6
Los parmetros K y a de la ecuacin MHKS fueron
y = a + b.x
Ch Low M.W Ch Med. M.W
tomados de Rodrguez Hamamura N., et al.,
1,4
Adj. R-Square
0,98974
0,99757
(2010), para un buffer
CH3COOH 0,20 M /
Intercept
0,18996
0,32616
CH3COONa 0,10 M y de Knaul J. Z., et al., (1998)
1,2
para un buffer CH3COOH 0,30 M / CH3COONa
1,0
0,20 M. Los resultados se exponen en la Tabla 3.
Los resultados de viscosimetra capilar evidencian
0,8
que el mtodo es sensible a las variaciones en el
0,6
peso molecular del Ch y que puede emplearse
como tcnica de caracterizacin de Ch. Por el
0,4
Ch Low M.W
contrario, para el WSCh no es posible emplear
0,2
Ch Med. M.W
esta tcnica debido a que las soluciones que forma
en medio cido son demasiado fluidas y el tiempo
0,0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
de cada a travs capilar es casi idntico al tiempo
C (g/L)
de cada del buffer (t0) y el aumento de viscosidad
con incremento de la concentracin no es
Figura 2: Viscosidad reducida frente a la
apreciable.
concentracin

Tabla 3: Peso molecular viscosimtrico de Ch segn ecuacin MKHS

Ch Low MW
Ch Med. MW

intrnseca
mL/g
190,00
326,16

0,9897
0,9975

MV

7
5

0,078
0,078

0,76
0,76

kDa
28,58
58,20

A.V. Ilina et al. obtuvo WSCh con glucosamina bajo condiciones similares a las aqu empleadas
(Ilina, A.V. et al., 2008) e informa valores de viscosidad intrnseca de 38 y 12 mL/g para los
derivatizados de Ch nativos de 24 y 5 kDa respectivamente. Tomando los valores all publicados
para las constantes de la ecuacin MKHS, K = 1,38.104 y a = 0,85, fue posible estimar un peso
molecular de 16 kDa y de 31 kDa para WSCh Low y Medium M.W respectivamente.

Estructura piransica

% GDA

Absorbancia

Enlaces -C=NGrupos - NH2

Caracterizacin de WSCh por espectrometra de absorcin en IR

En la Figura 3 se observan los espectros de IR para los Ch Low M.W., Medium M.W. y sus
respectivos derivatizados. All pueden distinguirse tres zonas modificadas:
1) La zona 1 se encuentra delimitada por el
Ch Low M.W
3
incremento en la banda a 1600 cm-1,
Ch Med. M.W
2,5
caracterizado por el establecimiento de
WSCh Low M.W
1
WSCh Med M.W
nuevos enlaces RNHR, producto de la
fusin del grupo carbonilo reductor de la
2,0
2
glucosamina y el grupo NH2 del Ch. La
mayor superficie de la banda a 1650 cm-1
1,5
resulta ser la consecuencia de la aparicin de
enlaces C=N, caractersticos de las Bases
de Schiff que se forman durante las
1,0
reacciones de pardeamiento no enzimtico.
2) La zona 2 muestra las bandas (1420 y
1320 cm-1) a partir de las cuales se puede
0,5
calcular el %GDA de las muestras analizadas.
Estas correlaciones se toman entre una de las
3000
2000
1000
-1
bandas de los grupos amida (I o III), en este
Longitud de onda (cm )
caso amida III (1380 cm-1 aqu desfasada
Figura 3: Espectros de absorcin en el IR para
hacia 1320), y otra banda que sirva de
Ch y WSCh.
referencia interna para corregir las diferencias
de grosor de la pastilla de bromuro de potasio utilizada. Propio del deterioro que sufre la molcula
a lo largo de la reaccin, se puede observar un decrecimiento de dichas bandas, lo cual se ve
reflejado en el descenso del %GDA.
3) La zona 3, alrededor de 1100 cm-1, muestra el cambio conformacional (modificacin en las
vibraciones) en la estructura piransica, fiel a la incorporacin de molculas de azcar
(ramificacin), al polmero en cuestin.
Solubilidad a pH fisiolgico para WSCh
La solubilidad de WSCh a pH 7,40, result significativamente mayor que la de Ch nativo. Esta
solubilidad expresada como % de masa retenida en un filtro de 22 m, aument de 0,01 a 43,40 %
en el caso de Ch Low M.W. y de 6,19 a 80,61 % en el caso de Ch Medium M.W. Los resultados de
la prueba de solubilidad se muestran en la Tabla 5 en el resumen de resultados.
Tabla 5: Resumen de las caractersticas de los Ch y WSCh estudiados
Ch Low MW

WSCh Low MW

Ch Med.MW

WSCh Med. MW

Peso molecular (kDa)

% GDA (FTIR)
% GDA (Titulacin)

29

16

58

31

87,88

81,57

72,95

69,36

83,89

77,25

78,41

69,68

Solubilidad a pH 7,40 (%)

0,01

43,40

6,19

80,61

Conclusin
Entre las diferentes estrategias para mejorar la solubilidad de Ch, la sntesis de derivatizados por
reaccin de Maillard con glucosamina, es un enfoque muy prometedor, con potencial aplicacin
industrial, ya que se trata de un mtodo sencillo, de alta confiabilidad, excelente repetibilidad, fcil
de controlar, que ocurre a temperaturas moderadas, no emplea solventes peligrosos, da buenos
rendimientos y resulta en una mejora significativa de la solubilidad del polmero a pH neutro y
ligeramente bsico.
La mejora de la solubilidad del polmero permite plantear a futuro la formulacin de productos
nutracuticos microencapsulados en los cuales WSCh conforme la matriz de vehiculizacin de
compuestos bioactivos hidrofbicos, particularmente antioxidantes, y que adems tenga un efecto
sinrgico sobre ellos. En post de este objetivo, y basndose en estudios anteriores (Kim K. W.;
Thomas R. L. 2007; Je, J.Y. et al., 2004) se estudiarn la actividad antioxidante de WSCh.
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