i

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA

AGRICULTURA

CARRERA DE INGENIERA EN BIOTECNOLOGA

PROYECTO DE TITULACIN PREVIO A LA OBTENCIN DEL

TTULO DE INGENIERO EN BIOTECNOLOGA
AUTOR: EDISON ANDRS GALARRAGA GALARZA

TEMA: EVALUACIN DE LA RESISTENCIA A COSTRA NEGRA

(Rhizoctonia solani Khn) AG3 AISLADA DE LA PROVINCIA DE
CARCHI EN MATERIAL GERMOPLSMICO DE PAPA A NIVEL
DE INVERNADERO.

DIRECTORA: ALMA KOCH, MSc.

CODIRECTOR: ANDRS IZQUIERDO, PhD.

SANGOLQU, ABRIL 2015

ii

HOJA DE LEGALIZACIN DEL PROYECTO

ELABORADO POR
________________________
Sr. Edison Andrs Galrraga Galarza

DIRECTORA DE LA CARRERA
________________________
M.Sc. Mara Augusta Chvez

Sangolqu, Abril de 2015

iii

CERTIFICACIN
Alma Koch, MSc.

Andrs Izquierdo, Ph.D.

Certifican que el trabajo titulado Evaluacin de la resistencia a costra negra

(Rhizoctonia solani Khn) AG3 aislada de la provincia de Carchi en material
germoplsmico de papa a nivel de invernadero fue realizado en su totalidad por el
Sr. Edison Andrs Galarraga Galarza, como requerimiento parcial a la obtencin del
ttulo de INGENIERO EN BIOTECNOLOGA, ha sido guiado y revisado
peridicamente y cumple con las normas estatutarias establecidas por la Universidad de
las Fuerzas Armadas-ESPE, en el Reglamento de Estudiantes.

El mencionado trabajo consta de un documento empastado y de un disco compacto, que

contiene los archivos en formato porttil de Acrobat (pdf). Autorizan a Edison Andrs
Galarraga Galarza que lo entregue a la seora Mara Augusta Chvez, Ms.C, en su
calidad de Coordinadora de la Carrera.

Sangolqu, Abril 2015.

______________________
ALMA KOCH, MSc.
DIRECTOR

______________________
ANDRS IZQUIERDO, Ph.D.
CODIRECTOR

iv

DECLARACIN DE RESPONSABILIDAD
Edison Andrs Galarraga Galarza

Declaro que:
El proyecto de grado denominado Evaluacin de la resistencia a costra negra
(Rhizoctonia solani Khn) AG3 aislada de la provincia de Carchi en material
germoplsmico de papa a nivel de invernadero ha sido desarrollado en base a una
investigacin exhaustiva, respetando todos los derechos intelectuales de terceros,
conforme las citas que constan al pie de las pginas correspondientes, cuyas fuentes se
incorporan en la bibliografa. Consecuentemente este trabajo es de mi autora.
En virtud de esta declaracin, me responsabilizo del contenido, veracidad y alcance
cientfico del proyecto de grado en mencin.

Sangolqu, Abril 2015.

_____________________________
Edison Andrs Galrraga Galarza

AUTORIZACIN

Yo, Edison Andrs Galarraga Galarza

Autorizo a la Universidad de las Fuerzas Armadas-ESPE, la publicacin en la biblioteca

virtual de la Institucin del trabajo Evaluacin de la resistencia a costra negra
(Rhizoctonia solani Khn) AG3 aislada de la provincia de Carchi en material
germoplsmico de papa a nivel de invernadero cuyo contenido y criterios son de mi
exclusiva responsabilidad y autora.

Sangolqu, Abril 2015.

_____________________________
Edison Andrs Galrraga Galarza

vi

DEDICATORIA

A Dios por ser muy bueno conmigo, por su infinito amor y misericordia.
A mis padres, que con mucha paciencia y amor me han sabido guiar y tener paciencia a
lo largo de mi carrera universitaria.
A mi abuelo, mi papi Coke, que me enseado como a un hijo, me ha acompaado en
todos mis logros y los ha vuelto suyos; esta tesis va para ti mi viejo.

Edison Andrs Galrraga Galarza

vii

AGRADECIMIENTOS

A Dios por darme la fuerza y or todas mis oraciones, a mi familia por haber estado
conmigo siempre en las buenas y en las malas, los amo.
A mis profesores que de buena o mala manera han sabido guiarme a lo largo de mi vida
universitaria.
A Almita Koch, MSc. por haberme hecho parte de su familia microbiologa y por
apoyarme durante el desarrollo de mi tesis. Siempre admirar su paciencia y sus
conocimientos.
Al Doctor Andrs Izquierdo, PhD. por haber aceptado la codireccin y brindarme sus
conocimientos.
A Jessy Maisincho por la ayuda y la paciencia brindada durante todo este tiempo,
muchas gracias.
Al Instituto Nacional Autnomo de Investigaciones Agropecuarias (INIAP) por haberme
acogido durante la realizacin de mi tesis, una gran institucin. Al Ing. Eloy Mora por
su, paciencia, confianza y apertura en el Departamento de Proteccin Vegetal de INIAP.
Al Ing. Pedrito Romero por su apertura, respaldo, confianza y conocimientos.
Al Ing. Geovanni Rodrguez mi colega y amigo, gracias por el apoyo y la confianza mi
amigo.
Al Ing. Javier Molina por haberme acompaado a lo largo de mi carrera, por brindarme
sus conocimientos y ser un amigo. Gracias a ti aprend que vale ms un burro bien
dormido que un genio amanecido (Molina, 2010).
A todos mis amigos: Pablo Espinosa, Alexandra Rueda, Alexandra reyes, Andrs
Almeida, Gabriela Fuentes, Wilson Castro, Isaac Armendriz a todos en general, faltan
muchos pero a tod@s los llevar siempre en el corazn.

DIOS, PATRIA Y LIBERTAD

viii

NDICE DE CONTENIDOS

CERTIFICACINiii
DECLARACIN DE RESPONSABILIDAD..iv
AUTORIZACIN..v
DEDICATORIA...vi
AGRADECIMIENTOS...vii
CAPTULO 1 INTRODUCCIN...1
1.1. Justificacin del problema1
1.2. Objetivos de la investigacin....3
1.3. Marco Terico.4
1.3.1. Importancia socio-econmica..4
1.3.2. Consumo...4
1.3.3. La papa (Solanum tuberosum L.).5
1.3.4. Gentica de la papa...5
1.3.5. Relevancia de la especie...6
1.3.6 Distribucin de la especie.7
1.3.7. Produccin a nivel Nacional7
1.3.8. Particularidades del Cultivo9

ix

1.3.9. Morfologa de la papa.12

1.3.10. Fenologa del Cultivo...15
1.3.11. Enfermedades del cultivo de papa15
1.3.12. Caractersticas de enfermedades por fitopatgenos..16
1.3.13. Enfermedades fngicas que afectan al cultivo de papa....18
1.3.14. Costra negra..18
1.3.15. Morfologa y citologa de Rhizoctonia solani Khn....20
1.3.16. Grupos de Anastomosis (AG)..22
1.3.17. Epidemiologa..23
1.3.18. Ciclo de Vida de R. solani Khn..24
1.3.19. Sntomas de costra negra..25
1.3.20. Control de la enfermedad.28
CAPTULO 2 - MATERIALES Y MTODOS.29
2.1. Participantes...29
2.2. Zona de estudio..29
2.3. Revisin bibliogrfica29
2.4. Fase de campo-toma de muestras..30
2.5. Fase de laboratorio30
2.6. Aislamiento de Rhizoctonia solani Khn..31

2.6.1. Preparacin de medio de cultivo.31

2.6.2. Desinfeccin de los explantes tubrculos de Solanum tuberosum.31
2.6.3. Aislamiento32
2.6.4. Observacin del cultivo al microscopio.32
2.6.5. Extraccin de ADN de R. solani Khn..33
2.6.6 PCR anidada para la determinacin del Grupo de Anastomosis 3 (AG3)...34
2.6.7. Amplificacin de las regiones ITS1-5.8S-ITS2.34
2.6.8. Amplificacin de regiones especficas para AG-3.35
2.6.9. Electroforesis en gel de agarosa.36
2.6.10. Multiplicacin de Rhizoctonia solani Khn.36
2.6.11. Preparacin del inculo de R. solani Khn..37
2.6.12. Inoculacin de Tierra con germoplasmas.38
2.6.13. Control de Inculo39
2.6.14. Manejo del experimento...40
2.7. Mtodo de evaluacin40
CAPTULO 3 RESULTADOS42
3.1. Aislamiento de Rhizoctonia solani Khn..42
3.2. Extraccin de ADN de Rhizoctonia solani Khn..43
3.3. Nested PCR para la confirmacin de Rhizoctonia solani AG3.44

xi

3.4. Preparacin del Inculo..46

3.5. Sintomatologa area..47
3.6. Anlisis estadstico.47
3.7. Porcentaje de emergencia..48
3.8. Altura de las variedades inoculadas...48
3.9. Evaluacin a la cosecha de los tubrculos.51
3.10. Severidad de la infeccin.52
3.11. Nmero de tubrculos..57
3.12. Rendimiento total en gramos61
CAPTULO 4 DISCUSIN.64
4.1. Aislamiento e identificacin de Rhizoctonia solani Khn.65
4.2. Preparacin del inculo de Rhizoctonia solani Khn66
4.3. Sntomas de R. solani Khn...67
4.4. Control de altura de la planta.69
4.5. Evaluacin de los tubrculos.69
4.6. Severidad de la Infeccin...70
4.7. Rendimiento...71
4.8. Plagas y control del ensayo71
CAPTULO 5 CONCLUSIONES74

xii

CAPTULO 6
RECOMENDACIONES..75
BIBLIOGRAFA.76
ANEXO I..81
ANEXO II84
ANEXO III...85

xiii

LISTADO DE FIGURAS
Figura 1.1 Aporte de la produccin de papas por provincias8
Figura 1.2 Flor de la planta de papa en invernadero...15
Figura 1.3 Sintomatologa de R. solani ..27
Figura 2.1 Dispensacin de medio PDA en cajas petri dentro de una cmara de flujo
laminar..31
Figura 2.2 Armada de PCR dentro de una cmara de flujo laminar...36
Figura 2.3 Preparacin de inculo de R. solani..37
Figura 2.4 Inoculacin de tierra para la siembra de germoplasmas....39
Figura 2.5 Invernadero de la estacin cientfica Santa catalina..40
Figura 3.1 Cultivo aislado de Rhizoctonia solani Khn en medio PDA en caja petri42
Figura 3.2 Tincin de hifas de Rhizoctonia solani Khn vista en el objetivo43
Figura 3.3 Electroforesis de la regin ITS1-5,8-ITS2 con su control negativo..45
Figura 3.4 Amplificacin de la regin especfica para AG3 con su control negativo46
Figura 3.5. A: Preparacin del inculo de Rhizoctonia solani Khn en semillas de
avena.47
Figura 3.6 Diagrama de barras para las alturas de las plantas con su error estndar.50
Figura 3.7 Necrosis en tallo de la variedad I-Rub del cuarto bloque52
Figura 3.8 Tubrculos con costra negra de la variedad mejorada I-Rub54
Figura 3.9 Tubrculos del clon promisorio 12-4-170.55

xiv

Figura 3.10 Diagrama de cajas con sus media de la severidad de las variedades de papa
inoculadas.56
Figura 3.11. Diagrama de la variable nmero de tubrculos por variedad con sus
respectivas medias58
Figura 3.12. Diagrama de bloques de la variable rendimiento en variedades inoculadas y
no inoculadas...63

xv

LISTADO DE TABLAS
Tabla 1.1 Composicin qumica ptima del suelo para el cultivo de papa.10
Tabla 1.2 Aporte nutricional de papa fresca para consumo humano..12
Tabla 2.1 Materiales germoplsmicos evaluados...38
Tabla 2.2 Criterio de Clive para la evaluacin de tubrculos.41
Tabla 3.1. Valores de concentracin y absorbancias de ADN total extrado de
Rhizoctonia solani44
Tabla 3.2 Anlisis de varianza de la altura de las plantas...49
Tabla 3.3 Alturas promedio y pruebas de Tukey para la variable altura51
Tabla 3.4 Anlisis de varianza del porcentaje de severidad de la infeccin de papas53
Tabla 3.5 Resultados del anlisis de tukey, rangos de los valores promedios del
porcentaje de infeccin de costra negra57
Tabla 3.6 Anlisis de varianza para la variable nmero de tubrculos de tratamientos
inoculados y testigo..59
Tabla 3.7 Prueba de Tukey para la variable nmero de tubrculos.60
Tabla 3.8 Anlisis de varianza para la variable gramos por maceta de tratamientos
inoculados y testigo.61
Tabla 3.9 Prueba de Tukey para la variable rendimiento por maceta.62

xvi

RESUMEN
La papa (Solanum tuberosum) es uno de los cultivos tradicionales de mayor importancia
econmica en el Ecuador y el cuarto a nivel mundial. En el Ecuador se ha visto afectado
por Rhizoctonia solani Khn, agente causal de la Rizoctoniosis o costra negra,
enfermedad fngica que ataca a brotes, tallos, estolones, tubrculos, causa necrosis,
marchitez foliar y en ocasiones anula la germinacin de la plntula. Puede acabar con
hasta el 25% de un cultivo en campos de agricultores. La bsqueda y seleccin de
variedades resistentes es de importancia crucial para hacer frente a problemas que
afectan directamente a los cultivos, sean estos de origen fitopatolgico, fsico-qumico o
de carcter ambiental. Se buscaron variedades de papa con resistencia a costra negra
AG3.
R. solani AG3 fue aislada a partir de esclerocios de papa provenientes de la provincia de
Carchi. Se confirm mediante biologa molecular el grupo de anastomosis 3 (AG3) para
el gnero Rhizoctonia con primers especficos. Se evaluaron frente a R. solani veinte
materiales germoplsmicos proporcionados por INIAP, en los que se incluan variedades
mejoradas y clones promisorios. El material vegetal fue estudiado durante seis meses a
nivel de invernadero. Se evaluaron y seleccionaron los tubrculos a la cosecha mediante
el criterio de Clive (1971) en base al porcentaje de infeccin. Se encontr que la
variedad I-Puca Shungo y el clon promisorio 12-6-1 presentan Alta tolerancia ante R.
solani.

Palabras clave: costra negra, anastomosis, fitopatgenos, germoplsmico, resistencia.

xvii

ABSTRACT
The potato (Solanum tuberosum) is one of the traditional crops of major economic
importance in Ecuador and the fourth worldwide. In Ecuador, it has been affected by
Rhizoctonia solani Khn, causal agent Rizoctoniosis or black scab, fungal disease that
attacks buds, stems, stolons, tubers, cause necrosis, leaf wilting and sometimes nullifies
seedling germination. R. solani can kill up to 25% of a crop in farmers' fields. The
search and selection of resistant varieties is crucial to address problems directly affecting
crops, these problems can be: phytopathological origin, physical-chemical or
environmental nature. Potato varieties were sought with black scab resistance AG3.
R. solani AG3 was isolated from sclerotia of potatoes from the province of Carchi.
Anastomosis group 3 (AG3) for the genus Rhizoctonia was confirmed by molecular
biology with specifics primers. Twenty potato seeds provided by INIAP, which includes
improved varieties and promising clones, were evaluated.
The plant material was studied for six months at the level of greenhouse. They were
evaluated and selected the harvested tubers by Clive criteria (1971) by the percentage of
infection. It was found that the variety I-Puca Shungo promising clone 12-6-1 present
high tolerance for R. solani.

Keywords: black crust, anastomosis, plant pathogens, potato-seed, resistance.

CAPTULO 1 INTRODUCCIN
La papa (Solanum tuberosum) es uno de los cultivos de mayor importancia
econmica en el Ecuador. Segn la FAO, la produccin se vincula a 82000 productores
en alrededor de 90 cantones. El cultivo del tubrculo abarca la mayor extensin de
terreno con un 5,5% del rea total de cultivos de la serrana ecuatoriana (Paca, 2009).
La presencia de la enfermedad de la costra negra se ha incrementado en el pas
durante los ltimos aos, llegando a causar hasta la muerte del 70% de las plntulas de
papa. Se han documentado prdidas en campo que llegan hasta el 20% y que se han
reflejado en importantes prdidas econmicas (INIAP, 2005).
La bsqueda de variedades con tolerancia gentica ha sido el objetivo del sector
agrcola durante los ltimos aos. El uso de productos qumicos para el control de
fitopatgenos ha dado lugar a plagas secundarias, por lo que, el uso de semilla con
tolerancia a Rhizoctonia solani Khn representara menor costo en la produccin del
tubrculo, disminuira el uso de fungicidas y generara menor impacto ambiental (Prado
et al., 2001).

1.1. Justificacin del problema

Se estima que la produccin global de papa genera 16.5 billones de dlares anuales.
El cultivo de papa es econmicamente importante a nivel mundial. En el Ecuador, la
papa constituye el cuarto cultivo ms importante por su produccin, alto consumo,
aporte nutricional y por ser una fuente de ingresos para numerosos agricultores,
principalmente del sector rural. Representa el 7.4% del Producto Interno Bruto Agrcola
(PIBA) (Devaux et al., 2010).

En los ltimos aos, debido al incremento de tierras cultivadas, se han desarrollado

problemas fitosanitarios que han afectado directamente a los agricultores, situacin
debida al mal manejo del cultivo, al desconocimiento de las causas de enfermedad y a la
falta de tecnologa adecuada que permita controlar estos problemas oportunamente y as
evitar que se propague a otras zonas (INIAP, 2005).
Torres (1989), en su estudio acerca de las principales enfermedades fngicas de la
papa relacionadas con la produccin de tubrculos-semillas, indica que todas estas
enfermedades son de gran importancia, ya que pueden llegar a destruir cultivos enteros o
afectar en el rendimiento de la produccin, restndole calidad al tubrculo, este es el
caso de la costra negra (Rhizoctonia solani Khn). Se conocen en Ecuador ms de 30
enfermedades fngicas que afectan

al cultivo de Solanum tuberosum siendo la

Rizoctoniosis o costra negra la ms comn en suelos paperos. R. solani se perpeta en

cultivos por acciones mecnicas como la labranza, la utilizacin de implementos
agrcolas infectados, restos de tallos y hojas infectadas, y semillas con esclerocios.
Rhizoctonia solani Khn ataca brotes, estolones y tubrculos, la mayor sintomatologa
ocurre en el estado de plntula; causando efectos irreversibles para la planta, llegando a
causar una prdida de casi el 70%. En el ao 2005 (INIAP, 2005) en la Estacin
Experimental de Santa Catalina (EESC), se obtuvieron porcentajes de incidencia y de
severidad del 81%; al realizar controles de calidad internos de semilla de papa categora
registrada INIAP Fripapa. En consecuencia de las altas infecciones, la extraccin de
semilla para la variedad I-Fripapa disminuy considerablemente. Se obtuvieron valores
de 50% de extraccin frente a 60-70% que se considera rentable.

Con estos antecedentes, enfocados en el impacto de prdidas econmicas para los

agricultores, es necesaria la generacin permanente de nuevas variedades de papa que
posean una tolerancia alta o parcial a R. solani; conociendo que la semilla se considera
como el factor principal para una produccin agrcola saludable.

1.2. Objetivos de la investigacin

1.2.1. Objetivo general

Encontrar materiales germoplsmicos de papa tolerantes a costra negra, mediante la

evaluacin de la severidad en sintomatologa en parte area, en tallos, races y
tubrculos, para disponer de tubrculo semilla con una tolerancia moderada y alta a
Rhizoctonia solani Khn.
1.2.2. Objetivos especficos

a) Aislar Rhizoctonia solani Khn AG3 de esclerocios de papa provenientes de la

provincia de Carchi.
b) Identificar el comportamiento de diferentes materiales germoplsmicos de papa,
proporcionados por INIAP, frente a la enfermedad costra negra (Rhizoctonia solani
Khn).
c) Seleccionar las variedades tolerantes a costra negra.

1.3. Marco Terico

1.3.1. Importancia socio-econmica

Se estima que 225000 personas subsisten directamente del cultivo de la papa,

115000 personas estn involucradas indirectamente en actividades de comercializacin,
transporte y procesamiento del tubrculo. En general, el 7% de la poblacin
econmicamente activa del pas tienen a la papa como su principal fuente de ingreso. El
cultivo de la papa se caracteriza por su alto uso de mano de obra. Se emplean alrededor
de 150 jornales en cada hectrea por ciclo, es decir, en 49000 hectreas cultivadas por
ao se usan 7.5 millones de jornales anuales, un equivalente a 36.7 millones de dlares
de ingresos directos. Anualmente por cada hectrea cultivada se requiere una inversin
de 2500 dlares (Reinoso, 2011).
En los Andes, los pases con mayor produccin por hectrea sembrada son:
Colombia y Venezuela con 16 t/ha, mientras que los pases con menor produccin son
Bolivia y Ecuador con un promedio de 6 a 7 t/ha. En Ecuador se siembran comnmente
30 cultivares, de los cuales, INIAP Gabriela y Superchola representan el 50% del rea
sembrada (INIAP, 2002).
1.3.2. Consumo

La papa es uno de los alimentos de mayor consumo en la dieta de los habitantes de la

serrana ecuatoriana. Segn el Instituto Autnomo de Investigaciones Agropecuarias
(INIAP) el consumo anual de una persona por ciudad es: 122 kg en Quito, 80 kg en

Cuenca y 50 kg en Guayaquil. Actualmente las industrias alimenticias utilizan 50000

toneladas al ao, lo cual representa el 10% de la produccin nacional (Andrade, 2002).
1.3.3. La papa (Solanum tuberosum L.)
Se conoce como papa o patata al tubrculo formado por engrosamiento de raz de la
planta Solanum tuberosum L. Segn Dimitri (1972), a la papa (Solanum tuberosum), le
corresponde la siguiente clasificacin taxonmica: Reino Plantae; Subreino Antophyla;
Divisin Angiosperma; Clase Dicotilednea; Subclase Simpetalae; Orden Tubuflorae;
Familia Solanaceae; Gnero Solanum; Especie tuberosum.
Es una planta de altura por lo que sus cultivos se realizan desde los 2700 a 3400
msnm, y se desarrolla adecuadamente a una temperatura que oscila entre los 9 y 11C.
Aunque el cultivo se encuentra en varios tipos de suelos, le van mejor aquellos de
textura arenosa, con buen drenaje y estructura suelta, es sensible a suelos compactos por
lo que se recomienda tener una profundidad de al menos 30 centmetros. Se desarrolla en
un rango de pH de 5.0 a 7.0 (Paca, 2009).

1.3.4. Gentica de la papa

Existen alrededor de 4000 variedades de papa, variedad gnica distribuida en ms de

100 pases alrededor del mundo. Esta gran diversidad gentica ha sido preservada
mediante prcticas tradicionales de los agricultores. El cuidado de las semillas por parte
de los pequeos productores paperos de la regin andina han permitido el
mantenimiento de la gran variedad de papas; que presentan adaptaciones a altura,
temperaturas y suelos (Borba, 2008).

El Ecuador posee una inmensa diversidad gentica de papa. El Instituto Autnomo

de Investigaciones Agropecuarias (INIAP) ha identificado 393 variedades de papa, 232
pertenecen a variedades silvestres y 161 a variedades nativas. La gran diversidad de
materiales junto con germoplasmas modificados, han sido la respuesta a las limitaciones
del cultivo, dando resistencia a factores adversos como: heladas, condiciones
ambientales y fitopatgenos (Reinoso, 2011).
El flujo gentico de la especie es alto entre variedades cultivadas y silvestres, con la
subespecie andigena y con especies hexaploides (EBN=4). El fenmeno gentico en la
solancea ha sido atribuido a la dispersin del polen, a la coexistencia geogrfica y a la
relacin taxonmica. Aparentemente la evolucin de las especies de papa se origin a
partir del nivel diploide. El gametofito de la papa es 2n=12. El esporofito encontrado en
diferentes variedades puede ser: 2n=24 y 48; 2n=24, 36, 48 y 60. Solanum tuberosum
presenta alta heterocigosidad (he) que oscila entre 0.46 y 0.52 (Ortiz & Peloquin, 1994).

1.3.5. Relevancia de la especie

El cultivo de papa ocupa el cuarto lugar dentro de las plantaciones de mayor

importancia a nivel mundial; debido a su sabor y consistencia, a su alto aporte
nutricional y sus mltiples usos. El almidn es utilizado por industrias farmacuticas,
textiles, de la madera y del papel, en la elaboracin de pegamentos, piensos y etanol. En
Europa, a nivel industrial, es utilizada en la produccin de vodka, whisky, almidn y
otras industrias la emplean como comidas rpidas (CONABIO, 2008).

A diferencia de otros cultivos, la papa se puede multiplicar de manera vegetativa a

travs de tubrculos semilla. Este cultivo tiene un alto rendimiento y no requiere de
cuidados especiales (Estrada, 2000).

1.3.6 Distribucin de la especie

La papa es una planta originaria de los Andes sudamericanos y se extiende desde

Colombia, pasando por Ecuador, Per, Bolivia, Venezuela, Chile hasta Argentina. En el
Ecuador se distribuye en tres zonas geogrficas: norte, centro y sur. El cultivo se
desarrolla en laderas irregulares en terrenos con una inclinacin de hasta el 45%, en un
intervalo de 2400 a 3800 msnm. El cultivo se desarrolla en condiciones de subpramo
hmedo (Hurtado & Romn, 2002).
1.3.7. Produccin a nivel Nacional
Las provincias de Carchi, Pichincha, Cotopaxi, Tungurahua y Chimborazo,
aportaron el 79.5% de la produccin, las mayores extensiones de cultivo de papa
corresponden (Figura 1.1) en orden a: Carchi (26%), Chimborazo (15%), Cotopaxi
(15%), Tungurahua (14%) y Pichincha (11%) (Reinoso, 2011).

Figura 1.1: Aporte de la produccin de papas por provincias (Reinoso, 2011).

La produccin papera en el pas se divide en tres zonas:

Zona Norte: Carchi e Imbabura

Carchi e Imbabura presentan el mayor ndice de produccin a nivel nacional, poseen

un rendimiento de 21.7 t/ha y produce el 40% de la cosecha anual en el pas. El rea
papera zonal comprende alturas entre los 2800 msnm a 3200 msnm y presenta un clima
fro caracterstico de alta montaa, con temperaturas promedio de 11-12C. En esta zona
las probabilidades de heladas son relativamente bajas (Pumisacho & Sherwood, 2002).

Zona centro: Pichincha, Cotopaxi, Tungurahua, Chimborazo y Bolvar

En la zona centro, la provincia de Chimborazo, a una altura comprendida entre los

2200-3600 msnm, tiene la mayor superficie dedicada al cultivo de la solancea, sin
embargo, el rendimiento de la provincia es bajo (11 t/ha). La temperatura vara entre 6
y 15C. Existen tres zonas de produccin papera: occidente, nororiente y cordillera

central. En la zona de occidente se encuentran los cantones Colta y Riobamba. El cantn

Chambo corresponde a la zona nororiental y el cantn Guano a la cordillera central. En
este ltimo la siembra se puede dar todo el ao. En la provincia de Chimborazo la
produccin del tubrculo se da en diferentes tipos de suelo. Los ms importantes:
Inceptisoles, Mollisoles, Entisoles y Afisoles (Pumisacho & Sherwood, 2002).

Zona Sur: Caar, Azuay y Loja

La zona productora sur es la de menor importancia a nivel nacional. Tiene un

promedio de temperatura entre los 13C y 15C. La mayor produccin se encuentra en la
provincia de Caar, a una altura de 2000 msnm, presenta un rendimiento de 8-10 t/ha.
En las provincias de Azuay y Loja, la produccin de papa es casi nula debido a las bajas
precipitaciones de la zona (Pumisacho & Sherwood, 2002).
1.3.8. Particularidades del Cultivo
1.3.8.1 Requerimientos de Suelo
En el cultivo de papa, su forma, apariencia y rendimiento depende de la textura y
naturaleza del suelo. La papa se produce en suelos bien drenados, que posean materia
orgnica y nutrientes en su composicin. La planta de papa necesita de un suelo suelto,
inclinado, y con buen drenaje para evitar que el agua se empoce; preferentemente el
suelo debe ser profundo y frtil con un pH en un intervalo de 5.0 a 6.0 (Paca, 2009).
Dentro de los mejores suelos para el cultivo de la solancea se encuentran: los
francos, franco-arenosos, franco-limosos y franco-arcillosos. Estos suelos se caracterizan
por ser de color oscuro, poseer una textura liviana y permitir el libre crecimiento de

10

races y estolones. La cantidad de materia orgnica adecuada en el suelo debe ser mayor
al 3.5% en la composicin del terreno (Hurtado & Romn, 2002).
En la sierra ecuatoriana el suelo predominante es de origen volcnico, con altas
concentraciones de aluminio. La ceniza volcnica forma un complejo entre materia
orgnica y minerales. Estas tierras tienen gran capacidad de retencin de agua y alto
poder de fijacin de fsforo (INIAP, 2002).
1.3.8.2. Composicin qumica ptima

Segn Hurtado & Romn (2002), la composicin qumica ptima del suelo apta para
el cultivo de papa se muestra en la Tabla 1.1.
Tabla 1.1 Composicin qumica ptima del suelo para el cultivo de papa (Hurtado & Romn, 2002).

Propiedades Qumicas

Rango ptimo

pH
N
P
K
Ca++
Mg++
Acidez total
Conductividad elctrica

5.5 - 6
Variable
> 28 mg/kg
>5%
65%
18%
< 10 %
< 4 dsm- 1

1.3.8.3. Intensidad lumnica

La cantidad de luz en un cultivo es de importancia para la floracin y fructificacin.
Durante el inicio del crecimiento del tubrculo tendr un efecto marcado sobre su futuro
desarrollo, es fundamental en la sntesis de carbohidratos a travs del proceso de
fotosntesis (CORPOICA, 2000).

11

La intensidad lumnica es de gran importancia en los fotoperodos requeridos por las

plantas; as, uno corto disminuir el crecimiento vegetativo, pero a su vez acumular
mayor cantidad de carbohidratos que aumentar la produccin de tubrculos, y los
fotoperiodos largos favorecen el crecimiento. La cantidad ptima de horas luz para el
cultivo de papa son 12 horas al da (INTA, 2004).
1.3.8.4. Disponibilidad de agua
El efecto de la falta de humedad en el suelo afecta en el rendimiento final de los
cultivos, depende del estado fenolgico de la planta al momento del dficit hdrico. La
disponibilidad de agua en el suelo es uno de los factores que influirn directamente en el
crecimiento del cultivo, en la fotosntesis y en la absorcin de nutrientes; si existe poca
disponibilidad de agua se producir clorosis, marchitamiento foliar y por consiguiente la
disminucin en el rendimiento. Un exceso de humedad ayuda al desarrollo de
enfermedades. La precipitacin o cantidad mnima de agua requerida es de 600 mm,
distribuida en todo su ciclo vegetativo; las mayores demandas se dan en las etapas de
germinacin y crecimiento de los tubrculos, por lo cual es necesario efectuar riegos
suplementarios en los perodos crticos o cuando no se presenta lluvia. Un rango ptimo
de precipitacin para el cultivo de papa es de 800 a 1200 mm durante el ciclo (INIAP,
1984).
1.3.8.5. Temperatura
La papa es una planta termoperidica, es necesario que exista una variacin de por lo
menos 10C entre la temperatura diurna y la nocturna. Si la diferencia es menor, el
crecimiento y tuberizacin se ven afectados. Cuando esta situacin se da a menudo, a lo

12

largo del ciclo vegetativo, el rendimiento y la calidad son afectados, pues las
temperaturas altas son ideales para el crecimiento de tallos y hojas, pero no para los
tubrculos (Hurtado & Romn, 2002).
La temperatura interviene directamente en la produccin de brotes en los
germoplasmas, controla la utilizacin de nutrientes, la prdida de agua e influye en las
etapas fenolgicas del cultivo (INTA, 2004).
La papa requiere de condiciones que permitan su desarrollo como los climas
templados fros y las altitudes que van desde los 2 500 a 3 500 metros, la temperatura
ptima para el cultivo es de 9 a 11C. El cultivo soporta hasta una temperatura mxima
de 18C y debe encontrarse libre de heladas y granizadas (INIAP, 2005).
Las plantas producen ms follaje a temperaturas bajo los 29C. A estas temperaturas
se induce el desarrollo de tallos, el crecimiento de las hojas es atrofiado debido a la
reduccin de la expansin del rea foliar, los niveles de almidn son bajos en las hojas y
los estolones son ms largos. Se retrasa el comienzo del crecimiento del tubrculo y se
demora el inicio del llenado del mismo. Las temperaturas elevadas favorecen el
desarrollo de plagas y enfermedades. La humedad ambiental excesiva empeora el ataque
de lancha negra y la aparicin de otros fitopatgenos (Estrada, 2000; CORPOICA,
2000).

1.3.9. Morfologa de la papa

El desarrollo de la planta puede ser producida a partir de un tubrculo semilla y de
semilla de papa. En el caso de ser producido por medio de un tubrculo, las races

13

tendrn formacin en los brotes del mismo, mientras que el tallo se constituye de nudos
que se encuentran en los brotes del tubrculo (Pieros, 2009).
El tamao de la planta va desde los 0.4 a 1.4 m, poseen tallos leosos y gruesos de
color verde o rojo prpura. El follaje normalmente alcanza una altura entre 0.60 a 1 m.
Las hojas son compuestas y pignadas. Las hojas primarias de plntulas pueden ser
simples, pero una planta madura contiene hojas compuestas en par y alternadas, y
produce un tubrculo, la papa misma, con abundante contenido de almidn. Las hojas se
ordenan en forma alterna a lo largo del tallo, dando un aspecto frondoso al follaje,
especialmente en las variedades mejoradas (Solano, 2007).
El tubrculo de la papa es un tallo subterrneo en su totalidad, el cual funciona como
almacn. A medida que madura, la cantidad de elementos conductores reducen y no
existe una zona de cambium continuo. Sobre la superficie de la exodermis, se confinan
depresiones de la superficie, dentro de las cuales se ubican las yemas vegetativas, y
donde se originan tallos. La formacin de tubrculos es consecuencia de la proliferacin
del tejido de parenquimatoso que estimula el aumento de clulas. El tejido vascular de
los tallos, estolones y tubrculos toma inicialmente la forma de haces bicolaterales.
Mientras el tubrculo crece, se forman tubos cribosos, clulas acompaantes y elementos
del parnquima conductor. Los hidratos de carbono se almacenan dentro de las clulas
del parnquima de reserva; de la mdula y la corteza en forma de grnulos de almidn
(Aucancela et al., 2012; EDIFARM & CIA, 2010).
El aporte nutricional de los tubrculos est dado por el contenido de macro y
micronutrientes y por la biodisponibilidad. En promedio 100 gramos de papa, porcin

14

que consume un individuo adulto, contiene gran cantidad de micro y macro elementos
los cuales se muestran en la Tabla 1.2 El tubrculo contiene gran cantidad de Ca, P y
vitamina C. La vitamina C contenida en una papa es equivalente a la cantidad diaria que
necesita una persona (FAO, 2008).
Tabla 1.2 Aporte nutricional de papa fresca para consumo humano (FAO, 2008)

Componente
Agua
Fibra
Valor calrico
Protena
Carbohidratos
Lpidos
Vitamina C
Hierro
Calcio
Fsforo

Valor
77 g
1.80 g
87 Kcal
1.87 g
20.13 g
0.10 g
13 mg
0.31 mg
5 mg
44 mg

Dependiendo de la variedad, las flores se localizan en racimos terminales al tallo.

Existen factores como el fotoperiodo,

la temperatura y el clima que estimulan la

floracin de la planta. El inicio del periodo de floracin indica la tuberizacin, uno de

los estados fenolgicos ms importantes para la planta (Figura 1.2). Las flores llegan a
tener 4 cm de dimetro, poseen cinco ptalos (Pentmeras) unidos por los bordes
formando una corola (Borja et al., 2010).

15

Figura 1.2 Flor de la planta de papa en invernadero (Galrraga, 2014).

1.3.10. Fenologa del Cultivo

La descripcin fenolgica del cultivo de papa se da en respuesta al comportamiento
fisiolgico varietal frente a condiciones climatolgicas, insumos agrcolas y programas
agronmicos. Las etapas fenolgicas de la planta de papa se inicia con la germinacin
del tubrculo semilla, pasando por varias fases fisiolgicas de tipo vegetativo hasta
alcanzar la madurez fisiolgica y termina con la tuberizacin, dependiendo la variedad.
(Yzarra & Martn, 2011; Borja et al., 2010).
1.3.11. Enfermedades del cultivo de papa
El suelo es el hbitat de muchos microorganismos, en su mayora beneficiosos para
las plantas, una pequea parte causan patologas. Los microorganismos causantes de
enfermedad en las plantas se los conoce como fitopatgenos y pueden ser: bacterias,
virus, hongos, insectos, maleza y nematodos. Los patgenos del suelo han sido
considerados como secundarios dentro de los problemas de los cultivares, pero, en las
ltimas dcadas por el mal manejo del suelo y de la semilla, su presencia ha ido
incrementando preocupantemente. Los fitopatgenos se encuentran en todos los suelos

16

de todas las zonas paperas del pas, con mayor incidencia en zonas fras, hmedas y en
suelos donde es predominante el monocultivo (Jager et al., 1982).
La diseminacin de los fitopatgenos entre cultivos es provocada por el uso de
semilla contaminada, por restos de material vegetal contaminado, por suelo infectado e
implementos agrcolas contaminados. Dentro de las principales enfermedades causadas
por hongos se encuentra el tizn temprano ocasionado por Alternaria solana, el tizn
tardo que es causado por Phytophthora infestans y el cancro de la papa provocado por
Rhizoctonia solani Khn. Estas plagas en la actualidad son controladas mediante el uso
de fungicidas. No existe ningn control totalmente eficaz por lo que se ha optado por
combinar el control por medios qumicos, la resistencia gentica y el manejo cultural.
Hay que recordar que el tizn tardo fue el causante de la hambruna producida en Irlanda
durante los aos 1845 y 1848, en donde hubo una epidemia ocasionada por P. infestans
en los cultivos de papa, y como consecuencia produjo la muerte de ms de un milln de
personas, adems de un alto porcentaje de emigracin de los pobladores (Borba, 2008).
Entre los principales fitopatgenos de suelos paperos se encuentran: la costra negra,
el nematodo del quiste de la papa; que afectan directamente al rendimiento, la sarna y
roa que afectan la apariencia del tubrculo, as como la prdida de valor comercial
(Aucancela et al., 2012).
1.3.12. Caractersticas de enfermedades por fitopatgenos
La gran cantidad de prdidas econmicas es consecuencia de las enfermedades que
contraen los cultivos de papas, independientemente de la manera de contagio. La
infeccin puede ser de diferentes tipos como: bacterial, viral, fngico, por nematodos,

17

insectos, maleza u oomicetos, los mismos que pueden ser clasificados por la especie de
plaga o enfermedad (Prez & Forbes, 2011).
En el caso de enfermedades bacterianas existen de tres clases que son las ms
comunes en la zona andina, marchitez bacteriana, pudricin blanda, pierna negra o pie
negro y la sarna comn. Las condiciones favorables para la plaga que se encuentran
comnmente en las enfermedades bacterianas son campos infestados, semillas
infestadas; dependiendo de la enfermedad se pueden encontrar una mayor propagacin
en climas clidos y en campos anegados (Prez & Forbes, 2011). En el caso de pie negro
y pudricin blanda, pueden ser infectados en el momento de almacenamiento del
tubrculo o en el suelo antes de ser cultivado. Los tubrculos son ms propensos a
adquirir esta enfermedad en el proceso de transporte y cosecha, ya que pueden sufrir
cortes (Castro & Contreras, 2011).
La sintomatologa de la sarna comn no puede ser observada en la parte area de la
planta, debido a que no afecta la parte rea sino que la enfermedad se ubica en el
tubrculo. En fases tempranas de la enfermedad se observa rajaduras en forma de
estrellada, las mismas que aumentan de tamao segn la edad del tubrculo, pueden
llegar alcanzar hasta 8 mm de dimetro, en los tubrculos se observan de diferentes
formas geomtricas las cuales pueden cubrir la mayor parte de la epidermis (Mora et al.,
2011).
La virosis es uno de los tipos de enfermedades virales que se encuentran en la zona
andina. Los sntomas que se reflejan en el cultivo de papa son enanismo en la planta,
amarillento, deformacin de hojas, rigidez, necrosis en nervaduras, entre otros. En

18

algunos casos no presentan sntomas. Las condiciones favorables en la que la plaga se

propaga son por medio de las semillas infectadas, uso de las semillas varias veces, entre
otras (Prez & Forbes, 2011)
1.3.13. Enfermedades fngicas que afectan al cultivo de papa
En climas de alta humedad y con alta precipitacin, las plantas son propensas a
enfermedades causadas por hongos; una enfermedad fngica es reconocida por la
produccin de manchas o necrosis de consistencia seca en las hojas, tallos y tubrculos.
1.3.14. Costra negra
Rhizoctonia solani fue descrito por Julios Khn en el ao de 1858. Este hongo
pertenece a la clase Basidiomycete y se caracteriza por no producir esporas asexuales. R.
solani nicamente en condiciones especiales puede producir esporas sexuales
(basidiosporas). En la naturaleza R. solani se reproduce asexualmente y permanece
como micelio vegetativo, el cual forma estructuras de resistencia llamadas esclerocios,
masas de hifas entretejidas con superficies duras y resistentes que actan como
propgulos. En la superficie del tubrculo R. solani asocia sus hifas con masas de tierra
dando el aspecto de una costra razn por la cual ha tomado vulgarmente el nombre de
costra negra. Su estado sexual es conocido como Thanatephorus cucumeris, se
desarrolla en ciertas condiciones de humedad y de alta temperatura. La forma sexual de
R. solani ha sido encontrado en cultivares de la provincia de Carchi, Tungurahua y
Chimborazo (Alba, 2006).
Rhizoctonia solani Khn, se mantiene en el suelo por restos de plantas enfermas y
principalmente por implementos agrcolas utilizados en la labranza de la tierra de

19

cultivo. La costra negra se caracteriza por atacar a brotes, tallos, estolones y tubrculos,
causando necrosis, marchitez foliar, retardando su emergencia y en ocasiones anulando
la germinacin de la plntula. En tallos, la necrosis estrangula el tejido frenando el
desarrollo y dando paso a la formacin de tubrculos areos. En la epidermis de los
tubrculos maduros se forman los esclerocios, estructuras que ayudarn a la
conservacin del hongo en el campo (Hooker, 1980; Agrios, 2002).
Rhizoctonia. Solani Khn es un habitante natural del suelo y est presente en todas
las tierras paperas del mundo. Costra negra es una enfermedad persistente, muy
adaptable y verstil, es considerada de alta importancia ya que disminuye la calidad de
los tubrculos-semillas debido a la presencia de los esclerocios en la piel de los
tubrculos. Cuando la enfermedad afecta la base de la planta ocasiona cierto
enrollamiento de las hojas semejante a los sntomas de PLRV e interfiere en la
evaluacin, puede ocasionar el descarte de plantas supuestamente infectadas con el virus
del enrollamiento (PLRV), cuando en realidad se trata de plantas afectadas por R. solani
(Agrios, 2002).
La presencia de la costra negra se ha incrementado en los ltimos aos en el pas.
Segn Martn & Torres (1989), R. solani puede llegar a causar la muerte de hasta el 70%
en plntulas. Fankhauser (1997) manifiesta que las prdidas en campos de agricultores
estn alrededor del 25% (INIAP, 2005).
Rhizoctonia solani Khn puede atacar 250 especies de plantas, est presente en
campo y en las bodegas de almacenamiento de tubrculos donde se encuentra el material

20

vegetal que ser utilizado como material de propagacin. De las 250 especies
identificadas, 52 corresponden a plantas asociadas al cultivo de papa (Jager et al., 1982).
Costra negra se caracteriza por presentar tolerancia a la acidez, esta propiedad le
permite mayor supervivencia en condiciones de estrs. Se han documentado que ataques
moderados de este hongo pueden causar prdidas de hasta 20% en los suelos negro
andinos del pas. En el Ecuador R. solani ataca una gran diversidad de plantas,
incluyendo arvejas, habas, cebada y trigo. Se ha demostrado que existe una clara
especializacin dentro de la poblacin por determinados huspedes. Existen formas no
patgenas del hongo que eventualmente actan como antagonistas de las formas
patgenas (Torres, 1997).

1.3.15. Morfologa y citologa de Rhizoctonia solani Khn

En el medio de cultivo, las hifas maduras de Rhizoctonia solani Khn presenta
ramificaciones en ngulos de 90 y 45 a partir de la hifa principal, las cuales se forman
por la constriccin de los septos. En la mayora de las hifas principales se desarrolla una
nueva ramificacin al final. Las hifas jvenes tienen un aspecto transparente y se forman
a manera de malla cubriendo la superficie del medio de cultivo. En el campo existe
una variacin de color entre hifas areas y subterrneas, las subterrneas tienden a
permanecer hialinas, mientras, las areas presentan colores amarillentos y marrones
debido a la acumulacin de melanina dentro de las paredes celulares. R. solani posee
hifas binucleadas y se caracterizan por ser ms finas que las multinucleadas. Su dimetro
oscila entre los 3 a 17 m y la longitud celular vara entre 50 y 25 m. Es importante

21

conocer que R. solani no presenta conexiones clamp, conidios, esclerocios diferenciados

dentro de la corteza y mdula, tampoco se ha conocido de pigmentos diferentes al
marrn en el color en hifas (Marshall, 1980).
Los esclerocios de R. solani estn formados por masas compactas de clulas
monilioides llamadas clamidiosporas o clulas esclerticas, se forman en la superficie de
los tejidos vegetales. Durante la formacin de esclerocios no hay un patrn claro de
organizacin hifal. El color de los esclerocios va desde tonalidades marrones a rosceas.
La forma y el tamao del micelio vara segn el tipo de Rhizoctonia. Los esclerocios de
los grupos de anastomosis 1-1c son pequeos y con formas redondas, mientras que los
esclerocios de otros grupos presentan formas irregulares que varan de 1 a 8 mm de
dimetro (Taheri, 2010).
Los aislados de Rhizoctonia solani Khn pueden esporular en condiciones
ambientales especiales. Las clulas de las hifas cortas se bifurcan frecuentemente y
producen densas acumulaciones donde se forman los basidios, que pueden ser
cilndricos, ovales o esfricos (Whitney, 1964).
En el citoplasma de R. solani se encuentran vacuolas alargadas ubicadas en los
extremos hifales. Se han encontrado grandes vacuolas en clulas maduras. En las clulas
monilioides, los esclerocios presentan depsitos con aceite. Dentro del citoplasma de
Rhizoctonia solani se pueden encontrar otros orgnulos celulares como: ncleo,
mitocondria, vacuolas, retculo endoplasmtico, ribosomas, micro tbulos, lomasomas,
paredes de hifas, poros y septos (Marshall, 1980).

22

La pared celular, la constituye una simple capa de 80 de espesor, con la madurez

del tejido se forman capas adicionales, algunas llegan al espesor de 1 m. La pared del
septo consta de dos zonas ricas en electrones. El septo puede contener de una a varias
lamelas de acuerdo a la edad celular (Whitney, 1964).
El retculo endoplasmtico se encuentra en clulas jvenes, se compone de dos capas
paralelas que forman un conjunto cerrado de cisternas porosas o de lminas apiladas.
Suele ser continuo con el parentosoma alrededor del poro del septo y luego se extiende
hacia el citoplasma (Marshall, 1980).
El nmero de ncleos depende de la Rhizoctonia, por ejemplo, en R. repens las
clulas son binucleadas. Las clulas de R. solani, R. zeae y R. oryzae son
multinucleadas. El nmero de ncleos en clulas viejas es bajo, lo cual ocurre debido a
la formacin de septos en el citoplasma. Los ncleos son de forma oval y se pueden
observar los nuclolos claramente bajo el microscopio de contraste,

la membrana

nuclear suele tener conexiones con el retculo endoplasmtico (Taheri, 2010).

1.3.16. Grupos de Anastomosis (AG)
De acuerdo con observaciones realizadas in vitro por Carling et al. (2002) se
describe la habilidad de fusionar las hifas del fitopatgeno, a este fenmeno se lo conoce
como anastomosis. Se ha logrado clasificar a R. solani Khn en 13 grupos de
anastomosis (AG), que se diferencian tanto morfolgicamente y en su fisiologa por
hospedero, adems de caractersticas moleculares y secuencias de ADN (Anexo I).
El grupo de anastomosis 3 (AG3) son los ms frecuentes en plantas de papa y son
asociados a lesiones que producen necrosis en el tejido, adems, de la formacin de

23

costras negras en los tubrculos, sus esclerocios pueden llegar a soportar variaciones de
temperaturas. El grupo de anastomosis 4 (AG4) es considerado el ms patognico; a
diferencia del grupo de anastomosis 3, no forma esclerocios, soporta altas temperaturas
y afecta otros cultivos asociados a la papa, tambin produce la pudricin de races; sin
embargo, de este mismo grupo se han encontrado aislamientos no patognicos en papa
(Acosta et al., 2011).
Se han encontrado varios gneros de Rhizoctonia spp. que forman un grupo endfilo,
estos se asocian a races de orqudeas que viven en simbiosis, y son esenciales para la
germinacin de semillas y el desarrollo de la planta (Mesa, 2011).
1.3.17. Epidemiologa
Rhizoctonia solani Khn est presente en el suelo de cultivo as como tambin en la
superficie del tubrculo en forma de esclerocios. El grupo de anastomosis 3 se mantiene
en el suelo en forma de esclerocios asociados a masas de tierra. El grupo de anastomosis
4 permanece como micelio en rastrojos (restos de tejidos de hospedantes). La
inoculacin del suelo ocurre cuando un tubrculo-semilla enfermo con costra negra tiene
contacto con la tierra de cultivo; el inculo se incrementa cuando no se hacen rotaciones
de cultivos como maz, trigo o cebada; principalmente con el grupo de anastomosis 3
(AG3) en papa. Las condiciones favorables para el desarrollo del hongo se dan con
suficiente humedad del suelo y temperatura de alrededor de 18C. Es solo en estas
condiciones en donde los esclerocios y los micelios del hongo proliferan y afectan
tejidos jvenes, especialmente en el estado de plntula del cultivo (Acosta et al., 2011).

24

1.3.18. Ciclo de Vida de R. solani Khn

Los esclerocios presentes en la tierra de cultivo son estimulados por exudados
producidos durante el crecimiento celular de las plantas y tambin por la
descomposicin de restos de materia orgnica. Estas estructuras producen micelio que al
tener contacto con la planta ataca las primeras barreras externas del tejido vegetal; el
proceso de infeccin es promovido por la produccin de diferentes enzimas
extracelulares (celulasas) que degradan la pared celular de la planta. El hongo contina
su desarrollo en la superficie externa de la planta causando enfermedad por la formacin
de laceraciones en el tejido vegetal que penetran a las clulas tomando nutrientes para
acelerar su metabolismo (Cotes, 2007).
Como el hongo destruye las clulas de la planta, las hifas continan creciendo y
colonizando el tejido necrosado, muchas veces formando ms esclerocios. El inculo es
producido en el interior o exterior del tejido hospedero, ocurriendo sucesivamente
nuevos ciclos cuando los tubrculos estn formados y el material vegetal est disponible
(Cotes, 2007).
Hofman & Jongebloed (1988) tras un estudio sobre la infeccin de plantas de papa,
sealaron la relacin entre el desarrollo del micelio de R. solani Khn en la superficie de
los brotes con la agresividad de la enfermedad. Observaron que bajo el micelio durante
la infeccin, las hifas pueden penetrar en las clulas de la epidermis del tejido, proceso
causado por la actividad enzimtica del patgeno. La colonizacin del tejido de la planta
es inicialmente restringida a una o dos capas celulares bajo el micelio, la degradacin de
la pared celular y la muerte de sus clulas es ms comn en la tercera y cuarta capa

25

celular; finalmente las lesiones pueden llegar hasta cerca de doce capas de clulas,
alcanzando los haces vasculares del tallo, llegando a diseminarse la infeccin al floema
y en casos agresivos tambin el xilema. Las lesiones que circundan un brote causan
necrosis, ocasionando la aparicin de rebrotes jvenes. Concluyeron que el tamao de la
laceracin causada por la infeccin de R. solani Khn es proporcional al tamao del
colchn de infeccin en la superficie de los brotes, indicando que el dao es producido
despus de la penetracin del hongo desde el colchn de infeccin; el tamao de la
lesin constituye en el tallo un limitante para su crecimiento. Excepto durante la
colonizacin inicial de clulas externas, el micelio nunca se observa en tejido sano; por
lo tanto, el tejido colonizado de la planta se restringe a la parte directamente bajo el
colchn de infeccin. R. solani Khn coloniza el tejido muerto despus de pocos das,
donde puede utilizar los nutrientes liberados de zonas necrosadas para su crecimiento.
Brotes emergidos saludables pueden infectarse severamente y caerse (Hofman &
Jongebloed, 1988).
1.3.19. Sntomas de costra negra
El gnero Rhizoctonia se caracteriza por la formacin de estructuras de resistencia
con redes hifales que unen el micelio con la planta. Esto ha dado origen a la clasificacin
de muchos hongos en el gnero. Los sntomas tpicos de la enfermedad de costra negra
en la papa incluyen: la muerte de brotes emergentes, necrosis de tallos subterrneos y
estolones, disminucin del sistema radical, cambio de coloracin a marrn en las races
y la formacin de esclerocios en tubrculos maduros y en desarrollo (Tsor et al., 2001).

26

Rhizoctonia solani Khn ataca a brotes y tallos a partir de esclerocios presentes en el

suelo o en la semilla. Es fcil identificar campos paperos en el pas con pobre
emergencia debido a costra negra. En las races, los estolones y la parte baja del tallo, el
hongo forma lesiones alargadas, hundidas de color caf rojizo. La infeccin trae consigo
la poda de estolones y races por necrosis, afectando directamente al volumen de raz.
En cuadros ms avanzados, la infeccin de races y tallos se expresa en la parte area
con un enrollamiento hacia la cara superior de las hojas. Se puede presentar clorosis
foliar y formacin de tubrculos areos como producto de la acumulacin de azcares
que no pueden ser transportados a los tubrculos debido a la estrangulacin del tallo. A
veces se observa una mancha de color blanquecina al pie del tallo (INIAP, 2005).
Los sntomas en los tubrculos se pueden parecer a los de la sarna de pradera, pero
difieren de estos ltimos por tener esclerocios y rajaduras. Un ataque severo a las yemas
deforma los tubrculos y causa un fenmeno conocido como tubrculos en formas de
muecas. Cuando el follaje madura y muere, el hongo forma esclerocios delgados y
negros en la superficie del tubrculo. Los sntomas son especialmente visibles despus
de lavar el tubrculo (INIAP-CIP, 2002; Torres, 1997).
Esta enfermedad no siempre est asociada a reducciones de rendimientos, pero la
formacin de esclerocios sobre los tubrculos reduce su calidad comercial, lo que
asociado con el desarrollo de tubrculos mal formados, alteraciones en el tamao y en el
nmero de los mismos, resulta en prdidas econmicas considerables en el cultivo (Jager
et al., 1996).

27

Es importante destacar que las plntulas y tubrculos enfermos (Figura 1.3)

presentan:

Estrangulamiento del cuello de la planta

Una mancha algodonosa en el cuello de la planta
Retardo de desarrollo
Hojas superiores marchitas y enrolladas
Clorosis foliar
Formacin de tubrculos areos
Tubrculos deformes
En la superficie de los tubrculos maduros se forman costras negras llamadas
esclerocios que son estructuras de reproduccin de R. solani Khn.

Figura 1.3. A: Esclerocios de R. solani Khn en tubrculo maduro. B: Necrosis de raz causada por R.
solani Khn (Galrraga, 2014).

28

1.3.20. Control de la enfermedad

La incidencia de costra negra puede disminuir significativamente si se mantiene
cuidadosamente el cultivo de la solancea. Torres (1997) aconseja los siguientes
cuidados para los cultivos:

Usar material germoplsmico libre de esclerocios.

Evitar el monocultivo haciendo rotaciones con cultivos no hospedantes del
hongo, como los cereales.
Realizar la desinfeccin del material vegetal con fungicidas sistmicos, para
proteger a las plantas durante la emergencia.
Aplicar fungicidas al suelo en el momento de la siembra, disminuye los daos
pero no incrementa los rendimientos.
Sembrar el tubrculo de forma superficial para que la planta tenga una mayor
emergencia. La susceptibilidad de la planta a la infeccin disminuye con el
desarrollo del follaje.
La rotacin con papa debe ser amplia, se aconseja realizarlo a 1:5 ciclos.
Acortar el tiempo en que los tubrculos permanecen en el suelo una vez cortado
el follaje.

No todos los esclerocios son viables. No es necesaria una desinfeccin de

semillas de papa para un cultivo si la semilla tiene menos de un 25%.

29

CAPTULO 2 - MATERIALES Y MTODOS

2.1. Participantes

El trabajo de tesis fue realizado por Edison Galrraga, con la direccin de Alma
Koch, MSc. y codireccin de Andrs Izquierdo, PhD.
2.2. Zona de estudio
La investigacin fue ejecutada en conjunto con el Instituto Nacional Autnomo de
Investigaciones Agropecuarias (INIAP). Se busc evaluar el comportamiento de
diferentes materiales germoplsmicos de papa frente al fitopatgeno R. solani Khn a
nivel de invernadero. Se utilizaron ocho variedades de papa de INIAP y doce clones
promisorios distribuidos en cuatro repeticiones y dos testigos aleatorizados en seis
bloques del invernadero.
El estudio molecular se realiz en los laboratorios de Microbiologa de la
Universidad de las fuerzas Armadas-ESPE, campus Sangolqu, y en los invernaderos de
la Estacin cientfica de Santa Catalina de INIAP, ubicada en Cutuglagua.
Duracin de la Investigacin
El proyecto de tesis fue desarrollado en el periodo de abril-diciembre del 2014.
2.3. Revisin bibliogrfica

El proceso investigativo se inici con una revisin bibliogrfica sobre el manejo de

Rhizoctonia solani Khn en el laboratorio, su biologa y manejo. Tambin se

30

consultaron mtodos de aislamiento del hongo a partir de esclerocios, mtodos de

inoculacin en tierra y la caracterizacin de la enfermedad tanto en la plntula como en
el tubrculo.

2.4. Fase de campo-toma de muestras

Se tomaron muestras de papa con Rizoctoniosis o costra negra de la localidad de

San Gabriel, Cantn Montfar, provincia de Carchi, coordenadas 0.6, -77.81667, altura:
2900 msnm, el aislamiento del fitopatgeno se realiz en los laboratorios de
Microbiologa de las Fuerzas Armadas (ESPE).

Las muestras se envolvieron en toallas de papel, se colocaron en un sobre de papel y

se rotularon respectivamente. Las muestras de los tubrculos con sintomatologa de
costra negra se transportaron en un termo.
2.5. Fase de laboratorio
Esta fase se realiz en los Laboratorios de Microbiologa de la Carrera de Ingeniera
en Biotecnologa de la Universidad de las fuerzas Armadas (ESPE), que se encuentran
ubicados en Sangolqu, Av. El Progreso, s/n, Cantn Rumiahui, provincia de Pichincha,
0 18,81 S; 78 26, 64 O; altitud: 2516 msnm.

31

2.6. Aislamiento de Rhizoctonia solani Khn

2.6.1. Preparacin de medio de cultivo
Se prepar medio PDA, usando 39 g de PDA (Difco) por cada litro de agua
destilada, se esteriliz a una temperatura de 121C durante 15 min, una vez que la
temperatura baj a los 37, se coloc 2 L de cloranfenicol por cada litro de PDA, con el
fin de inhibir el crecimiento bacteriano, y se dispens 25 mL en cada caja petri estril
dentro de una cmara de flujo laminar (Figura 2.1) para evitar la contaminacin
ambiental (Castellanos et al., 2007).

Figura 2.1 Dispensacin de medio PDA en cajas petri dentro de una cmara de flujo laminar (Galrraga,
2014).

2.6.2. Desinfeccin de los explantes tubrculos de Solanum tuberosum

Los tubrculos con esclerocios fueron lavados bajo agua corriente para eliminar el
exceso de tierra, se colocaron las muestras en un vaso de precipitacin de 1000 mL
cubierto con una gasa, y se dej caer el agua sobre el vaso durante una hora. Dentro de

32

la cmara de flujo laminar se cortaron las secciones que contenan esclerocios y se

realiz una desinfeccin con Hipoclorito de Sodio (NaClO) 0.5% durante 3 min. Se
lavaron tres veces en agua destilada estril para eliminar los residuos de cloro.
Posteriormente se procedi con la ayuda de un bistur y unas pinzas estriles a separar
los esclerocios del tubrculo para sembrarlos en medio PDA con cloranfenicol, este
ltimo inhibe el crecimiento de bacterias presentes en el medio ambiente y en el
tubrculo (CIAT, 2008).
2.6.3. Aislamiento
Se incubaron los medios con los esclerocios a 22C durante cinco das y segn las
caractersticas morfolgicas de cada colonia, se procedi a separar las cepas de
Rhizoctonia solani Khn haciendo un corte con bistur en el extremo ms alejado de las
dems colonias existentes para garantizar la pureza del cultivo. Se realiz un pase de
medio en PDA con cloranfenicol y se dej incubar. Se observaron las cajas todos los
das para diferenciar las colonias presentes (CIAT, 2008).
2.6.4. Observacin del cultivo al microscopio
Se multiplicaron los medios con Rhizoctonia solani Khn para luego observar al
microscopio y garantizar la pureza del cultivo. Se cort un pedazo de cinta adhesiva
transparente y se peg al micelio del hongo dentro de la caja petri. En un portaobjetos
se coloc una gota de azul de metileno y sobre esta un pedazo de cinta adhesiva con el
micelio del fitopatgeno. R. solani Khn al microscopio muestra una estructura peculiar,
entre sus ramificaciones forma ngulos de 90. No se observaron esporas asexuales, R.

33

solani forma esporas sexuales nicamente en condiciones especiales (Acosta et al.,

2011).

2.6.5. Extraccin de ADN de R. solani Khn

Para obtener el material gentico se utiliz el protocolo de extraccin de ADN en
hongos a partir de medio slido de Goodwin & Lee (1993), modificado por Galrraga
(2014).
Se tom aproximadamente 0.5 g de medio slido, raspando el micelio con un bistur
estril y se coloc en vial de 1,5 mL. Se adicion 200 L de buffer de lisis (50mM Tris
HCL pH 7.2, 50 mM EDTA, 3% SDS y 1% de Mercaptoetanol) y se calent al
microondas durante 10 s al mximo nivel.
Se adicion 200 L del buffer de lisis y se incub a 80C durante 10 min. Se enfri
a 50C, se adicion tambin 12 L de protenasa K y se incub a 50C durante 30 min.
Se agreg v/v de etanol absoluto a la master mix y se centrifug a 10000 g durante
10 min. Una vez centrifugado se tom el sobrenadante y se transfiri a un tubo nuevo
colocando v/v de cloroformo alcohol isoamlico 24:1 y se centrifug a 10000 g durante
10 min.
Se tom el sobrenadante y se coloc en un nuevo tubo eppendorf adicionando 700
L de isopropanol con 70 L de acetato de sodio. La mezcla se dej precipitar 20C
durante toda la noche. Se centrifug a 10000 g durante 10 min. Se adicion 10 L de
RNAsa (1mg/mL) dejando incubar a 37C durante 30 min.

34

Se descart el pellet y se realizaron dos lavados con etanol al 70%. Se elimin el

etanol y se sec durante 10 min a 50C en el Termo bloque, se resuspendi con 50 uL de
agua ultra pura.
2.6.6 PCR anidada para la determinacin del Grupo de Anastomosis 3 (AG3)
Se realiz una nested PCR para la confirmacin del grupo de anastomosis 3 para las
muestras aisladas desde esclerocios (Figura 2.2). En primera instancia se amplific
regiones ITS (Internal Transcripts Spaces). Estos transcritos tienen un sin nmero de
ventajas como: un gran nmero de copias lo que facilita su amplificacin (Van Tuinen et
al., 1999), representacin de una huella informativa para cada hongo (Gardes & Bruns,
1993) y regiones conservadas (5.8S, 18S y 28S) lo que permite un fcil diseo de
primers (Henrion et al., 1994).
En la primera etapa se utilizaron los primers generalistas ITS1 e ITS4 para
amplificar un fragmento de ADN ribosomal de aproximadamente de 700 pb, con el fin
de lograr mayor especificidad. Con el producto de PCR obtenido al amplificar la regin
ITS1-5.8S-ITS2 se utilizaron los primers Rs1F2 y Rs2R1 especficos para AG 3 que
amplifican un fragmento de alrededor de 500 pb (Lees, K. et al., 2002).
2.6.7. Amplificacin de las regiones ITS1-5.8S-ITS2

En la primera PCR para la amplificacin de las regiones ITS1-5.8S-ITS2 del ADN

ribosomal

de

R.

solani

Khn

TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3)
TCCTCCGCTTATTGATATGC-3).

se
y

utiliz:
el

Amplifican

el

primer

primer
un

forward

reverse

fragmento

ITS1
ITS4

de

un

(5(5-

tamao

35

aproximado de 700 pb. La reaccin de PCR con un volumen final de 25 L contena: 1X

buffer de PCR, 1.5 mM de MgCl2, 0.2 mM de dNTPs, 10 mM de cada primer, una
unidad de Taq DNA polimerasa

y 1,5 L de ADN. Los ciclos de amplificacin

utilizados fueron modificados de Fernndez (2011) como se describe a continuacin: un

ciclo inicial de desnaturalizacin a 95 C por 2 min; seguido de 35 ciclos de 95 C por
45 s, 63 C por 60 s y 72 C por 90 s; con un ciclo final de extensin de 72 C por 5 min
(Fernndez, 2011; White et al., 1990).

2.6.8. Amplificacin de regiones especficas para AG-3

La segunda PCR para la confirmacin del grupo de anastomosis 3 (AG-3) utiliz los
iniciadores forward Rs1F2 (5-TTGGTTGTAGCTGGTCTATTT-3) y reverse Rs2R1
(5TATCACGCTGAGTGGAACCA-3). La reaccin de PCR con un volumen final de
25 L contena: 1X buffer de PCR, 2 mM de MgCl2, 0.2 mM de dNTPs, 0.3 mM de
cada primer, una unidad de Taq DNA polimerasa y 2 L del producto de PCR de la
primera fase. Los ciclos de amplificacin a utilizarse fueron: un ciclo inicial de
desnaturalizacin a 95 C por 2 min; seguido de 35 ciclos de 95 C por 45 s, 63 C por
60 s y 72 C por 90 s; con un ciclo final de extensin de 72 C por 5 min (Fernndez,
2011).

36

Figura 2.2 Armada de PCR dentro de una cmara de flujo laminar (Galrraga, 2014).

2.6.9. Electroforesis en gel de agarosa

Los productos de PCR se corrieron en un gel de agarosa al 2%, para lo cual se pes
1.6 g de agarosa (DifcoTM) por cada 80 mL de TBE 1X, se calent en estufa con
agitacin y se llev al microondas donde fue calentada a mxima potencia durante
cortos intervalos de tiempo para evitar que hierva y se derrame. Diluida la agarosa, se
dej enfriar y se coloc el SYBR Green (InvitrogenTM) 1.5X como fluorforo para la
visualizacin de ADN una vez corrida la muestra.
Las muestras se corrieron a 300mA y 100V durante una hora en un ambiente libre de
luz.
2.6.10. Multiplicacin de Rhizoctonia solani Khn
Se realizaron cortes de aproximadamente 0.5 cm en el cultivo madre aislado y se
transfirieron a cajas petri con medio PDA fresco, se sellaron con parafilm y se incubaron
a 24C.

37

La multiplicacin de los cultivos se realiz con el fin de tener suficiente material

biolgico para la siembra en semillas de avena, que sirven como medio de soporte en la
inoculacin de macetas con tierra, en donde se sembr el material germoplsmico de
variedades INIAP y clones promisorios, para determinar su resistencia ante costra negra.
2.6.11. Preparacin del inculo de R. solani Khn
El inculo de R. solani Khn se prepar en semilla de avena previamente
autoclavada. El mtodo utilizado fue tomado de Paulitz & Schroeder, 2005 y
modificado. Se utiliz una proporcin de 2:1 entre avena y agua. En Erlenmeyers de 1 L
se distribuy la mezcla y se autoclav dos veces a 121C durante 15 minutos. Una vez
enfriada la mezcla ya estril, en una cmara de flujo laminar, se procedi a colocar 5 g
de cultivo de R. solani Khn de siete das en cada Erlenmeyer (Figura 2.3). El inculo
permaneci en los Erlenmeyers durante 18 das en un ambiente de 24C sin luz.
Se realizaron dos hidrataciones al inculo, dentro de una cmara de flujo, cada una
de 100 mL (Paulitz & Schroeder, 2005).

Figura 2.3 A: cortes en el medio PDA con R. solani. B: Preparacion del inculo dentro de una cmara de
flujo laminar (Galrraga, 2014).

38

2.6.12. Inoculacin de Tierra con germoplasmas

Las germoplasmas (20 germoplasmas distintos entre variedades INIAP y clones
promisorios) de papa fueron lavados con agua corriente y secados a la sombra, para
despus ser sembrados y tapados con una parte de tierra estril. Se realizaron cuatro
repeticiones con dos tratamientos testigos (sin inculo) (Tabla 2.1).
Tabla 2.1 Materiales germoplsmicos evaluados (Galrraga, 2014)

N
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20

Variedad
INIAP-ESTELA
INIAP-FRIPAPA
INIAP-PUCA
SHUNGO
INIAPNATIVIDAD
INIAPSUPERCHOLA
INIAP-VICTORIA
INIAP-YANA
SHUNGO
RUBI
07-32-15
12-2-6
12-2-18
12-3-3
12-4-71
12-4-46
12-4-170
12-6-1
12-6-24
97-25-3
98-2-6
98-38-12

Tipo
Variedad mejorada
Variedad mejorada
Variedad mejorada
Variedad mejorada
Variedad mejorada
Variedad mejorada
Variedad mejorada
Variedad mejorada
Clon promisorio
Clon promisorio
Clon promisorio
Clon promisorio
Clon promisorio
Clon promisorio
Clon promisorio
Clon promisorio
Clon promisorio
Clon promisorio
Clon promisorio
Clon promisorio

39

Se utilizaron 20 g de avena con R. solani para inocular 3 Kg de tierra autoclavada

(una parte de arena de ro y tres partes de arena de zanja). Se inocul un total de 120
macetas con una capacidad de 3 Kg cada una (Figura 2.4).

Figura 2.4 A: Inoculacin de tierra para la siembra de germoplasmas. B: Materiales inoculados en

invernadero (Galrraga, 2014).

2.6.13. Control de Inculo

Se realiz un control de inculo a los 90 das de haber empezado el experimento en
el invernadero. Se tom 100 g de muestra de suelo a una profundidad de 10 cm dentro
de la maceta. Se mezclaron con 2.5 L de agua, se dej reposar la suspensin durante 30
s y se filtr. Se colocaron entre dos capas de papel estril y se sec. Se coloc la tierra en
platos petri con PDA ms cloranfenicol y se incub 48 h a 24C. Se traspas el hongo a
un nuevo medio con PDA se incubaron 48 h a 24C. Se observ el micelio al
microscopio.

40

2.6.14. Manejo del experimento

Luego de la siembra, se hizo un riego y posteriormente se mantuvo el sustrato en
capacidad de campo. A los 47, 62 y 77 das se realizaron fertilizaciones con 20-19-190.5 MgO (Nitrofosca foliar). Los controles de plagas y enfermedades se realizaron de
acuerdo a la exigencia del cultivo.
El ensayo se mantuvo durante seis meses en condiciones de invernadero en la
estacin experimental Santa Catalina de INIAP en la parroquia Cutuglagua del cantn
Quito (Figura 2.5).

Figura 2.5 A: Invernadero de la estacin cientfica Santa catalina donde se realiz el ensayo. B:
Disposicin de los bloques en el invernadero (Galrraga, 2014).

2.7. Mtodo de evaluacin

El diseo estadstico que se utiliz fue en bloques al azar con un arreglo factorial
con cuatro repeticiones y dos tratamientos testigo. Las evaluaciones se realizaron

41

semanalmente tomando datos de la altura de las plantas, y de la sintomatologa area de

costra negra (hojas deformes y amarillentas, defoliacin, plantas marchitas y muertas).

Se midi el porcentaje de emergencia a los 25, 32 y 49 das despus de la siembra. A

la cosecha se evalu el porcentaje de dao de raz y base de tallo (Clive, 1971), el
porcentaje de esclerocios en el tubrculo y el rendimiento expresado en kg/maceta (ver
Tabla 2.2).

0
4

+1

+2

+3

+4

100

Tabla 2.2 Criterio de Clive para la evaluacin de tubrculos (Clive, 1971).

Escala

Infeccin

Reaccin

(%)
0

Sana

1 a10

Muy ligera

11 a 25

ligera

26 a 50

Moderada

> 51

Severa

Se realiz un ANOVA y pruebas de medias con diferencia mnima de significancia

adems de un anlisis de Tukey para cada variable para poder seleccionar los materiales
germoplsmicos que presentan tolerancia a R. solani.

42

CAPTULO 3 RESULTADOS
3.1. Aislamiento de Rhizoctonia solani Khn
El aislamiento de R. solani a partir de esclerocios de tubrculos infectados fue
conseguido en medio PDA con cloranfenicol (Figura 3.1). Para obtener un cultivo puro
se hicieron constantes traspasos de medio realizando cortes en los extremos del micelio
(Castellanos et al., 2007).

Figura 3.1 Cultivo aislado de Rhizoctonia solani Khn en medio PDA en caja petri (Galrraga, 2014).

Se observ al microscopio la morfologa del micelio del hongo con la tcnica de

tincin de azul de lactofenol (Figura 3.2) para la comprobacin morfolgica del gnero
Rhizoctonia (French, 1982).
El cultivo puro de Rhizoctonia solani Khn se caracteriz por tener un color blanco
en el micelio joven. A medida que maduraba, se torn de un color marrn. R. solani se

43

caracteriza por formar esclerocios a travs de la fusin de hifas, en este proceso se pudo
observar la segregacin de una sustancia de color ambar previo a la formacin de los
esclerocios. Estas estructuras son capaces de sobrevivir a la deshidratacin y a
temperaturas bajas en condiciones de campo (Torres, 1997).

Figura 3.2 Tincin de hifas de Rhizoctonia solani Khn vista en el objetivo de 40X. A: Se observa
ramificacin de la hifa principal en angulo de 90. B: Se observa constriccin de septos y ramificaciones
de hifas jvenes (Galrraga, 2014).

3.2. Extraccin de ADN de Rhizoctonia solani Khn

La metodologa de Goodwin & Lee (1993) modificada por Galrraga (2014)
permiti la extraccin de ADN en concentraciones elevadas y sin contaminacin de
compuestos fenlicos que interfieran con los dems procedimientos.

La concentracin promedio de las muestras procesadas present un valor de 1676

ng/L y una pureza promedio de 1.87; lo que sugiere que el protocolo empleado fue
aceptable para este tipo de muestras (Tabla 3.1).

44

Las concentraciones ptimas necesarias para una PCR rodean los valores de 15
ng/L, por lo que se realiz alcuotas con agua destilada grado PCR y se conservaron las
muestras a -20C para su posterior uso. Las muestras de material gentico pueden
conservarse a -20C durante periodos intermedios de tiempo, luego se debe conservar a 80C, temperatura en la cual puede mantenerse durante aos (Goodwin & Lee, 1993).

Tabla 3.1. Valores de concentracin y absorbancias de ADN total extrado de Rhizoctonia solani
Khn con el mtodo de extraccin a partir de medio slido de Goodwin & Lee (1993).

Muestra Concentracin
A
A(260/280)
(ng/L)
(260/230)
M1-1
M1-2
M1-3
M2-1
M2-2
M2-3

357,8
1853
3339
950,8
2994
563

1,9
2,26
1,46
2,05
1,775
2,03

1,897
1,875
1,678
1,875
1,75
2,16

La cuantificacin fue realizada en el equipo Nanodrop y los resultados dados por

el sistema se muestran en el ANEXO II.

3.3. Nested PCR para la confirmacin de Rhizoctonia solani AG3

3.3.1. Amplificacin de Regiones ITS1-5,8S-ITS2
La amplificacin de la regin ITS1-5,8S-ITS2 del ADN de Rhizoctonia solani Khn
obtenido de esclerocios de Solanum tuberosum mostr buena integridad de bandas, sin
productos inespecficos y sin la amplificacin del control negativo (Figura 3.3). La
regin ITS1-5,8S-ITS2 mostr un tamao aproximado de 700 pb (Hidalgo et al., 1997).

45

Figura 3.3 Electroforesis de la regin ITS1-5,8-ITS2 con su control negativo C (-).Gel de agarosa al
2% teido con 0,05 g/mL (v/v) de SYBR Safe gel stain. Corrida a 100V por 1 h. MM: Marcador de
peso molecular 100 bp (Invitrogen ) (Galrraga, 2014).

3.3.2. PCR especfica para Grupo de Anastomosis 3 (AG3) de Rhizoctonia

solani

Khn
Para la confirmacin del Grupo de Anastomosis 3 (AG3) se utilizaron los productos
de PCR de la amplificacin de las regiones ITS1-5,8S-ITS2. Los primers utilizados
Rs1R2 y Rs2R1, forward y reverse respectivamente, fueron diseados por Lees et al.
(2002). Las muestras de Rhizoctonia solani Khn fueron positivas al grupo de
anastomosis 3 (AG3), presentando bandas de aproximadamente 500 pb, lo cual reporta
Lees et. al (2002) en sus ensayos. No se presentaron amplificaciones de productos
inespecficos ni del control negativo C (-) (Figura 3.4).

46

Figura 3.4 Amplificacin de la regin especfica para AG3 con su control negativo C (-).Gel de
agarosa al 2% teido con 0,05 g/mL (v/v) de SYBR Safe gel stain. Corrida a 100V por 1 h. MM:
Marcador de peso molecular 100 bp (Invitrogen ) (Galrraga, 2014).

3.4. Preparacin del Inculo

La semilla de avena fue humedecida dentro de una cmara de flujo laminar con
agua estril, conforme requeran las condiciones del medio (Figura 3.5-A). Al principio
se cubrieron los Erlenmeyers con parafilm pero a la segunda semana se colocaron
tapones de algodn con gasa estriles para mantener la aireacin del inculo. El inculo
estuvo listo a los 29 das (Figura 3.5-B) y en ese tiempo se realizaron alrededor de cinco
humidificaciones de 100 mL cada una.

47

Figura 3.5. A: Preparacin del inculo de Rhizoctonia solani Khn en semillas de avena. B: Inoculo
R. solani a los 29 das (Galrraga, 2014).

3.5. Sintomatologa area

Dentro de invernadero el comportamiento de Rhizoctonia solani Khn fue distinto al
comportamiento de campo descrito por Acosta et al. (2011). Los cuatro bloques del
invernadero presentaron marchitez foliar a partir de los 45 das de empezado el ensayo.
La sintomatologa de costra negra fue enmascarada por otras enfermedades originadas
del tubrculo semilla, adems, de plagas secundarias y no pudo ser evaluada. Se observ
marchitez foliar en tratamientos testigo, este es el caso de los materiales
germoplsmicos: I-Victoria, 98-2-6, 12-4-170 y I-Rub. Como control de plagas y con el
fin de fortalecer las plantas hasta la tuberizacin se utiliz nitrofosca foliar (20-19-190,5 MgO). Durante el ensayo no se observ la formacin de tubrculos areos en
ninguno de los bloques.

3.6. Anlisis estadstico

Con los datos obtenidos de las mediciones y de la cosecha de los tubrculos se
realiz un anlisis de normalidades para ver el comportamiento de los datos. Una vez

48

identificado el tipo de datos (paramtricos o no paramtricos) se procedi a realizar un

anlisis comparativo de Tukey para encontrar la significancia de los datos y as poder
clasificar las variedades segn su sintomatologa. Se agruparon las variedades en:
altamente tolerantes (AT), tolerantes (T), parcialmente tolerantes (PT) o susceptibles
(S). Se utiliz el software estadstico INFOSTAT.

3.7. Porcentaje de emergencia

Todas las variedades de todos los tratamientos mostraron una emergencia del 100%
a partir de los ocho das de cultivo a excepcin de la variedad mejorada I-Superchola la
cual mostr un 83.3% de emergencia, la primera repeticin de este tratamiento mostr
pudricin del tubrculo por Erwinia carotovora.
3.8. Altura de las variedades inoculadas

Se realizaron controles peridicos de la altura de las plantas a partir de los tres

meses de iniciado el ensayo. El anlisis de varianza para la altura de la planta present
una baja significacin estadstica de la diferencia de alturas entre los tratamientos
inoculados respecto a los tratamientos testigo. La media de la altura fue 41.83 cm y el
coeficiente de variacin para la altura de las plantas fue de 30.05% como se muestra en
la Tabla 3.2.

49

Tabla 3.2 Anlisis de varianza de la altura de las plantas de papa del ensayo de evaluacin de la
resistencia ante Rhizoctonia solani Khn.

F.V.
GL
117
TOTAL
TRATAMIENTOS 38
79
ERROR
X (%)
CV (%)

CM

Fc

284.90
151.54
41.83
30.05

La media aritmtica del promedio de altura para los 40 tratamientos fue analizada
estadsticamente mediante un anlisis de Tukey. La variedad I-Rub result ser la de
menor tamao en ambos tratamientos (Figura 3.6).

En los tratamientos inoculados, la menor altura de planta, se present en la variedad

mejorada I-Rub con un valor de 20.25 cm. En rangos de alturas compartidas (AB) se
encontraron el resto de tratamientos con un rango de 28.75 cm (clon promisorio 12-6-1)
a 55.50 cm (variedad mejorada I-Puca) (Tabla 3.6).

En los tratamientos testigos con la menor altura de planta, se present la variedad

mejorada I-Rub con 21 cm de altura de planta mientras que el resto de variedades
mostraron rangos compartidos (AB) con un promedio de 27.50 cm (Variedad mejorada
I-Estela) hasta 61.50 cm (Clon promisorio 07-32-15), la mayor altura para este
tratamiento la tiene el clon promisorio 12-3-3 con un valor promedio de 65.50 cm (Tabla
3.3).

50

Figura 3.6 Diagrama de barras para las alturas de las plantas con su error estndar (Galrraga,
2014).

Las alturas de todos los tratamientos incluyendo inoculados y testigos se mostraron

similares. Los tratamientos testigo mostraron una mnima diferencia estadstica en su
altura a comparacin con los bloques inoculados.

51
Tabla 3.3 Alturas promedio y pruebas de Tukey para la variable altura de planta en el ensayo de
evaluacin de la resistencia ante Rhizoctonia solani Khn.

TRATAMIENTOS INOCULADOS

TRATAMIENTOS TESTIGOS

PROMEDIOS

RANGOS

PROMEDIOS

RANGOS

I-RUBI

20.25

A*

I-RUBI

21.00

A*

12-6-1

28.75

AB

I-ESTELA

27.50

AB

I-VICTORIA

31.50

AB

I-VICTORIA

33.00

AB

12-4-46

33.50

AB

I-FRIPAPA

33.00

AB

98-2-6

34.25

AB

12-2-18

33.00

AB

I-FRIPAPA

35.25

AB

98-38-12

35.00

AB

I-NATIVIDAD

35.75

AB

12-6-1

36.50

AB

I-SUPERCHOLA

35.75

AB

38.50

AB

12-2-6

36.50

AB

I-YANA
SHUNGO
SUPERCHOLA

40.00

AB

I-YANA SHUNGO

38.50

AB

98-2-6

40.50

AB

I-ESTELA

40.00

AB

I-NATIVIDAD

45.00

AB

98-38-12

44.50

AB

12-2-6

45.50

AB

12-4-170

45.25

AB

12-6-24

47.50

AB

12-2-18

45.75

AB

12-4-46

47.50

AB

12-3-3

46.00

AB

12-4-170

55.50

AB

12-6-24

46.25

AB

97-25-3

55.50

AB

12-4-71

47.00

AB

12-4-71

56.00

AB

07-32-15

48.50

AB

I-PUCA SHUNGO

56.00

AB

97-25-3

51.25

AB

07-32-15

61.50

AB

I-PUCA SHUNGO

55.50

AB

12-3-3

65.50

3.9. Evaluacin a la cosecha de los tubrculos

La evaluacin de los tubrculos se realiz a los seis meses de comenzado el ensayo
en invernadero. Se cort el follaje una semana antes de la cosecha con el fin de acelerar
la madurez de los tubrculos, garantizando la acumulacin de materia seca, factor
importante en la calidad del tubrculo.
A la cosecha de los tubrculos se observ que los veinte materiales inoculados,
mostraron similar sintomatologa en todos los bloques, la necrosis de raz, fue el factor

52

comn en todas las variedades. El 80% de las races y tallos de los tratamientos
inoculados se encontraban necrosadas por R. solani. Este sntoma se observ con mayor
intensidad en la variedad I-Rub del cuarto bloque (Figura 3.7-A) y en el clon promisorio
97-25-3 del segundo bloque (Figura 3.7-B).

Figura 3.7 A: Necrosis en tallo de la variedad I-Rub del cuarto bloque a los cinco meses de
iniciado el ensayo. B: Necrosis de tallo en el clon promisorio 97-25-3 del segundo bloque a los 135 das
del cultivo (Galrraga, 2014).

Se encontr la formacin de tubrculos en forma de muecos en las variedades: IEstela, I-Victoria y en el clon promisorio 12-2-6. En las variedades: I-Fripapa, ISuperchola, I-Yana Shungo, I-Rub, y en los clones 98-2-6 y 98-38-12 se encontr
sntomas de sarna causados por la bacteria Streptomyces scabies. Los tratamientos
testigo no presentaron sintomatologa en los tubrculos y mostraron buena apariencia.
En el ANEXO III se describe la sintomatologa presentada por maceta de cada
variedad por cada bloque.

3.10. Severidad de la infeccin

Se utiliz el criterio de Clive para la evaluacin y clasificacin de los tubrculos
segn la sintomatologa de costra negra. Se realiz un anlisis de varianza y se encontr

53

un coeficiente de variacin (C.V.) de 39.16% y una media de infeccin de esclerocios de

22.50% en variedades inoculadas, una suma de cuadrados de 351.74 y un valor de
contraste (FC) de baja significancia ( 0.05) (Tabla 3.4).
Tabla 3.4 Anlisis de varianza del porcentaje de severidad de la infeccin de papas del ensayo de
evaluacin de la resistencia ante Rhizoctonia solani Khn.

F.V.
TOTAL
TRATAMIENTOS
REPETICIONES
ERROR
X (%)
C.V. (%)

GL
79
19
3
57

CM
351.74
60.64
77.66
22.52
39.16

Fc
*

Para el anlisis de Tukey del porcentaje de infeccin del tubrculo (Tabla 3.8) se
encontraron cuatro rangos de significancia los cuales relacionaron y clasificaron los
materiales germoplsmicos evaluados segn la tolerancia presentada. Los resultados
muestran que al menos uno de los tratamientos inoculados fue diferente a los dems. En
el primer rango compartido (AB), se encuentran 17 de los materiales germoplsmicos
evaluados. La variedad mejorada I-Rub present el valor ms alto de infeccin con
34.78%, seguido por el clon 97-25-3 con 33.10%, I-Fripapa con 30.13% y el clon 98-3812 con 29.30% de severidad (Figura 3.8). El clon promisorio 12-2-6 obtuvo el menor
valor dentro de este rango con un promedio de infeccin de 14.38%, mostrando una
tolerancia parcial (TP) a Rhizcotonia solani Khn.

54

Figura 3.8 Tubrculos con costra negra de la variedad mejorada I-Rub. A: I-Rub primera repeticin. B:
I-Rub segunda repeticin. C: I-Rub tercera repeticin. D: I-Rub cuarta repeticin (Galrraga, 2014).

Los ms bajos niveles de infeccin por costra negra se encontraron dentro del rango
compartido CD. El clon promisorio 12-4-170 obtuvo un valor de 6,93% de infeccin en
tubrculos (Figura 3.9-A). El clon promisorio 12-6-1 obtuvo un valor de 5.62% de
severidad en el tubrculo, mostrando una tolerancia moderada (TM) a costra negra
(Figura 3.9-B). La variedad mejorada I-Puca es considerada como altamente tolerante
(AT) a costra negra con un valor de 0.00% de severidad (Figura 3.9- C).

55

Figura 3.9 A: Tubrculos del clon promisorio 12-4-170, primer bloque. B: Tubrculos del clon
promisorio 12-6-1, primer bloque. C: planta y tubrculos de la variedad 3 correspondiente a I-Puca, cuarto
bloque (Galrraga, 2014).

De los 20 materiales germoplsmicos en estudio: la variedad (I-Puca) present alta

tolerancia; dos se mostraron tolerantes (clones promisorios: 12-4-170 y 12-6-1); nueve
se presentaron parcialmente tolerantes y ocho fueron encontrados susceptibles (Tabla
3.5). Las variedades ms susceptibles a Rhizoctonia solani Khn fueron: I-Rub, seguido
del clon promisorio 97-25-3 e I-Fripapa. Ninguno de los testigos present
sintomatologa (Figura 3.10).

56

Figura 3.10 Diagrama de cajas con sus media de la severidad de las variedades de papa inoculadas
(Galrraga, 2014).

Las variedad y clones promisorios: I-Estela, 98-2-6, I-Yana Shungo, 12-3-3, mostraron
Suceptibilidad (S) a Rhizoctonia solani Khn con una media de 28.67% de severidad.
Estas variedades mostraron gran nmero de esclerocios en el tubrculo y altos niveles de
necrosis en raz.

57
Tabla 3.5 Resultados del anlisis de tukey, rangos de los valores promedios del porcentaje de
infeccin de costra negra en tubrculos de papa. Tipo de resistencia: alta resistencia (AR), resistencia ,
resistencia parcial (RP) o susceptibilidad (S).

TRATAMIENTOS INOCULADOS

VARIEDAD

TRATAMIENTOS TESTIGO

% DE
RANGO
INFECCIN
A

RUBI
97-25-3
I-FRIPAPA
98-38-12
12-3-3
I-YANA
SHUNGO

34.78
33.10
30.13
29.30
29.15
28.63

A
A
AB
AB
ABC

98-2-6
I-ESTELA
I-NATIVIDAD
12-6-24
12-2-18
12-4-71
I-SUPERCHOLA
07-32-15
I-VICTORIA
12-4-46
12-2-6
12-4-170
12-6-1
I-PUCA SHUNGO

28.60
28.33
25.00
24.75
24.53
24.38
23.03
22.33
19.10
18.03
14.38
6.93
5.62
0.00

ABC
ABC
ABC
ABC
ABC
ABC
ABCD
ABCD
ABCD
ABCD
ABCD
BCD
CD
D

TIPO DE
RESISTENCIA

VARIEDAD

%
INF

S
S
S
S
S
S

RUBI
97-25-3
I-FRIPAPA
98-38-12
12-3-3
I-YANA SHUNGO

0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00

S
S
PT
PT
PT
PT
PT
PT
PT
PT
PT
T
T
AT

98-2-6
I-ESTELA
I-NATIVIDAD
12-6-24
12-2-18
12-4-71
I-SUPERCHOLA
07-32-15
I-VICTORIA
12-4-46
12-2-6
12-4-170
12-6-1
I-PUCA SHUNGO

0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00

3.11. Nmero de tubrculos

En el anlisis de varianza del nmero de tubrculos por tratamiento, no se
encontraron diferencias estadsticas significativas entre los tratamientos. Se encontr un
coeficiente de variacin (C.V.) de 50.08% y una media de produccin de 7.91 tubrculos
por maceta (Tabla 3.6). Para los tratamientos testigo se observ coeficientes de variacin
de 38.60%, una media de produccin de 9.90 tubrculos por maceta, una suma de
cuadrados de 5.97 para los tratamientos inoculados y de 3.18 para los tratamientos no

58

inoculados. Se encontr que en ambos tratamientos la variable nmero de tubrculos con

respecto al estado de la planta (inoculada y no inoculada) no tienen relacin (Figura
3.11).

Figura 3.11. Diagrama de la variable nmero de tubrculos por variedad con sus respectivas medias
(Galrraga, 2014)

59
Tabla 3.6 Anlisis de varianza para la variable nmero de tubrculos de tratamientos inoculados y
testigo del ensayo de evaluacin de la resistencia ante Rhizoctonia solani Khn.

INOCULADO
F.V.
GL
CM
79
TOTAL
19
48.37
TRATAMIENTOS
3
5.97
REPETICIONES
57
15.60
ERROR
7.91
X (%)
50.08
CV (%)
TESTIGOS
F.V.
G.L.
CM
37
TOTAL
18
39.10
TRATAMIENTOS
1
3.18
REPETICIONES
18
15.30
ERROR
9.90
X (%)
38.60
CV (%)

Fc
*

Fc
*

El anlisis de Tukey para la variable nmero de tubrculos asoci dos rangos de

significancia. En el primer rango (A) se encontraron doce variedades, ocupando el
primer lugar con mayor nmero de tubrculos el clon promisorio 12-6-24 con un
promedio de 17.5 por tratamiento seguido de: I-Natividad con 13.88, I-Victoria con
11.50, el clon 97-25-3 con 10.75 e I-Rub y el clon 98-38-12 ambos con un promedio de
8.75 tubrculos por maceta. La variedad con menos produccin en este rango es el clon
promisorio 12-2-6 con un promedio de 6,43 tubrculos por tratamiento. El segundo
rango (B) agrup ocho variedades. El clon promisorio 98-2-6 present la mayor
produccin con un promedio de 6,25 tubrculos por tratamiento. La ms baja produccin
la obtuvo el clon promisorio 12-4-170 con un promedio de 3 y el clon 12-6-1 con 3.45
tubrculos por tratamiento.

60

En los tratamientos testigo se observ tres rangos de significancia. En el primer

rango (A) se destacan: el clon promisorio 12-6-24 con un promedio de 20.50 tubrculos
por tratamiento y la variedad mejorada I-Natividad con un promedio de 15.50
tubrculos. El segundo rango compartido (BC), agrup a 17 germoplasmas en los que
incluyen las variedades: I-Victoria, I-Superchola, I-Friapa, I-Yana Shungo, I-Estela e IPuca Shungo. En el ltimo rango (C), la variedad I-Yana Shungo con un promedio de
4.50 tubrculos por tratamiento (Tabla 3.7).
Tabla 3.7 Prueba de Tukey para la variable nmero de tubrculos del ensayo de evaluacin de la
resistencia ante Rhizoctonia solani Khn.

TRATAMIENTOS
INOCULADOS
VARIEDAD
12-6-24
I-NATIVIDAD
I-VICTORIA
97-25-3
I-RUBI
98-38-12
12-4-71
07-32-15
I-SUPERCHOLA
12-2-18
I-FRIPAPA
I-ESTELA
12-2-6
98-2-6
12-3-3
I-YANA
SHUNGO
12-4-46
I-PUCA
SHUNGO
12-6-1
12-4-170

PROMEDIO RANGO
17.50
A
13.88
AB
11.50
ABC
10.75
ABC
8.75
ABC
8.75
ABC
8.50
ABC
8.25
ABC
7.75
ABC
7.50
ABC
7.25
ABC
7.25
ABC
6.25
BC
6.25
BC
6.00
BC
6.00
BC
4.50
4.75
3.45
3.00

TRATAMIENTOS
TESTIGOS
VARIEDAD
12-6-24
I-NATIVIDAD
12-4-46
97-25-3
I-SUPERCHOLA
98-2-6
12-2-18
I-VICTORIA
12-4-71
12-2-6
12-4-170
98-38-12
I-ESTELA
12-3-3
RUBI
I-FRIPAPA

BC 07-32-15
BC I-PUCA
SHUNGO
BC 12-6-1
C I-YANA
SHUNGO

PROMEDIO RANGO
20.50
A
15.50
AB
15.00
BC
14.50
BC
14.00
BC
13.00
BC
13.00
BC
11.00
BC
9.50
BC
8.50
BC
8.00
BC
8.00
BC
8.00
BC
7.00
BC
6.50
BC
5.50
BC
5.50
5.50

BC
BC

5.00
4.50

BC
C

61

3.12. Rendimiento total en gramos

En la Tabla 3.8, se muestra el anlisis de varianza para los tratamientos inoculados y

testigos. El coeficiente de variacin fue de 54,88% para los tratamientos inoculados y
de 36,93% para los tratamientos testigo. Los promedios de rendimiento en gramos por
maceta fueron de 69,55 g en los tratamientos inoculados y de 95,55 g en los tratamientos
testigo. Existe una relacin con significacin estadstica entre la variable rendimiento
respecto al estado de la planta (inoculada y no inoculada).

Tabla 3.8 Anlisis de varianza para la variable gramos por maceta de tratamientos inoculados y
testigo del ensayo de evaluacin de la resistencia ante Rhizoctonia solani Khn.

TRATAMIENTOS INOCULADOS
F.V.
GL
CM
Fc
79
TOTAL
19
57.20
*
TRATAMIENTOS
3
545.16
REPETICIONES
57
1404.16
ERROR
69.55
X (%)
54.88
CV (%)

En la prueba de Tukey para la variable de produccin (g/maceta) se encontraron dos

rangos de significancia distinguidos (Tabla 3.9). El primer rango (A), present 19
variedades, el clon promisorio 98-38-12 obtuvo el mayor rendimiento promedio con
120,18 gramos por maceta. La variedad mejorada I-Puca tuvo el menor rendimiento con
13,51 gramos por maceta. El segundo rango (AB), abarc 19 variedades, el rendimiento
ms alto se lo tuvo la variedad mejorada I-Fripapa con 118,58 gramos por maceta. El
menor rendimiento present el clon 12-6-1 con 11,80 gramos por maceta (Figura 3.12).

62

Los tratamientos testigo se distribuyeron en

cuatro rangos de significancia. El

primer rango (A) present 15 variedades en el clon promisorio 98-2-6 obtuvo un

rendimiento de 192 gramos por maceta. En el segundo (AB) se agruparon 17
tratamientos. El clon promisorio 98-38-12 y la variedad mejorada I-Natividad tuvieron
los mejores rendimientos, con 163,75 y 141,95 gramos por maceta respectivamente.
El tercer rango (BCD) abarc 13 tratamientos. La variedad mejorada I-Rub obtuvo
el mayor rendimiento con un promedio de 140 gramos, el ms bajo rendimiento lo
obtuvo el clon promisorio12-3-3 con 60.50 gramos. El ltimo rango (D) present cuatro
materiales germoplsmicos, la de menor rendimiento fue el clon promisorio 12-6-1 con
un promedio de 10.25 gramos por maceta seguido de los materiales vegetales: I-Puca
Shungo con 15.50 g, el clon 12-2-6 con 22.50 g y el clon 12-4-170 con 30.50 g por
maceta (Tabla 3.9).
Los materiales inoculados tuvieron un rendimiento menor en comparacin a los no
inoculados. Existi una reduccin de rendimiento de casi un 30% en los tratamientos
inoculados.
Tabla 3.9 Prueba de Tukey para la variable rendimiento por maceta del ensayo de evaluacin de la
resistencia ante Rhizoctonia solani Khn.

TRATAMIENTO INOCULADO
VARIEDAD
PROMEDIO RANGO
98-38-12
120.18
A
I-FRIPAPA
118.58
A
I-NATIVIDAD
115.70
AB
RUBI
112.95
ABC
98-2-6
111.63
ABC
I-ESTELA
96.85
ABCD
12-6-24
85.13
ABCD

TRATAMIENTO TESTIGO
VARIEDAD
PROMEDIO RANGO
98-2-6
192.00
A
98-38-12
163.75
B
I-NATIVIDAD
141.95
BC
I-RUBI
140.00
BCD
I-VICTORIA
138.25
BCD
I-ESTELA
128.75
BCD
I-FRIPAPA
120.20
BCD
CONTINA

63
I-YANA
SHUNGO
12-4-71
07-32-15
I-VICTORIA
97-25-3
12-2-18
ISUPERCHOLA
12-2-6
12-3-3
12-4-170
12-4-170
I-PUCA
SHUNGO
12-6-1

78.50
76.75
74.75
68.63
65.38
63.13
51.33

ABCD I-YANA
SHUNGO
ABCD 07-32-15
ABCD 12-2-18
ABCD I-SUPERCHOLA
ABCD 12-6-24
ABCD 12-4-46
ABCD 12-4-71

45.63
27.63
27.50
22.93
13.51

ABCD
ABCD
BCD
AB
AB

11.80

97-25-3
12-3-3
12-4-170
12-2-6
I-PUCA
SHUNGO
B 12-6-1

119.85

BCD

111.25
106.25
90.50
86.50
85.25
80.00

BCD
BCD
BCD
BCD
BCD
BCD

67.25
60.50
30.50
22.50
15.50

BCD
BCD
CD
CD
CD

10.25

Figura 3.12. Diagrama de bloques de la variable rendimiento en variedades inoculadas y no inoculadas

(Galrraga, 2014).

64

CAPTULO 4 DISCUSIN
Prado et al. (2001) manifiesta que la utilizacin de variedades resistentes a
fitopatgenos se considera primordial en el manejo integrado de costra negra en el
campo, debido a que

representa menor costo de produccin, adems de que su

utilizacin genera bajo impacto ambiental por la disminucin de fungicidas para el

control de Rhizoctonia solani Khn.
El cancro de la papa o costra negra ocasiona lesiones, principalmente a nivel de
tallos, races y tubrculos. Aucancela et al. (2012) corrobora que R. solani afecta la
apariencia del tubrculo y consecuentemente causa la prdida de valor comercial. Torres
(1997) reporta prdidas de hasta el 20% de cultivos por R. solani. Estos son algunos de
los argumentos por los que se ha buscado en esta investigacin, materiales
germoplsmicos que presenten mayor resistencia al hongo causante de la costra negra.
Segn INIAP-DNPV (2009) el uso de semilla sana se considera el componente ms
importante para reducir las enfermedades causadas por fitopatgenos de suelo y afirma
que es posible reducir su incidencia hasta un 20%. INIAP-DNPV (2010) explica que
mediante el uso de semilla sana sumado a la rotacin de cultivos se pueden disminuir las
infecciones hasta un 28%. La utilizacin de una semilla de calidad y con tolerancia a
costra negra, reducir en gran porcentaje las prdidas econmicas del sector papero del
pas.
En este ensayo se evaluaron frente a costra negra veinte germoplasmas de papa de
diferentes procedencias genticas. Dentro del grupo de germoplasmas a evaluarse se
incluan variedades mejoradas que han sido el resultado de cruces con lneas nativas que

65

han permanecido hasta la actualidad (I-Puca Shungo e I-Yana Shungo). Siempre los
agricultores han sido un factor importante en la domesticacin, la seleccin y
mejoramiento de las variedades de cultivos importantes para el hombre, un buen ejemplo
es la papa (Estrada, 2000).
4.1. Aislamiento e identificacin de Rhizoctonia solani Khn

El cultivo utilizado en este ensayo fue aislado a partir de tubrculos que presentaban
esclerocios del fitopatgeno. Segn Chavarro (2011) los cultivos de R. solani jvenes
en medio PDA se caracterizan por tener el micelio de un color blanco, y que a medida
que envejece se torna de un color caf claro y empieza a formar esclerocios. El cultivo
aislado siempre cont con esas caractersticas. Es importante durante el aislamiento
utilizar antibiticos que controlen el crecimiento de bacterias en el medio, en nuestro
caso se utiliz cloranfenicol. Agrios (2002) recomienda el uso de cloranfenicol al
0,005% en medio PDA para aislar fitopatgenos de suelo.
Giovannini et al. (2005) afirma que Rhizoctonia solani Khn visto al microscopio
presenta ramificaciones en ngulo recto, constriccin de ramificaciones y la formacin
de un septo cerca del punto de origen. De acuerdo con estos criterios la cepa aislada
concord con las caractersticas y se la identific como R. solani Khn. De acuerdo a la
capacidad de fusionar hifas, R. solani se clasifica en grupos de anastomosis, los grupos
ms recurrentes segn Giovanini et al. (2005) son los: AG3, AG4, AG5 y AG8, siendo
el grupo de anastomosis 3 (AG3) el ms patognico. Este grupo se caracteriza por
formar estructuras de resistencia fusionando sus hifas con masas de tierra o materia

66

orgnica. En medio de cultivo PDA de la cepa aislada se pudo constatar la formacin de

esclerocios a partir de la segunda semana de la siembra (Cotes, 2007).
Sumado a la confirmacin morfolgica de las colonias se realiz una PCR de
confirmacin de grupo de anastomosis, segn Lees et al. (2002) la regin gentica que
confirma el grupo de anastomosis 3 (AG3) se encuentra alrededor de los 500 pb. En el
ensayo se obtuvieron bandas de alrededor de 500 pb que confirm que el fitopatgeno
aislado se trat de R. solani AG3.
Al realizar la amplificacin de las regiones ITS1-5,8S-ITS2 las temperaturas de
ciclos propuestas por White et al. (1990) de un ciclo a 95C por 3 min, seguido de 35
ciclos a 55C durante 30 s, 72C por 2 min, 95C por 30 s y un ciclo final de extensin
por 10 min a 72C no amplificaron de buena manera, por lo que se procedi a realizar
pruebas de variacin de temperaturas, y se tuvo que la mayor amplificacin para la
regin ITS1-5,8S-ITS2 se obtiene con un ciclo inicial de desnaturalizacin a 95C por 2
min; seguido de 35 ciclos de 95C por 45 s, 63C por 60 s y 72C por 90 s; con un ciclo
final de extensin de 72C por 5 min, temperaturas que coinciden con la amplificacin
de la regin AG3 propuesta por Fernndez (2011).
4.2. Preparacin del inculo de Rhizoctonia solani Khn
Carling et al. (2002) menciona que el grupo AG3 de Rhizoctonia es uno de los
grupos de anastomosis ms dainos para la planta, debido a la formacin acelerada de
esclerocios y la colonizacin agresiva de tallos y races, esto se corrobor durante la
etapa de multiplicacin de los cultivos. Se observaron condiciones de crecimiento
aceleradas y con formacin temprana de esclerocios. Como en el ensayo se utilizaran

67

germoplasmas experimentales y se tendran que evaluar hasta su cosecha, se opt por

utilizar 20 g de inculo en avena por cada 3 Kg de tierra y no 20 g por cada 1 Kg como
lo propone Farah et al. (2008). Con la modificacin de la cantidad de inculo por Kg de
tierra se obtuvieron buenos resultados, las plantas enfermaron y se pudo seleccionar los
materiales germoplsmicos con tolerancia a costra negra. Wharton et al. (2007) afirma
que el inculo en semilla de avena es tan daino como el proveniente de suelo en el
campo, si los rganos de la planta se desarrolla en proximidad al inculo.

4.3. Sntomas de R. solani Khn

Durante las primeras instancias del trabajo de invernadero se presentaron pocas
caractersticas areas de costra negra. Se pudo observar algunas hojas de la base que
presentaban clorosis en varios tratamientos. Tsor et al. (2001) describe algunas de las
caractersticas de la colonizacin de Rhizoctonia solani Khn e incluye la clorosis foliar
como un sntoma visible en etapas tempranas de la colonizacin del tejido del
hospedero. I-Estela e I-Rub fueron las variedades que mostraron una clorosis foliar
temprana durante los primeros 45 das a partir de la siembra, se observ tambin un
cambio en la coloracin de la base del tallo hasta presentar una necrosis de color marrn
con severos daos a nivel de epidermis. En el resto de materiales los sntomas de
clorosis foliar fueron enmascarados por plagas secundarias que presentaron similar
sintomatologa. La necrosis en tallo es caracterstica en una planta de papa con la
enfermedad de costra negra. La zonas necrosadas tuvieron un color amarillento en sus
primeras instancias, despus de colonizado todo el tejido del rea afectada se volvi de
color marrn. En condiciones avanzadas de la enfermedad puede presentar superficies
blanquecinas con el micelio de Rhizoctonia solani Khn (INIAP, 2005).

68

La sintomatologa de costra negra, a nivel de campo, incluye sntomas como: la

formacin de tubrculos areos, la presencia de hojas enrolladas hacia el envs en las
partes superiores, estrangulamiento del cuello de la planta, tubrculos deformes y
esclerocios en la superficie del tubrculo (Aucancela et al., 2012). En el ensayo a nivel
de invernadero no se manifest toda la sintomatologa descrita por Aucancela et
al.(2012). No se observ la formacin de tubrculos areos, enrollamiento de hojas
caracterstico de la Rizoctoniosis, ni una clara estrangulacin de tallo, pero a la cosecha
se encontr que R. solani haba colonizado tejidos radicales y de tallo en todos los
tratamientos evaluados como los describe el ANEXO III. La presencia o ausencia de
algunos de los sntomas de costra negra en los materiales evaluados dependen de la
tolerancia y del comportamiento del cultivar (Mesa, 2011).
Las races y estolones pueden ser infectados por R. solani en cualquier etapa
fenolgica de la planta, pero la mayor incidencia ocurre en etapas tempranas del
desarrollo Wharton et. al. (2007) menciona que la tolerancia de la variedad incrementa
despus de la emergencia del brote, limitando la colonizacin de los tejidos. La
severidad de la infeccin por R. solani depende principalmente de la tolerancia gentica
de la variedad infectada.
A la cosecha se observ tallos y races necrosadas en los 20 tratamientos con
inculo y solo en la variedad I-Rubi fue evidente la presencia de manchas algodonosas
sobre la base del tallo, evidencia de la fase sexual de R. solani, Tsor (2001) menciona
que las basidiosporas y el micelio formado en esta fase sexual no causa dao a la planta.

69

4.4. Control de altura de la planta

Durante el ensayo se realizaron controles peridicos de altura a partir de los tres
meses de la siembra. Los datos obtenidos fueron sometidos a un anlisis estadstico en
INFOSTAT en el cual se identific que la variable altura no present una diferencia
significativa entre tratamientos inoculados y tratamientos testigo. Se observaron
variedades que en ambos tratamientos fueron las ms pequeas, este es el caso de I-Rubi
con una altura promedio de 20,25 cm y 21 cm en los tratamientos inoculados y testigo
correspondientemente. INIAP (2005) corrobora que la variedad I-Rubi se caracteriza por
ser una variedad semirastrera y de baja altura. A pesar del fenotipo de la variedad, las
plagas secundarias pudieron afectar el crecimiento de las plantas ya que los fidos y
Oidium afectan directamente a las hojas, por ende, a la fotosntesis; afectando el
metabolismo. I-Puca Shungo se destac por su gran altura en todos los bloques. Se
tuvieron valores promedio de 55,50 cm y 65,50 cm en los tratamientos inoculados y
testigos correspondientemente. Andrade et al. (1995) manifiesta que el factor altura
puede deberse a aspectos genticos de los materiales y no a la presencia de costra negra.

4.5. Evaluacin de los tubrculos

I-Estela, I-Yana Shungo, I-Rub y el clon promisorio 12-2-6, presentaron tubrculos
en forma de muecos. Giovanini (2005) describe que esta deformidad es caracterstica
de un estado avanzado de la enfermedad de costra negra y que estos se producen por
inhibicin del crecimiento de las areas de tejido colonizado por costra negra. En las
variedades: I-Fripapa, I-Superchola, I-Yana Shungo, I-Rub, y en los clones promisorios
98-2-6 y 98-38-12 se encontr sntomas de sarna causados por la bacteria Streptomyces
scabies. Prez & Forbes (2011) afirma que la sarna que afecta a la papa se transmite en

70

el tubrculo semilla y que es asociada a la enfermedad de costra negra, en este ensayo se

pudo observar que nueve de las veinte variedades presentaron sntomas de sarna a la
cosecha (ANEXO III).

4.6. Severidad de la Infeccin

En ocho de los materiales evaluados se observaron altos porcentajes de severidad.
Existen materiales germoplsmicos que se encuentran en una escala de 3 segn el
criterio de clasificacin de Clive (1971) con un porcentaje de infeccin de hasta 35%, el
anlisis estadstico de este parmetro junto con los criterios de clasificacin utilizados en
el ensayo (Tabla 2.2) hacen es factible la clasificacin de materiales por la tolerancia
presentada.
Mediante los anlisis de varianza y las prueba de Tukey realizadas se encontr que
existi alta significancia estadstica que relacionan la variedad inoculada y la severidad.
Mediante los parmetros de severidad ante costra negra dados por Clive (1971) se logr
separar las variedades que presentaron tolerancia de las susceptibles, esto basndose en
una clasificacin de los tubrculos dependiendo del porcentaje de infeccin y la reaccin
presentada, se agrup los materiales germoplsmicos en cuatro categoras: altamente
tolerantes (AT), tolerantes (T), parcialmente tolerantes (PT) y susceptibles (S). Los
materiales tolerantes encontrados en esta investigacin deben ser probados en campo
para continuar con la seleccin de un tubrculo semilla con resistencia a costra negra.

Los datos analizados en INFOSTAT y la sintomatologa observada en invernadero

declaran a la variedad I- Puca Shungo como altamente tolerante. La variedad I-Rub se
la encontr susceptible ante Rhizoctonia solani Khn, el anlisis realizado junto a las

71

caractersticas de sintomatologa area descritas por Tsor et al. (2001) se confirma la

relacin entre sintomatologa area y severidad de la colonizacin del tubrculo.

4.7. Rendimiento
Despus de realizar el anlisis estadstico de la variable rendimiento por maceta se
encontr que el coeficiente de variacin (C.V.) fue de 50.08% y una media de
produccin de 7.91 tubrculos por tratamiento. Se observ que para los tratamientos
testigo, el coeficiente de variacin di un valor de 38.60% y una media de produccin de
9.90. El anlisis de Tukey reporta una diferencia estadstica significativa en la variable
nmero de tubrculos con respecto al inculo. En el ensayo se encontraron reducciones
de rendimiento de hasta un 28%. INIAP (2005) reporta perdidas de rendimiento de hasta
un 30% en cultivares del pas, indicando que R. solani AG3 es causante de grandes
prdidas econmicas del sector papero, adems, Jager et al. (1996) corrobora que las
enfermedades del suelo afectan a la prdida de valor comercial de los tubrculos como
se observa en los datos de severidad obtenidos en este estudio.

4.8. Plagas y control del ensayo

Se observ en primeras instancias la muerte de una plntula del segundo bloque de
la variedad Superchola y se encontr que el tubrculo estaba en putrefaccin por
Erwinia carotovora spp. carotovora.
Existieron plagas no esperadas que afectaron a la sintomatologa area. Una de estas
fue el Oidium, que ingres al invernadero en plantas contaminadas provenientes de otro
ensayo. En cuestin de 30 das, a pesar de haber eliminado el foco de contaminacin, ya

72

haba contaminado algunas plantas del tercer bloque del invernadero. En cuestin de
cinco meses todos los bloques se encontraban con sintomatologa de odium. Castillo
(2008) describe la sintomatologa como un micelio enteramente superficial que atacan
rganos jvenes que se manifiesta en forma de manchas blanquecinas pulvurulentas, las
manchas causan lesin en las hojas semejantes a los de una quemazn, conforme ha
avanzado la enfermedad, produce el secamiento y marchitez de la planta. Se realizaron
tres fumigaciones con NIMROD, un fungicida sistmico preventivo y curativo para el
control de Oidium.
Un factor crtico durante la aparicin de sntomas areos fue los sntomas de virosis
en las hojas de la mayora de variedades. Esto posiblemente fue transmitido por vectores
que se encontraban en el tubrculo antes de la siembra. INIAP-DNVP (2009) aconseja el
uso de semilla sana para evitar enfermedades durante el crecimiento de la planta de
papa. En los bloques del invernadero se hizo evidente una gran presencia de fidos que
se extendi a partir del segundo mes desde la siembra. Segn Hooker (1980) los fidos
son vectores para la transmisin de virus y describe que la sintomatologa se presenta
fundamentalmente en las hojas jvenes de la parte apical, y que toman una coloracin
plida, amarillenta; pudiendo llegar a enrollarse hacia arriba. Las caractersticas de
infeccin de virus estuvieron presentes en el ensayo, enmascarando la sintomatologa
area de costra negra, debido al similar marchitamiento y enrollamiento de hojas. A
pesar de estos factores imprevistos, se realizaron tres fertilizaciones foliares para ver si
los sntomas desaparecan o cuales persistan, las plantas mejoraron el aspecto pero
volvieron a decaer enseguida.
French (1982) aconseja que para una buena investigacin fitopatolgica se necesita
tener conocimiento del origen del sujeto de estudio (en este caso los materiales

73

germoplsmicos), tambin menciona que si se va a trabajar con un fitopatgeno en

especial se debe esterilizar la tierra del experimento, y tener cuidado en la preparacin
del inculo, enfatiza que el control de enfermedades y plagas comunes se puede llevar a
cabo durante todo el ciclo experimental. Todas esas medidas fueron tomadas a lo largo
del ensayo en el invernadero. Se cree tambin que la sintomatologa area como
tubrculos areos y el estrangulamiento del cuello de la planta, no fueron observados
con claridad debido a las condiciones de estrs de las plantas, Castellanos (2007) indica
que el comportamiento de Rhizoctonia solani Khn es diferente en campo, laboratorio e
invernadero; esto debido a que en campo puede existir mayor humedad y una
temperatura favorable para el desarrollo del micelio. Las plantas en el invernadero
estuvieron libres de estrs climtico; las variaciones de temperatura y de humedad de los
materiales evaluados en el ensayo estuvieron controlados.
La presencia de plagas secundarias en el ensayo no intervino con la seleccin de los
materiales germoplsmicos. Castillo (2008) afirma que Oidium es una enfermedad que
afecta solo a partes areas de la planta, no existe influencia sobre la tuberizacin. A
pesar de que la sintomatologa area fue enmascarada, los bloques del invernadero se
mantuvieron hasta la cosecha con la ayuda de fungicidas foliares.
Hooker (1980) menciona que la virosis puede afectar a los rendimientos solo cuando
es una infeccin secundaria, en el caso del ensayo los fidos fueron los vectores de la
enfermedad y esta ocurri durante el desarrollo de las plantas, por ende se trat de una
infeccin primaria y no influenci en la produccin de los bloques. La clasificacin de
los materiales germoplsmicos se bas en la severidad de la infeccin como lo describe
Clive en sus criterios de seleccin.

74

CAPTULO 5 CONCLUSIONES

Rhizoctonia solani Khn AG3 fue aislada a partir de esclerocios de papa infectada
con costra negra.

Se encontr que la variedad I-Puca shungo presenta tolerancia a Rhizoctonia solani

Khn con un porcentaje de infeccin del 0%. Las variedades 12-6-1 y 12-4-170
presentan una tolerancia moderada a costra negra con porcentajes de infeccin de
5.62% y 6.93% respectivamente.

La variable altura no mostr diferencias en el comportamiento de tratamientos

inoculados respecto al grupo control.

Los materiales inoculados con Rhizoctonia solani Khn

presentaron una

disminucin en el rendimiento de hasta un 28% en comparacin con sus tratamientos

testigo.

75

CAPTULO 6 RECOMENDACIONES
Se recomienda realizar pruebas de campo para poner a prueba la resistencia de las
variedades seleccionadas. El comportamiento de Rhizoctonia solani Khn en las
variedades evaluadas puede ser diferente en condiciones de campo. Las condiciones
ambientales en este ensayo fueron controladas y la inoculacin fue homognea.
Existen muchas variedades nativas que pueden presentar resistencia a costra negra.
Deberan ser puestas a prueba como se lo ha hecho con variedades de INIAP en este
ensayo. Variedades nativas han permanecido hasta hoy en da por presentar resistencia
fitopatgenos de suelo y a factores de estrs climtico. El estudio de variedades con
resistencia gentica a fitopatgenos es de gran importancia. Se pueden disminuir
impactos ambientales del uso de fungicidas mediante su uso.
Se debera ampliar el estudio molecular de la interaccin patgeno-husped para R.
solani Khn, as se lograra conocer los factores moleculares y genes que le dan
resistencia a especies nativas de papas. Los genes de resistencia a costra negra podran
ser utilizados en cultivos asociados a Rhizoctonia solani para el control de la
enfermedad.

76

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81

ANEXO I
Grupos de anastomosis para Rhizoctonia solani Khn (Chavarro, 2011)
AG1-1 A (= AG tipo1)
Crece rpidamente, 30 mm/da a 28-30C. Su ptimo es a 30C
AG 1 IC (AG1 TIPO 3)
Patgeno virulento que se cra en climas fros, causa camping off a zanahoria, alforfn,
lino soja y pino
AG 1 inespecfico
Patgeno de remolacha azucarera, col, repollo, judas y soja.
AG2-1
Este grupo tiene crecimiento lento (13mm/da a 25C). Son patgenos de cultivos de
invierno formando esclerocios rojos en forma de anillo. Causa camping off en
crucferas, fresa, tabaco japons, tulipn y en trbol subterrneo
AG2-2IIIB
Es un grupo que crece a altas temperaturas (ptimo aproximadamente 30C). Son
patognicos de arroz, jengibre, gladiolos, csped, trigo, remolacha azucarera, batata y
provoca camping off en plntulas de rboles, crisantemos y batata china.
AG2-2IV
Patgeno de remolacha azucarera, csped

82

AG2-2-2 (inespecfico)
AG3
Crece unos 12mm/da a 25C. Patgeno de patata, tomate y tabaco.
AG-4
Se define como tipo pratcola. Segn algunos autores representa a algunas especies (R.
pratcola.).
Se suele aislar del suelo con plantas infectadas en pases de clima hmedo. Ataca a
tomate, guisante, espinaca, patata. Camping off en pinos y otros hospedantes en estado
de plntula, cebolla, guisante, patata y juda.
Hay aislados no patgenos que protegen a rabanitos, zanahoria, algodn, patata y trigo
de camping off, estimulando el crecimiento de la planta.
AG-5
Patgenos dbiles de patata, csped, juda, soja y azuki. Algunos se micorrizan con
orqudeas
AG-6
No son patgenos, algunos micorrizan a orqudeas.
AG-7
No son patgenos.
AG-8
Patgeno de cereales.

83

AG-9
Patgeno de crucferas, patata pero menos patognicos que AG-3.
AG-10
Probablemente no son patgenos
AGBI
No son patgenos.
AGUNK
Patgeno de de arroz, no se fusionan con ningn grupo.

84

ANEXO II
Resultados de la cuantificacin de ADN de Rhizoctonia solani Khn

85

ANEXO III
Sntomas observados en veinte materiales de papa evaluados en invernadero
(Galrraga, 2014)

Variedad

Bloque

Sintomatologa de Tubrculos

I-ESTELA

Tubrculos en forma de muecos

Races necrosadas

Necrosis caf oscura en raz

principal
Necrosis raz-Tubrculos en forma
de muecos

4
2

I-FRIPAPA

I- PUCA SHUNGO

I-NATIVIDAD

I-SUPERCHOLA

I-VICTORIA

I-YANA SHUNGO

Necrosis de raz

Races necrosadas sntomas de

sarna en tubrculos

Necrosis caf oscura en

principal sntomas sarna

Necrosis raz sntomas de sarna

Necrosis de raz

Necrosis de raz

Necrosis de raz

Necrosis raz principal

Necrosis de races

Necrosis raz principal

Necrosis raz principal

Necrosis de races

No present necrosis raz

Planta no brot

Necrosis raz sntomas de sarna

Sntomas de sarna

Necrosis en raz

Necrosis en raz - tubrculos en

forma de muecos

Necrosis en raz - tubrculos en

forma de muecos

Necrosis en raz - tubrculos en

forma de muecos

Necrosis en raz

Necrosis en raz

Tubrculos en forma de muecos

raz

86
4
8

10

11

12

13

14

15

16

RUBI

07-32-15

12-2-6

12-2-18

12-3-3

12-4-71

12-4-46

12-4-170

12-6-1

Tubrculos forma de muecos

Sntomas de sarna

Necrosis en raz Sntomas de

sarna
Tubrculos en forma de muecos

Sntomas de sarna

Necrosis de raz

Necrosis en tallo y races

Necrosis en tallo y races

Necrosis en tallo y races

Necrosis en tallo y races

Tubrculos pequeos y en forma de

muecos

Tubrculos pequeos y en forma de

muecos

Tubrculos pequeos y en forma de

muecos

Necrosis de raz

Necrosis en raz

Necrosis en raz

Necrosis en raz

Necrosis en raz

Raz necrosada Tubrculos en

forma de muecos y podridos

Raz necrosada Tubrculos en

forma de muecos y podridos

Sntomas de sarna

Raz necrosada

Necrosis en raz

Necrosis en raz

Necrosis en raz

Necrosis en raz

Raz y tallo necrosado

Raz y tallo necrosado

Raz y tallo necrosado

Necrosis en tallo sin tubrculos

Necrosis en raz

Raz y tallo necrosado

Necrosis raz no hay produccin

Necrosis de raz

Necrosis en raz

Necrosis de raz

Necrosis de raz

Necrosis de raz

87
17

12-6-24

1
2
3
4

18

97-25-3

1
2
3
4

19

20

98-2-6

98-38-12

Necrosis raz coloracin

oscuro
Necrosis raz coloracin
oscuro
Necrosis raz coloracin
oscuro
Necrosis raz coloracin
oscuro
Necrosis raz coloracin
oscuro
Necrosis raz coloracin
oscuro
Necrosis raz coloracin
oscuro
Necrosis raz coloracin
oscuro sntomas de sarna

caf
caf
caf
caf
caf
caf
caf
caf

Necrosis raz

Necrosis raz sntomas de sarna

Necrosis raz sntomas de sarna

Necrosis raz

Necrosis raz Sntomas de sarna

Necrosis raz Sntomas de sarna

Necrosis raz Sntomas de sarna

Necrosis raz