Introduccin a la Biologa Molecular y Celular 2015

Parcial de TP
Apellido y nombre:
L.U. N:

Turno de TP:
Total

1 (60p)

2 (40p)

100

12

12

12

10

14

Problema 1 (60 puntos)
Usted est en su laboratorio, intentando producir la enzima -amilasa en grandes cantidades
mediante tcnicas de ingeniera gentica, por lo que usar un sistema de expresin en bacterias
(que no tienen -amilasa). Su compaera, experta en biologa molecular, gener el plsmido de
expresin de -amilasa que se muestra en la figura 1 y es el que Ud. va a utilizar:

cap

cDNA de -amilasa

Figura 1. cap, p y o corresponden al opern lac. cap: regin reconocida por la protena
CAP. p: promotor. o: operador.
Recordando lo que hizo en el TP de Induccin enzimtica de IBMC:
a) Cul/es de la/s siguiente/s condiciones utilizara (y cul/es NO) para producir la mayor
cantidad de -amilasa? Justifique en todos los casos. (12p)
Tubo
1
2
3
4
5
6

Agregados al medio de cultivo

IPTG
glucosa
IPTG + glucosa
IPTG + glucosa + cAMP
IPTG + cloranfenicol
IPTG + glucosa + almidn

Nota: los agregados se hicieron al tubo conteniendo bacterias (transformadas con el

plsmido de la Figura 1) en medio mnimo. Luego se incubaron las bacterias en presencia de
estos agregados por 30 minutos a 37C.

Tubo 1: S, hay induccin de la alfa-amilasa que se encuentra ro abajo de la zona regulatoria

del operon lac por IPTG, anlogo de la lactosa, que vieron que funciona como inductor gratuito
del opern lac.
Tubo 2: No, no hay inductor y hay represin catablica.
Tubo 3: No, hay inductor pero hay represin catablica.
Tubo 4: Se aceptarn como correctas las siguientes opciones: S, hay inductor y el cAMP
revierte el efecto de la glucosa de inhibir la produccin de cAMP // No, hay produccin de alfa
amilasa pero es ms sencillo y/o barato utilizar solo IPTG // No, el cAMP revierte
parcialmente el efecto de la glucosa pero la condicin 1 garantiza mayor cantidad de alfaamilasa.
Tubo 5: No, hay inductor pero el cloranfenicol inhibe la traduccin y por ende no hay sntesis de
alfa-amilasa
Tubo 6: No, es como el tubo 3 y el almidn no aporta nada que tenga que ver con una mayor
produccin de alfa-amilasa.
b) Una vez que eligi la/s condiciones de partida, debe determinar cualitativamente la cantidad de
-amilasa producida por esos cultivos, luego de lisar las bacterias con SDS y cloroformo
(suponga que ni el SDS ni el cloroformo afectan a la -amilasa). Cmo hara? Explique en no
ms de 4 renglones. (8p)
Deben describir la medicin de la actividad de alfa amilasa por desaparicin de sustrato, en este
caso de almidn (o amilosa), a 37 grados y pH 7, revelando con reactivo de Lugol (o I2-IK)
hasta obtener el efecto acromtico como lo vieron en el TP 5.
c) Usted estaba por retirarse del laboratorio cuando un compaero preguntn le sugiere agregar
lactosa luego del SDS y el cloroformo para obtener la mxima actividad de -amilasa. Usted le
responde:
i.
ii.
iii.

No va a funcionar porque la lactosa es un inductor del opern lac y no un activador de la

-amilasa.
S, va a funcionar porque la lactosa es un inductor del opern lac, aunque no sea un
activador de la -amilasa.
Va a funcionar slo si adems se agrega almidn al momento de agregar lactosa.

Elija la respuesta correcta y justifique las falsas en no ms de 2 renglones. (12p)

i. Correcta
ii. La lactosa induce la zona regulatoria del opern lac in vivo: una vez agregado el SDS y el
cloroformo ya no puede regular el sistema dado que la lactosa no activa a la amilasa.
iii. Misma respuesta que en ii, agregando que el almidn es sustrato de la alfa-amilasa y por
ende no regula su actividad.
d) De las siguientes opciones, explique cules mejorarn y cules empeorarn la actividad de la
-amilasa respecto de medir su actividad a 37C. Explicite en cules casos se trata de un
tratamiento (o condicin de ensayo) y en cules de un pretratamiento de la enzima: (12p)
i.

Medicin de la actividad de -amilasa a pH 2 y a 37C luego de incubar el sustrato a 37C

por dos minutos.
2

ii.
iii.

Medicin de la actividad de -amilasa a 0C luego de incubar el sustrato a 0C por dos

minutos.
Medicin de la actividad de -amilasa a 37C luego de incubar la -amilasa con
proteinasa K a 50C.
i. Tratamiento (o condicin de ensayo): empeora la actividad, como se vio en TP, por
afectar la estructura de la amilasa
ii. Tratamiento (o condicin de ensayo): empeora la actividad, como se vio en TP, por
disminuir la energa cintica de las molculas (se puede justificar tambin en base a
la disminucin en la flexibilidad de los enlaces de la molcula, etc.)
iii. Pretratamiento de la enzima: empeora la actividad, la proteinasa K degrada a la alfaamilasa que es una protena

Para poder realizar una nueva preparacin del plsmido usted realiza un experimento de
transformacin bacteriana con el mismo y obtiene los siguientes resultados:
Placa 1 (control): sin colonias
Placa 2 (5 L del plsmido a una concentracin de 1 ng/L): 500 colonias
Placa 3 (control): csped
Considerando que en los 3 casos se sembraron 200 L de los 1000 L de bacterias con LB:
e) Calcule la eficiencia de transformacin. (8p)
ET= 500 UFC x 5/ 0.005g= 5x105 UFC/g ADN
f) A qu corresponden las placas 1 y 3 (controles) en cuanto al medio de cultivo y a la mezcla de
transformacin plaqueada? Qu controlan en cada caso? (8p)
Placa 1: Bacterias transformadas con agua y plaqueadas en medio con antibitico. Control
negativo o de seleccin. Se acepta que digan sin transformar con ADN en lugar de con agua.
Placa 3: Bacterias (da igual si ponen transformadas con agua o con plsmido) y plaqueadas
en medio sin antibitico. Control de viabilidad.

Problema 2 (40 puntos)

Un compaero le prest un plsmido para su proyecto de Tesis. Para caracterizar dicho plsmido
Ud. prepar un gel de agarosa que corri con muestras del plsmido sometidas a distintos
tratamientos.

+
a) Indique y complete en el esquema del gel: (10p)
i.

El tamao real aproximado en pares de bases (pb) de todas las bandas de la calle 1 y 4, y a
qu tratamiento corresponde cada calle, sabiendo que en una de ellas no se digiri el
plsmido ni se lo trat con RNasa y en la otra se lo trat con RNasa y con EcoRI, que
posee un nico sitio de corte en el plsmido.
Calle 1: Corresponde al plsmido sin digerir y sin RNasa, (de arriba para abajo):
plsmido circular, plsmido lineal (3000 pb), plsmido superenrrollado, RNA. Atencin:
si indican que el plsmido superenrollado y el circular tienen 3000 pb est bien tambin.
Lo que no pueden es decir que tienen 1650 pb o ms de 3000 de tamao real, o asignar
tamao real al RNA.
Calle 4: Corresponde al plsmido tratado con RNasa y con EcoRI, se ve solo el plsmido
linealizado de 3000 pb

ii.

El tamao real aproximado en pares de bases (pb) de todas las bandas de la calle 2 y 3, a
cuntos fragmentos del plsmido original corresponde cada banda y a qu tratamiento
corresponde cada calle, sabiendo que en una de ellas se trat al plsmido con RNasa y con
PvuII, que posee dos sitios de corte en el plsmido, y en la otra se trat al plsmido con
RNasa y con BamHI, que posee tres sitios de corte en el plsmido.
4

Calle 2: Corresponde al plsmido tratado con RNasa y con BamHI. Se observa una sola
banda que corresponde a 3 fragmentos del mismo o similar tamao real, 1000pb.
Calle 3: Corresponde al plsmido tratado con RNasa y con PvuII, observan 2 bandas
correspondienes a un fragmento cada una de 1000 y 2000 pb.

b) Responda: (8p)
i.
ii.
iii.
iv.

Para qu se utiliza el glicerol en el buffer de siembra?

Para qu se utiliza el azul de bromofenol en el buffer de siembra?
Cmo se visualizan las bandas de ADN?
Cules son las funciones del buffer de corrida Tris Acetato EDTA (TAE)?

i.

Para dar mayor densidad a las muestras a sembrar, que caigan en el pocillo y que
presenten menor difusin.
ii. Para colorear las muestras a sembrar, los pocillos sembrados y principalmente para
marcar el frente de corrida sin necesidad de detener la corrida para iluminar el DNA con
luz UV.
iii. Con Bromuro de Etidio, de carga positiva, que se intercala entre las bases del DNA y
fluoresce (se excita con luz UV y emite luz naranja) con mucha mayor intensidad una vez
que se intercala.
iv. Mantiene fijo el pH durante la electroforesis y aporta iones a la solucin para mantener
la corriente elctrica . Respecto del EDTA pueden o no incluir un comentario.
c) Para analizar las digestiones arriba mencionadas, Ud. necesit preparar un gel conteniendo 120
ml de 1% m/v de agarosa en buffer TAE 1X con 0,5 g/ml de bromuro de etidio. Adems,
necesit preparar 2L de TAE 1X para utilizar como buffer de corrida durante la electroforesis. En
el laboratorio contaba con:
i.

TAE 50X
Bromuro de etidio 10 g/l
Agarosa slida
Cmo prepar el TAE 1X? Cunta masa de agarosa necesit para el gel? (6 p)

Se considerar como correcto que preparen tanto 2000 mL, 2120 mL o volmenes mayores de
buffer para obtener nmeros redondos (2.5 o 3 L). Si hacen las cuentas para 2L por un lado y
para 120 mL por el otro es ms trabajo pero igual est bien.
Para 2L son 40mL de TAE 50X y 1960 mL de H20 (o H20 hasta completar 2L). Para 2120 mL
son 42.4 mL de TAE 50X y 2077.6 mL de H20 (o H20 hasta completar 2120 mL).
Para 120 mL de gel 1% m/V se necesitan 1.2 g de agarosa

ii.

Cunto volumen de bromuro de etidio debi agregar? Exprese la concentracin de la

solucin stock de bromuro de etidio en molaridad sabiendo que la masa molar de ese
compuesto es de 394 g/mol. (8 p)

Deben agregar 6L de bromuro de etidio. La molaridad de la solucin stock es 0.026M

d) En relacin a la preparacin de DNA plasmdico, decida si las siguientes afirmaciones son
verdaderas o falsas y justifique slo las falsas en no ms de 4 renglones: (8 p)
i.

Al ser hipertnica la solucin 1 el agua tiende a ingresar a la bacteria y la presin

resultante genera inestabilidad en la pared celular.
El SDS de la solucin 2 es un detergente inico fuerte que solubiliza las membranas y
desnaturaliza las protenas y luego en el paso 3 forma una malla insoluble junto al K+ que
precipita con el ADN cromosmico y gran parte de las protenas mal renaturalizadas.
La solucin 3 de renaturalizacin neutraliza el pH cido de la solucin de lisis.
El fenmeno de desnaturalizacin y renaturalizacin lenta es la base del enriquecimiento y
extraccin plasmdica.

ii.
iii.
iv.
i.
ii.
iii.
iv.

La solucin 1 es hipotnica, no hipertnica.

V
La solucin 3 neutraliza el pH bsico de la solucin de lisis
La desnaturalizacin y renaturalizacin son abruptas o rpidas.