PRACTICA: Determinacin y

caracterizacin del Acido ascrbico en

naranja
Presentado por:
Arce Arbildo Lady
Hachoque Cristobal Edditt
Hilasaca Carlos
Sauceda Plasencia Nivia
Docente:
Mg Sc. Ing. Indira Betalleluz
Curso:
Qumica de Alimentos Avanzada

ESCUELA DE POST GRADO

ESPECIALIDAD DE TECNOLOGA DE ALIMENTOS

DICIEMBRE 2007, PERU

I.

INTRODUCCIN

El cido ascrbico o vitamina C es un nutriente esencial en la dieta humana. La

vitamina C, funciona como un cofactor redox y un catalizador en una amplia
serie de procesos y reacciones bioqumicas. En humanos, la vitamina C sana y
previene el escorbuto, por ello la designacin de cido ascrbico. El trmino
"Scurvy" o "scurfy", en el ingls antiguo, probablemente se deriv de los
trminos escandinavos, skjoerberg y skorbjugg, queriendo decir piel spera o
costrosa. En la historia humana, adems de la hambruna, el escorbuto ha
causado la mayora de los padecimientos de origen nutricional (Johnston et al.,
2001).
Esta enfermedad fue descrita por los antiguos griegos, egipcios y romanos,
siendo asociado por mucho tiempo a los ejrcitos invasores, marinas de guerra
y exploradores. Aun al final del ltimo siglo, el escorbuto estaba ampliamente
generalizado en medio de los mineros de oro de California y Alaska. En 1747,
el Capitn James Lind, mdico de la armada britnica, demostr que el
escorbuto, era consecuencia de la falta de ingesta de frutas y verduras frescas.
Lind demostr que la mejor forma de prevenirlo se lograba agregando a la dieta
diaria de la tripulacin un poco de jugo de limn (Braverman, 1980; Davey et
al., 2000).
El grupo que desarrolla la nomenclatura para vitaminas haba propuesto que el
nuevo factor antiescorbtico sea llamado "factor o vitamina C", ya que la "A" y
"B" haban sido previamente designadas como factores potenciales de salud y
de crecimiento o vitaminas. En 1915, Zilva y sus asociados del Instituto Lister
en Londres haban aislado la actividad antisorbtica de una fraccin cruda de
limn. Utilizando ensayos animales demostraron que la actividad se destruye
por oxidacin y es protegida por agentes reductores (Braverman, 1980;
Johnston et al., 2001). En 1928, Szent-Gyorgyi y Haworth lograron aislar el
cido ascrbico en forma de cristales (Davey et al., 2000). Debido a su gran
aporte por el estudio de la vitamina C, ambos recibieron el Premio Nobel en
1937 (Eitenmiller y Landen Jr., 1999).

Debido a su alta sensibilidad a los factores externos, la vitamina C ha sido

utilizada para definir la vida til durante el almacenamiento de vegetales
frescos y semisecos.
II. OBJETIVOS

Cuantificar el contenido de cido ascrbico en frutas

Cintica de degradacin

III. FUNDAMENTO TERICO

1.1.

Estructura Qumica

El cido ascrbico o el cido L-ascrbico es la designacin de la Comisin

IUPAC-IUB para Vitamina C (2-oxo-L-teo-hexono-4-lactona-2,3-enodiol). Las
estructuras qumicas del cido ascrbico y algunos derivados se muestran en
la figura 1. El cido ascrbico tiene un anillo planar de cinco miembros; los dos
centros quirlicos que estn en las posiciones 4 y 5 determinan los cuatro
estereoismeros. El cido dehidroascrbico, la forma oxidada del cido
ascrbico, retiene alguna actividad de la vitamina C y puede existir como un
hemicetal hidratado, o como un dmero (Johnston et al., 2001). Tanto el cido
L-ascrbico como el cido dehidroascrbico poseen actividad biolgica o
vitamnica. Pero el cido D-isoascrbico no posee actividad biolgica, siendo
este el sustituto comercial del cido L-ascrbico (Wong, 1995; Gregory, 1996).
Gregory (1996) y Davey et al. (2000) afirman que debido a que el cido Lascrbico posee propiedades cidas y reductoras debidas al resto 2,3 enodiol,
es un compuesto muy polar. El carcter cido del cido L-ascrbico se debe a
la ionizacin del grupo hidroxilo en el carbono C-3, donde tiene un pKa1 = 4.04
a 25C. Una segunda ionizacin, la disociacin del hidroxilo en el carbono C-2,
con pKa2 = 11.4 a 25C, es mucho menos favorables.

Fig. 1. El cido ascrbico y varios productos de oxidacin. En solucin, el cido

ascrbico probablemente existe como hemicetal hidratado (Johnston et al., 2001).

1.2.

Estabilidad y Formas de Degradacin

Braverman (1980) sostiene que pequeas cantidades de oxgeno, que suelen

haber en los alimentos a consecuencia de las diferentes operaciones
realizadas, son suficientes para iniciar la cadena de reacciones autooxidativas

que degradan el cido ascrbico. Mientras que Tannenbaun (1976) citado por
Huapaya (1995) menciona que el cido ascrbico est sujeto a una variedad de
mecanismos de degradacin:
Degradacin aerobia catalizada, en presencia de oxgeno, metales y
enzimas
Degradacin aerobia no catalizada, slo oxgeno
Degradacin anaerobia, flavonoides
Lixiviacin
El cido ascrbico es fcilmente destruido por la oxidacin, especialmente a
temperaturas elevadas y/o cuando la reaccin es catalizada por iones
metlicos como el Fe+3 y Cu+2, convirtindose en la vitamina que se pierde
ms fcilmente durante el procesamiento, almacenamiento y coccin de los
alimentos. Su degradacin est relacionada con la temperatura, luz, pH,
disponibilidad de oxgeno, metales, actividad de agua, ciertas enzimas y hasta
la presencia de otras vitaminas como la riboflavina. Su estabilidad es mayor a
pH cidos y en ausencia de oxgeno puede resistir temperaturas de
esterilizacin (Badui, 1990).
Davey et al. (2000) afirman que las hortalizas de hoja verde y los granos verde
son particularmente vulnerables a los periodos inmediatos a la post-cosecha,
pudiendo perder un 20% de cido ascrbico. Un proceso de deshidratacin
como el que se les da a las papas, puede producir hasta un 75% de prdidas
de cido ascrbico. Mientras que para las hortalizas, se puede dar algo de 50%
de prdidas, en el enlatado. Estas prdidas son inevitables debido a la
movilizacin del agua. Tal como se aprecia en la figura 2, en los enlatados y
otros productos, una parte del cido ascrbico es lixiviado hacia el lquido de
procesado.

Regmenes de Coccin a diferentes

proporciones agua: muestra
1. Sancochado, 1:1. 10 min de coccin
2. Sancochado, 2:1. 10 min de coccin
3. Sancochado, 5:1. 10 min de coccin
4. Sancochado y Frito, 2:1. 12 minutos de
coccin
5. Frito en movimiento. 10 min de coccin
6. Cocido a Presin, 2:1. 6 min de coccin
7. Microondas, 30ml de agua. 6 min de
coccin

Fig. 2. Prdidas de cido L-Ascrbico durante el procesamiento y coccin en

casa (Davey et al., 2000)
Davey et al. (2000) concluyen que la oxidacin del cido ascrbico ocurre en
dos pasos. El primero es reversible, mientras que el segundo no lo es. En la
primera etapa, la oxidacin no es severa y slo se pierde dos hidrgenos hasta
llegar a la forma de cido L-Dehidroascrbico. En la segunda etapa, la vitamina
C generalmente se degrada hasta 2, 3 dicetoglucnico (figura 3). Adems
sostienen que esta reaccin ocurre a los 6 minutos a 37C. En este proceso
trmico, las enzimas catalizadoras, como la fenolasa, citocromos oxidasa,
cido ascrbico oxidasa y peroxidasas se desnaturalizan.
Fig. 3. Oxidacin del cido L-ascrbico (Davey et al., 2000)

1.3.

Cintica del Tratamiento Trmico del cido Ascrbico

1.3.1. Cintica de Degradacin del cido Ascrbico

La estabilidad del cido ascrbico ha sido descrita por varios modelos
cinticos. Laing et al. (1978) citado por Huapaya (1995) afirma que a
temperaturas y actividades de agua altas, la cintica de degradacin del cido
ascrbico es de orden cero. Lee y Labuza (1975) y Thompson (1982) citados
por Huapaya (1995) afirman que con variaciones de parmetros como
temperatura, metales, concentracin de oxgeno y actividad de agua, la cintica
es de primer orden.
Por si parte, Robertson y Samaniego (1986), Eison-Perchonok y Downes
(1982) y Singh et al. (1976) citados por Mikacatl (2003) concluyen que el
mecanismo de degradacin del cido ascrbico puede seguir cinticas de
primer o segundo orden. En condiciones abundantes de oxgeno o ambientes
anaerbicos, la degradacin del cido ascrbico sigue una cintica de primer
orden. Mientras que bajo condiciones limitantes de oxgeno, el mecanismo es
de segundo orden.
A condiciones isotrmicas, la ecuacin general de cintica de degradacin de
orden n que sigue la ley de la potencia, est dada por la ecuacin:
dC t
n
k (T )C t 1
dt

Donde:
C(t): Concentracin del nutriente, en este caso vitamina C, en el tiempo t.
k(T): Constante de velocidad de reaccin correspondiente a la temperatura T.
(s1)
n: Nmero de orden de reaccin
Para una reaccin de orden cero (n = 0), la ecuacin quedara de la forma:
C (t ) Co k (T ) t 2

Y si la reaccin fuera de primer orden (n = 1)

C t Co exp k (T )t
ln C t ln C t k T t 3

Pero si la reaccin fuera de segundo orden (n = 2)

1
1

k T t 4
C t Co

Donde C0 es la concentracin inicial del cido ascrbico.

Sin embargo, en la actualidad se estn aplicando modelos cinticos de
degradacin en procesos no isotrmicos (Corradini y Peleg, 2006).
1.3.2. Ecuacin de Arrhenius y Energa de Activacin
Cada una de las reacciones anteriormente mencionadas est dada para una
temperatura determinada. La ecuacin de Arrhenius nos ayuda a correlacionar
las constantes de velocidad de reaccin.
Ea * 1
k T K O exp

R *T
ln k T ln ko

Ea *1
5
RT

Donde:
k0 : Coeficiente cintico o factor de frecuencia (s1)
Ea : Energa de activacin (KJ/mol-K, Kcal/mol-K)
R : Constante Universal de los Gases Ideales (8.314 J/mol-K, 1.98 cal/mol-K)
1.3.3. Tiempo de Reduccin Decimal o Valor D
El tiempo de reduccin decimal se define como el tiempo necesario para
reducir la concentracin de nutriente hasta su dcima parte a una temperatura
T.
D T

1.3.4. Termorresistencia o Valor Z

2.303
7
K (T )

La sensibilidad de los nutrientes a la temperatura se mide por medio del valor

Z, que se define como el incremento de temperatura necesario para reducir el
valor D a su dcima parte.
log D T log Do

1.4.

1
T 8
Z

Mtodos de Determinacin

Existen varios mtodos de cuantificacin de cido ascrbico. Eitenmiller y

Landen Jr. (1999) mencionan que las principales son los mtodos de titulacin,
diclorofenolindofenol, fluorescencia automatizada a

de 365 y 440,

espectrofotometra a 500nm o HPLC.

La figura 4 nos ilustra acerca de las reacciones del cido ascrbico con algunos
tipos de anlisis.
Fig. 4. Reacciones importantes del cido L-ascrbico durante el anlisis de la Vitamina C
(Eitenmiller y Landen Jr., 1999).

1.4.1. Titulacin con 2, 6 diclorofenolindofenol

En

1930,

Tillmans

introdujo

el

mtodo

de

titulacin

con

2,

diclorofenolindofenol (DCPI). El DCPI, que tiene una coloracin azulina, es

reducido por el cido ascrbico hasta convertirse en una solucin incolora. El
cido L-ascrbico es oxidado a cido dehidroascrbico. En exceso de DPI
obtiene una coloracin ligeramente rosada. Este es el punto final de titulacin.
Una alternativa de la determinacin visual del punto final de titulacin es medir
la absorbancia a 518nm.
Este es un mtodo sencillo y prctico de realizar. Sin embargo, existen
deficiencias importantes. La titulacin es limitada a la cuantificacin de cido de
L-Ascrbico. El cido dehidroascrbico no ser medido a menos que sea
reducido a cido ascrbico. La titulacin no distingue entre cido L-Ascrbico
del cido isoascrbico. El mtodo no sirve para anlisis de vitamina C en
carnes procesadas y curadas que contienen cido isoascrbico. La titulacin
con DCIP puede ser usada para jugos frescos y multivitaminas que no
contienen cantidades excesivas de cobre o hierro. Para comidas procesadas o
cocinadas que contengan cobre, hierro, o estao, debera utilizarse otros
mtodos capaces de medir el cido dehidroascrbico, adems del cido de Lascrbico. Los extractos altamente coloreados de frutas y hortalizas pueden
enmascarar el cambio de color en el punto de final de la titulacin.
Adems, la reduccin de DCIP no se limitada al cido L-ascrbico. Cualquier
sustancia reductora presente en la muestra puede disminuir el color. Tales
interferencias pueden ocasionar mediciones altamente errneas, si no
reconocidas de cido L-ascrbico. Las sustancias que pueden interferir
incluyen iones cuprosos, ferrosos, y estaosos, sulfito, tiosulfato, taninos,
betanina, cistena, glutatin, y reductones generados por pardeamiento no
enzimtico. Distintas modificaciones de este mtodo han sido introducidas para
eliminar o minimizar los efectos de interferencias en la titulacin DCIP.
Recientemente, un mtodo de extraccin de fase (SPE) slida fue desarrollado
que expande la titulacin DCIP para multivitaminas altamente coloreadas,
bebidas no alcohlicas, y frutas y hortalizas. Por otro lado, el paso de limpieza
remueve cobre, hierro,
sulfito, y otras sustancias, como la cistena y glutatin, disminuyendo la
interferencia. La Slica C18 impregnada con 2,2 - bipiridil-2,9-dimetil-1,10-

fenatrolina (neocuprona) y N-etilmaleimida quitan compuestos de Fe (II) y Cu

(I) y sulfidril, respectivamente. El mtodo tiene prevista la determinacin de
cido

L-ascrbico

cido

dehidroascrbico

por

reduccin

de

cido

dehidroascrbico a cido L-ascrbico con cistena antes del paso SPE. Este
mtodo es simple y aumenta la sensibilidad del mtodo DCIP. La incorporacin
del paso SPE en los mtodos reguladores existentes podra disminuir los
problemas asociados con los mtodos existentes de titulacin (Eitenmiller y
Landen Jr., 1999).
IV. MATERIALES Y MTODOS
4.1.

Materia Prima
Naranja valencia

4.2.

Materiales

Cubetas de espectrofotmetro
Papel Tissue
Fiolas de 1000, 500, 100 y 50 ml
Tubos de ensayo
Pipetas volumtricas de 1, 2, 10 y 20 ml
Beakers de 100 y 50 ml
Embudo
Varilla de vidrio
Balanza analtica, electrnica de 0,1 mg de sensibilidad
Centrifuga
Tablas de picar
Cuchillo

4.3.

Reactivos

Acido oxalico al 0,4%: Pesar 4 g y llevar a 1000 ml con agua destilada.

Solucin madre de acido ascrbico 0.1% en solucin cido oxlico:

Pesar 100mg de acido ascrbico y llevar a volumen de 100 ml con una
solucin de acido oxalico al 0,4%
Solucin de 2,6 Dicloroindofenol: Pesar 12 mg de 2-6 DFIF, disolver y
llevar a 1000 ml de volumen con agua destilada. Emplear agua destilada
hirviente. Almacenar en botella de color oscuro y en refrigeracin
4.4.

Metodologa de desarrollo

4.4.1. Preparacin de soluciones estndares y curva de calibracin

Tomar 1, 2, 3, 4 y 5 ml de solucin madre de acido ascrbico, llevar a volumen
de 100 ml con la solucin de acido oxalico al 0,4%. Estas soluciones
enumeradas del 1 al 5 contendrn 1, 2, 3, 4 y 5 mg de acido ascrbico por 100
ml respectivamente
Tomar 4 tubos de prueba y enumerarlos del I al IV y agregar lo siguiente:
I

10ml de agua destilada

II 1 ml de acido oxalico al 0,4%

III 1 ml de solucin estndar + 9 ml de agua
IV 1 ml de solucin estndar
Ajustar a cero la absorbancia usando I y una longitud de onda de 515 nm
(Klinmezak, 2007)
Al tubo III aadir 9 ml del colorante y exactamente despus de 15 segundos,
leer la absorbancia (L1)
Ajustar a cero la absorbancia con la solucin del tubo III
Al tubo IV aadir 9 ml del colorante y exactamente despus de 15 segundos,
leer la absorbancia (L2)
Repetir desde 2. Para cada estandar de trabajo y registrar los correspondientes
valores de L1 y L2. Construir la curva estandar con las concentraciones de
acido ascrbico (mg/100ml) en la abcisa y en la ordenada la absorbancia (L1L2) para cada estandar de trabajo.

4.4.2. Preparacin y determinacin del contenido de Vitamina C de la

muestra problema
Extraer 200 ml de jugo de la muestra problema por el mtodo de exprimido y
llevarlo a clarificar con la centrifuga a 4000 rpm por 15 minutos, luego someter
a un filtrado al vaco con papel de filtro.
Tomar 3 ml del filtrado y llevarlo a 100 ml con solucin de acido oxlico al 0,4 %
en una fiola u otra dilucin que permita tener medidas dentro del rango de
medida de la curva estndar.
Proceder como se seal en el item anterior desde 2 hasta 6. En lugar del
estndar de trabajo trabajar con el jugo de la muestra problema.
Calcular L1-L2 y la concentracin de acido ascrbico mediante la curva
estndar.
4.4.3. Tratamiento trmico de la muestra problema
Se toma muestras del jugo filtrado de naranja de 10 ml y se coloca en tubos de
prueba cerrados , para minimizar la variacin de masa debido a la perdida de
agua de la muestra por efecto de la temperatura (Acebedo, 2005)
Las muestras sern sometidas a dos temperaturas: T1 = 80C y T2 = 90C.
Para cada temperatura se tomara tiempos de 15, 25, 45 y 60 minutos de
calentamiento en el bao termosttico.
Enfriar en bao con hielo
Realizar una dilucin adecuada con la muestra tratada (la lectura debe caer en
el rango de la curva de calibracin) en 100 ml de acido oxalico al 0,4%.
Medir la absorbancia en el espectrofotmetro a una = 515 nm. Realizar tres
repeticiones
4.4.4. Obtencin de la equivalencia gasto de 2,6 dicloroindofenol con
cantidad de cido ascrbico
Transferir 2 ml de la solucin estndar de cido ascrbico en un erlenmeyer de
50ml conteniendo 5 ml solucin de extraccin. Titular rpidamente con la
solucin estndar de 2,6 dicloroindofenol hasta la aparicin de un color rosado

persistente por un tiempo mayor de 5 segundos. Realizar una titulacin similar

de 3 blancos compuestos de 7 ml de la solucin de extraccin ms un volumen
de agua equivalente al volumen de la solucin estndar de dicloroindofenol
gastado en la titulacin directa. Despus de sustraer el blanco del gasto en la
solucin estndar de cido ascrbico, clcular y expresar la concentracin de la
solucin estndar de 2,6 dicloroindofenol

como mg de cido ascrbico

equivalente a 1 ml de gasto.
V. RESULTADO Y DISCUSIONES
Figura 1 - Curva estndar de Acido ascrbico a 515 nm (mg AA/100 ml solucin de
acido oxlico al 0.4%)

Tabla 1 Concentracin mg/100ml de acido ascrbico en naranja

Tiempo
(min)
0
15
30
45
60

L1
R1
R2
0.271 0.272
0.272 0.273
0.27 0.271
0.272 0.27
0.275 0.273

L2
R1
R2
0.093 0.092
0.107 0.112
0.102 0.155
0.157 0.165
0.195 0.203

L1 L2 Absorbancia Concentracin
R1
R2
mg/100ml
0.178 0.18
0.179
53.1272
0.165 0.161
0.163
48.2920
0.168 0.116
0.142
41.9457
0.115 0.105
0.11
32.2752
0.08 0.070
0.075
21.6981

Figura 2 - Degradacin de acido ascrbico en naranja a 90C a diferentes

tiempos

La concentracin inicial de cido ascrbico es de 53.1272 mg/100ml de jugo de

naranja. Collazos reporta entre 43 y 92 mg/100g de naranja. Mientras que
Braverman (1980) afirma que el contenido de cido ascrbico vara en funcin
a la parte de la naranja. La cscara amarilla tiene entre 175 y 292mg/100g. En
el albedo o cscara blanca, 86 - 194 mg/100g y en la pulpa, 44.9-73.2
mg/100g. La figura 2 muestra la disminucin del cido ascrbico al aplicarse
los tratamientos trmicos al jugo de naranja en diferentes tiempos.
Como se dijo anteriormente, a condiciones totalmente aerobias o anaerobias, la
cintica de reaccin es de orden cero (Robertson y Samaniego, 1986; EisonPerchonok y Downes, 1982 y Singh et al., 1976; citados por Mikacatl, 2003).
VI. CONCLUSIONES

El jugo de naranja de variedad valencia tiene 53.1272 mg/100ml de cido

ascrbico. Y es degradado elevadas temperaturas respecto al tiempo de
tratamiento.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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Alhambra.
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Braverman, J.B.S, 1980. Introduccin a la Bioqumica de los Alimentos. Mxico.
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