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LABORATORIO 1: CRECIMIENTO CELULAR

Cdigo:
Vigencia:
Rev.:

BIOPINGALL01
30.04.2010
01

Ramo: Laboratorio de Ingeniera de Bioprocesos


Facultad Tecnolgica
Carrera: Ingeniera de Alimentos
Departamento de Ciencia y Tecnologa de los
Universidad de Santiago de Chile
Alimentos
Editado por los profesores: ngela Contreras, Sergio Aguilera

1. INTRODUCCIN
1.1 Curva de crecimiento

Conocer las caractersticas de crecimiento de un microorganismo es esencial para


desarrollar procesos industriales de manera ptima. Una poblacin de microorganismos,
incluso bajo condiciones ptimas, experimenta variaciones en el tiempo segn un perfil
definido llamado curva de crecimiento. Esta curva de crecimiento es caracterstica para
cada microorganismo y depende de manera importante de las condiciones del en el medio
en el cul este se desarrolle. El crecimiento se define como el aumento ordenado de
todos los componentes de un organismo. En organismos unicelulares conduce a un
aumento en el nmero de clulas ms que un aumento en el tamao celular, lo que deriva
en un crecimiento exponencial del nmero de clulas. Los microorganismos en general no
pueden crecer sin lmite, ya que durante su crecimiento van agotando los nutrientes
disponibles y generando productos txicos nocivos para su desarrollo.

Un cultivo microbiano simple y homogneo tiene un ciclo de crecimiento que se divide en


cuatro fases. En primer lugar, una fase de latencia (o fase lag), una fase de crecimiento
exponencial, una fase de crecimiento estacionario y una fase de muerte.

Tomando como ejemplo un cultivo que est creciendo en un matraz agitado (cultivo
batch), normalmente se observarn estas cuatro fases de crecimiento. En primera
instancia las clulas en fase de latencia (procedentes de un cultivo anterior o pre-inculo)
no crecen enseguida, ya que deben adaptarse al nuevo medio antes de comenzar a
crecer a un ritmo exponencial. Durante esta fase, aunque no ocurra divisin celular, las
clulas pueden estar creciendo en tamao y volumen, sintetizando protenas, enzimas,
ARN, entre otras molculas. En sntesis, aumentando su actividad metablica. La
duracin de esta fase de latencia depende de numerosos factores, como por ejemplo la
edad del inculo, la cantidad de pre-inculo agregado, de la temperatura del medio, de la

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concentracin de nutrientes tanto del cultivo antiguo como del nuevo, de la aireacin del
cultivo y de la concentracin de toxinas que pueden haberse formado en el cultivo
antiguo. Es as como, si los medios de cultivo antiguo y nuevo presentan grandes
diferencias en su composicin, la fase de latencia se har ms extensa.

Una vez que las clulas se encuentran adaptadas, estas comienzan a dividirse
rpidamente, lo que da inicio a la fase de crecimiento exponencial. En esta fase, las
clulas se dividen a una tasa constante y caracterstica de su especie. Es as como se
pueden utilizar algunos parmetros para caracterizar el crecimiento del microorganismo
durante esta fase. Uno de ellos es la velocidad especfica de crecimiento ( con unidades
t-1) y el otro es el tiempo de duplicacin (tD con unidades t). Estos parmetros se puede
relacionar por medio de la expresin =ln2/tD. Como se mencion anteriormente, estos
parmetros son propios de cada especie microbiana, adems dependen del medio en el
cual se est desarrollando el microorganismo.

Conforme se consumen los nutrientes en un biorreactor batch se van acumulando


productos inhibitorios y la velocidad de crecimiento va disminuyendo, hasta llegar a
detenerse (fase estacionaria). En la fase estacionaria las clulas no estn todas en el
mismo estado fisiolgico, algunas todava se estn dividiendo mientras que otras ya han
comenzado a morir, por lo que la poblacin total se mantiene constante. Es importante
destacar que es en esta fase donde se producen los llamados metabolitos secundarios,
como por ejemplo los antibiticos.

A medida que se agota la mayor parte de los nutrientes y la acumulacin de metabolitos


txicos aumenta de forma considerable, el nmero de clulas que mueren sobrepasa al
nmero de clulas que se producen y el cultivo entra en la fase de muerte.

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1.2 Mtodos para el monitoreo del crecimiento de un cultivo

Dada la diversidad de caractersticas que presentan los distintos cultivos de


microorganismos, se han desarrollado una variedad de mtodos fsicos y qumicos para
cuantificar las variaciones en el tiempo que experimenta una poblacin dada de
microorganismos. Algunos de estos mtodos se describen a continuacin.

1.2.1 Mtodos directos

Recuento Celular

El recuento de clulas se efecta en el microscopio, utilizando un portaobjeto graduado


llamado cmara de Neubauer. De esta manera se puede determinar la densidad celular
de una muestra expresndola como el nmero de clulas por volumen del cultivo. La
principal desventaja de este mtodo radica en que no se puede discriminar entre clulas
vivas y muertas (viabilidad celular), siendo necesario utilizar mtodos complementarios
para obtener dicho parmetro. El clculo de la viabilidad celular se basa principalmente en
la capacidad fisiolgica de las clulas para excluir algunos colorantes, impidiendo la
tincin de sus componentes celulares. Uno de los mtodos ms utilizados para el clculo
de viabilidad en levaduras es la tincin con Azul de Metileno.
Cuantificacin de la biomasa microbiana

La biomasa se puede determinar filtrando o centrifugando una muestra de volumen


conocido (peso freso) o desecando esta filtracin a 105 C (peso seco). Otra forma de
cuantificar el desarrollo de una poblacin microbiana, es medir el volumen del pellet o
sedimentos de una centrifugacin. Para ello existen tubos de centrifuga graduados, que
permiten una lectura directa de este valor.

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Turbidimetra

Generalmente los medios de cultivo son lquidos transparentes que dejan atravesar la luz.
Sin embargo, al aumentar el nmero de clulas o biomasa, estos lquidos comienzan a
adquirir

turbidez

la

cual

puede

cuantificarse

por

turbidimetra,

colorimetra

espectrofotometra en el rango visible. Se considera que la biomasa sigue el


comportamiento de la Ley de Lambert-Beer, es decir, al graficar la absorbancia v/s la
biomasa sta sigue un patrn lineal dado por Abs = e * l * c, donde A es la absorbancia, e
es la absortividad, l es el espesor y c la concentracin. Por lo general la linealidad se
mantiene hasta un rango de 1 gramo de biomasa seca por litro y se mide
aproximadamente a una longitud de onda de 600nm. Las restricciones para usar este
mtodo son: presencia de slidos en el medio de cultivo, medio de cultivo que absorbe a
la misma longitud de onda que los microorganismos, crecimiento de microorganismos en
biofilms, entre otros.

1.2.2 Mtodos indirectos

Se basan en la capacidad de establecer correlaciones con componentes celulares,


metabolitos producidos por las clulas o reacciones catalizadas por estas. Por ejemplo,
puede estimarse el crecimiento celular determinando cantidad de protenas, cantidad de
DNA, consumo de oxgeno, consumo de nutrientes como glucosa, produccin de cidos u
otros productos.
Mtodo GOD-PAP para monitorear el consumo de glucosa

El mtodo GOD-PAP se basa en determinar la cantidad de glucosa despus de su


oxidacin enzimtica en presencia de glucosa oxidasa. El perxido de hidrgeno formado
reacciona bajo la catlisis de la peroxidasa con fenol y 4-amino-fenazona produciendo un

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complejo rojo-violeta usando la quinoneimina como indicador que absorbe a 500nm. La


reaccin se muestra a continuacin:
Glucosa + O2 + H2O Acido glucnico + H2O2 (Catalizado por glucosa oxidasa)
2H2O2 + 4-aminofenazona + fenol quinoneimina + 4H2O2 (Catalizado por peroxidasa)
Es as como la concentracin de glucosa es proporcional a la produccin de quinoneimina
presente en la reaccin. Para realizar la cuantificacin se debe construir una curva de
calibracin de Abs500nm v/s concentraciones de glucosa conocidas. Un parmetro para
poder caracterizar el consumo de un sustrato es el rendimiento del sustrato, valor que
hace referencia a la cantidad de biomasa producida en relacin a la cantidad de sustrato
consumida (

).

2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo general

Monitorear el crecimiento de un cultivo de levaduras (Saccharomyces cerevisiae) en un


medio de laboratorio por medio del uso de mtodos directos e indirectos.
2.1 Objetivos especficos

Caracterizar la curva de crecimiento de la levadura S. cerevisiae.


Determinar la viabilidad del cultivo durante su crecimiento.
Relacionar el consumo de sustrato con el crecimiento del microorganismo.

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3. ACTIVIDADES
3.1 Construir la curva de crecimiento de la levadura S. cerevisiae en un medio YPD
utilizando espectrofotometra.
3.2 Caracterizar la fase de crecimiento exponencial por medio de los parmetros y t D.
3.3 Utilizar la cmara de Neubauer para realizar el conteo de levaduras y posteriormente
calcular la viabilidad celular.
3.4 Medir el consumo de glucosa por medio del uso del kit GOD-PAP. Determinar el
rendimiento de glucosa.

4. MATERIALES
Cultivo de levadura Saccharomyces cerevisiae, medio de cultivo (YPD), cmara de
Neubauer, solucin de azul de metileno (0,02%), cubetas de espectrofotmetro, tubos
eppendorf, micropipetas, vasos prcipitados, pizetas con agua destilada, alcohol 70%,
papel absorbente, kit GOD-PAP para medicin de glucosa.

5. PROCEDIMIENTOS
Se tendrn dos puntos de la curva de crecimiento por cada grupo de trabajo. Estas
muestras correspondern a medio de cultivo con levaduras en suspensin obtenidas a
diferentes tiempos de cultivo.
5.1 Construccin de la curva de crecimiento por medio de espectrofotometra

1. Homogeneizar la suspensin celular y tomar 1mL en cubetas de espectrofotometra.

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2. Tomar 1mL de medio de cultivo YPD sin levaduras y depositarlo en una cubeta de
espectrofotometra. Esta cubeta se utilizar como blanco.

3. Depositar la cubeta blanco dentro del espectrofotmetro regulado a 600nm. Cuidar


limpiar la cubeta con papel tissue (no utilizar papel absorbente ya que puede rayar la
cubeta, inutilizndola).

4. Medir la absorbancia de las muestras problema. Si el valor de absorbancia sobrepasa


el valor crtico (0,9 - 1,0) deber diluir la muestra. Para ello, siga los pasos desde el punto
1, diluyendo la muestra con medio YPD sin levaduras antes de depositar la muestra en la
cubeta. No olvide corregir el valor de absorbancia obtenido con el factor de dilucin
utilizado.

5. Utilizando los valores de absorbancia de sus compaeros construya la curva de


crecimiento Abs600nm v/s t.
5.2 Recuento celular en cmara de Neubauer y clculo de viabilidad

1. Tomar una muestra de 50L de muestra del cultivo y mezclarlo con 50L de azul de
metileno. Para tiempos avanzados de incubacin, realizar diluciones con medio YPD
antes de mezclar con el colorante. No olvide corregir por el factor de dilucin cuando
realice los clculos.

2. Tomar 10L de esta suspensin y depositarlo en la cmara de Neubauer.

3. Contar en el microscopio, segn las instrucciones entregadas por el profesor, las


clulas azules (muertas) y blancas (viables).

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4. Calcular la concentracin celular por medio de la siguiente frmula

Donde:
C: Concentracin celular [cl/mL]
x: Promedio clulas contadas en la cmara
FD: Factor de dilucin utilizado.
5. Calcular la viabilidad celular por medio de la frmula

6. Confeccionar la curva de crecimiento en C v/s t. Calcule los valores de y tD utilizando


la pendiente de la curva confeccionada en la fase exponencial y por medio del modelo
biolgico

5.3 Determinar glucosa residual por el mtodo GOD-PAP

1. Tomar 50L de muestra y mezclarlo en un tubo eppendorf con 1mL de reactivo GODPAP. Se debe tener en consideracin que la linealidad del kit es hasta
concentraciones de glucosa de 700mg/dL. Si considera que su muestra superar este
valor, diluya las veces que considere pertinente. No olvide corregir su valor de
absorbancia por el factor de dilucin utilizado.

2. Tomar 50 mL de agua destilada y mezclarla en un tubo eppendorf con 1mL de reactivo


GOD-PAP. Este tubo se utilizar como blanco de la reaccin.

3. Incubar la muestra y el blanco por 5 min. a 37C.

4. Medir los valores de absorbancia a 500nm de la muestra.

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5. Con los valores de sus compaeros construir la grfica Cglucosa v/s t.


6. Calcular el rendimiento de la glucosa por medio de
Donde:
Yx/s: Rendimiento de glucosa
X: Diferencia de la concentracion celular en un tiempo determinado (Xf - X0).
S: Consumo de glucosa (S0 Sf).

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