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TITULO
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS
DE LA MATRIZ AMBIENTAL: _____Agua____
ASESORA
Dr. ROSA RICO MATA
DATOS DE IDENTIFICACIN DE LOS ANALISTAS
Fecha de inicio del anlisis: 1 de julio de 2015
Fecha de trmino: 13 de julio de 2015
Nombre
Gonzlez Snchez Carla Valeria
Cargo
Responsable
Administrador
Laboratorista 1
Laboratorista 2
Laboratorista 3
GENERACIN: 2014-2016
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Aguas termales de
comanjilla
SITIO DE
MUESTREO
Hora de siembra:2:05 pm
2.Parmetros Fisicoqumicos
Color: Sin color(Transparente)
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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
1. Justificacin del proceso para la identificacin bacteriana
El proceso de la identificacin de bacterias comienza con las pruebas bioqumicas, las cuales son un conjunto
de reacciones que determinan la actividad metablica de las bacterias, a partir de un sustrato que se incorpora
en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no, as como tambin la presencia o ausencia
de la fermentacin y realizando este proceso se realiza la identificacin de bacterias pero para ello, hay que
partir de un cultivo puro obtenido en el aislamiento, resembrado de una colonia bien aislada.
2. Dos medios de siembra (Nombre y Composicin)
(1) Violeta rojo y bilis agar
(2) Agar para mtodos estndar
Receta:
Extracto de levadura3.0
Receta:
Peptona...7.0
Peptona de casena..............5.0
Sales biliares..1.5
Extracto de levadura...............2.5
Dextrosa..1.0
Agar Bacteriolgico..15.0
Lactosa..10.0
pH 7.0 0.2
Cloruro de sodio...5.0
Rojo neutro..0.03
pH 7.0 0.2
Cristal violeta....0.002
Agar.15.0
Morfologa Colonial (Medio 1)
Descripcin
En este medio se observan como colonias de color rojo
prpura, azul intenso de 1 a 2 mm de dimetro,
rodeadas, generalmente, de una zona rojiza de bilis
precipitada. Con un borde redondo y regulares y
pequeas y grandes colonias puntiformes en donde
crecen juntas y separadas como tambin crecimiento
plano de las bacterias.
Descripcin
Es un medio se observan las colonias son
puntiformes de forma circular
de diferentes
tamaos: grande, mediano y pequeas en el que
presentan un color blanco a crema hasta incoloras
crecimiento de pequeas colonias planas y
punteadas.
Imagen
Imagen
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composicin:
Extracto de levadura..3.0
Peptona7.0
Sales biliares.1.5
Lactosa.10.0
Cloruro de sodio..5.0
Rojo neutro..0.03
Cristal violeta...0.002
Agar.15.0
Peptona gelatina17.0g
Peptona casena...1.5g
Peptona de tejido animal...1.5g
Lactosa ...10.0g
Sales biliares.1.5g
Cloruro de sodio...5.0g
Rojo neutro...0.03g
Cristal violeta.0.001g
Agar..........13.5g
Imagen
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4. Procedimiento de Aislamiento
(describir detalladamente la cantidad de materiales y los pasos a seguir)
Materiales/Reactivos/Medios de cultivo/ Equipo a utilizar
Material
Medio de cultivo
2 cajas Petri.
1 matraz Erlenmeyer de 250 ml.
Agar de bilis y rojo violeta
1 charola de pesado.
1 esptula.
1 pizeta.
1 mechero de bunsen.
Equipo de rotulacin.
Agua de ionizada.
1 probeta de 100ml.
1Membrana s-pak 0.45 m 47 mm blanca cuadriculada.
Pinzas de acero.
Soporte magntico para Filtros.
Equipo para esterilizar (algodn, papel destreza gasas y papel aluminio).
Equipo
Autoclave.
Incubadora.
Balanza analtica.
Campana de flujo laminar.
Bomba de vaco.
Colector de Aluminio para
embudos de filtrado.
1. Utilizar un equipo de filtracin en campana de flujo laminar previamente preparada para condiciones
de esterilidad.
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7. Se coloca la membrana dentro de una caja Petri sobre el medio de cultivo Agar de bilis y rojo violeta,
con la cuadricula hacia arriba, procurando que no se formen burbujas entre la membrana y el medio de
cultivo.
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8. Las placas con la membrana cuadriculada se llevan a incubar sin invertir en la estufa.
NOTA: no se puede invertir la caja Petri con la membrana ya que esta se caera.
3. Tomar con el asa bacteriolgica al microrganismo o bacteria que obtuvo en la siembra que se realiz
anteriormente por membrana para despus hacer una serie de estras en un lado de la caja con
movimientos rpidos de la mano.
Nota:( tener cuidado de no rasgar el agar al momento de hacer el estriado.)
4. Trabajar en sentido a las manecillas del reloj llevando los microorganismos de un cuadrante a otro.
5. Flamear el asa bacteriolgica y del ltimo punto del estriado, estriar el siguiente cuadrante con
movimientos rpidos de la mano
6. Seguir con los dems cuadrantes calentando el asa bacteriolgico y barrer en forma de S desde el
primero hasta el cuadrante adyacente
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Gramm -
Gramm +
Catalasa +
Movilidad -
Movilidad +
Produccin de ndol+
produccion de indol -
Prueba de citrato+
Prueba de citrato
azcares.
Pico alcalino (rojo) / fondo cido (amarillo). Glucosa fermentada. Lactosa
y sacarosa no fermentadas.
Pico cido (amarillo) / fondo cido (amarillo). Glucosa fermentada.
Lactosa y/o sacarosa fermentadas.
Produccin de gas: Se evidencia por la aparicin de burbujas o
fragmentacin del medio.
Sulfuro de hidrgeno: Se evidencia por el ennegrecimiento del medio.
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FOTO 1
FOTO 2
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1.-Tincion de
gram
Medio de cultivo
utilizado
Resultado
obtenido
(positivo/negativo)
N/A
Negativo
Evidencia fotogrfica
Fundamento de la prueba
Se utiliza para poder diferenciarse la morfologa celular bacteriana que radica en la diferente estructura de la
pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared,
mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de peptidoglicano ms fina y una capa lipopolisacardica
externa.
Tras la tincin con el primer colorante (Cristal violeta) se efecta un lavado conetanol que arrastrar al colorante
slo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el colorante queda retenido. Las clulas Gram (-) se teirn
despus con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse.
Considerndose gram positiva a las que se visualizan de color moradas y gram negativas a las que se visualizan de
color rosa o rojo.
2.-Movilidad
Agar SIM
Negativo
Fundamento de la prueba
La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde ms all de la lnea
de inoculacin. Se realiza una siembra en picadura, y tras incubar 24 h. observamos si se ha producido
crecimiento en torno a la zona inoculada.
Las bacterias tienen movilidad por medio de sus flagelos, que se encuentran principalmente entre los bacilos; sin
embargo algunas formas de cocos son inmviles. Las bacterias mviles pueden contener un solo flagelo o
muchos; adems su localizacin vara con su especie bacteriana y las condiciones de cultivo. A veces, las bacterias
con movilidad producen variantes no mviles que parecen ser estables y raramente se revierten en formas
mviles. Los organismos no mviles carecen de flagelos, en el caso del medio SIM (medio semislido) los
microorganismos mviles pueden apreciarse por la turbidez que producen alrededor de la puncin de siembra.
-Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento ms all de la lnea de siembra.
-Resultado negativo: crecimiento solamente en la lnea de siembra.
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3.-Citrato
Caldo citrato de
coser
Negativo
Fundamento de la prueba
Citrato de sodio es una sal del cido ctrico, un compuesto orgnico simple que constituye uno de los
metabolitos del ciclo de los cidos tricarboxilicos. Generalmente los microorganismos que emplean el citrato
como nica fuente de carbono, utilizan sales de amonio como nica fuente de nitrgeno. El metabolismo del
citrato realizado, por algunas bacterias se realiza por el ciclo de krebs y requiere el desdoblamiento del citrato
por la enzima citritasa (citrato-oxalacetato-liasa o citrato desmolasa) en presencia de magnesio o manganeso y
de transportadores como citrato permeasa.
La citritasa acta sobre el citrato produciendo cido oxalacetico y acetato; productos que son convertidos
enzimaticamente a piruvato y dixido de carbono. Durante esta reaccin el medio comienza a alcalinizarse por
el CO2 que se genera, el cual se combina con el agua y el sodio para formar Carbonato un producto alcalino.
Citrato de sodio
4.-Catalasa
No aplica
Azul de bromotimol
(Azul)
pH 7.6
Positivo
Fundamento de la prueba
La catalasa es una enzima que poseen la mayora de las bacterias aerobias. Descompone el perxido de
hidrgeno en agua y oxgeno. El desprendimiento de burbujas procedentes del oxgeno indica que la prueba es
positiva. El perxido de hidrogeno es un compuesto producido en pequeas cantidades durante la respiracin
aerbica. Su produccin esta medida por flavo protenas.
H202 + e- + H+
H2O + OH-
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5.-Fermentacin
de Lactosa
No crecimiento
Fundamento de la prueba
Es una prueba usada para la fermentacin de lactosa por parte de la bacteria sumndole produccin de gas.
Superficie acida/profundidad acida (pico amarillo/ fondo amarillo) fermenta la lactosa, si la superficie es
alcalina/ profundidad alcalina (pico rojo/fondo rojo) no fermenta lactosa. La presencia de burbujas o ruptura
del medio de cultivo produce gas.
Importante en la identicacin de bacterias entricas.Fermentadoras de lactosa: Escherichia,
Klebsiella,Enterobacter. Nofermentadoras: Salmonella,Proteusy Shigella
de Glucosa
Fundamento de la prueba
La oxidacin de la glucosa produce cido pirvico por una va de derivacin (Shunt), ocurre en condiciones
aerobias y no requiere de fosforilacin inicial.
Superficie la superficie es alcalina/ profundidad alcalina (pico rojo/fondo rojo) no fermenta glucosa. La
presencia de burbujas o ruptura del medio de cultivo produce gas.
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7.-Fermentacin
de Sacarosa
Agar trile
azcar de
hierro
Negativo
Fundamento de la prueba
Es una prueba usada para la fermentacin de sacarosa y la produccin de H2S por parte de la bacteria
sumndole produccin de gas.
Superficie acida/profundidad acida (pico amarillo/ fondo amarillo) fermenta sacarosa, si la superficie es
alcalina/ profundidad alcalina (pico rojo/fondo rojo) no fermenta sacarosa. La presencia de burbujas o ruptura
del medio de cultivo produce gas.
La produccin de H2S se manifiesta por la aparicin de un precipitado color negro debido a la reduccin de la
sal de hierro presente en el medio.
8.-Indol
Agar SIM
No crecimiento
Picadura
Fundamento de la prueba
Permite detectar la produccin de indol, producto de la degradacin metablica del aminocido triptofano. Las
bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con produccin
de indol, cido pirvico y amonaco. El indol desdoblado de la molcula de triptofano puede ser detectado
cuando reacciona con el grupo aldehdo del para-dimetilamino benzaldehdo del reactivo revelador (reactivo de
Kovacs), formndose un complejo de color rojo.
Triptofanasa
Trp
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9.Rojo de Metilo,
Caldo RM-VP
Negativo
Fermentacin
Acido-mixta
Fundamento de la prueba
Este ensayo pone en evidencia la capacidad del microorganismo de realizar fermentacin Acido-mixta. Parte
del piruvato se metaboliza produciendo cantidades menores de cido lctico, frmico y actico, la mayor parte
del piruvato se condensa formando acetilmetilcarbinol, que es reducido a 2,3-butilenglicol, productos que son
neutros. (Prueba positiva color rosado -violceo en la parte superior del tubo; Prueba negativa no tiene
coloracin).
Microorganismos por cada 4 molculas de piruvato formadas, reducen dos a cido lctico y dos las metabolizan
para formar cido actico y frmico; parte del acetato pasa a etanol y parte del frmico a CO2y H2en
cantidades iguales.
Reaccin ()Amarillo,
Reaccin (+) Rojo
10.-Produccin
Caldo RM-VP
No crecimiento
de metabolitos
neutros,
fermentacin
butilengliclica
de glucosa
Fundamento de la prueba
Este ensayo pone la capacidad del microorganismo de producir acetilmetilcarbinol (Acetona) a partir de la
fermentacin butilengliclica de la glucosa. La glucosa puede ser metabolizada por los microorganismos, a
travs de distintas vas metablicas. Segn la va utilizada, se originarn productos finales cidos (cido lctico,
cido actico, cido frmico), o productos finales neutros.
En el medio de cultivo, la pluripeptona aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano y la
glucosa es el hidrato de carbono fermentable.
MICROBIOLOGA AMBIENTAL UTL
ASESORA:
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