CROMATOGRAFIA

UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL DE LA AMAZONA
FACULTAD DE INGENIERA Y CIENCIAS AMBIENTALES

CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
CROMATOGRAFIA, APLICACIONES
CUALITATIVAS Y CUANTITATIVAS- HPLC
TRABAJO EXPERIMENTAL
CURSO
QUMICA ANALTICA.
PRESENTADO POR
ABRAHAM BUSTAMANTE VALLEJOS
DOCENTE
Dr.QCO.FCO. NERY GRIMALDO CRDOVA.
PUCALLPA
2015
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos, a nuestro Dios, que nos da la
sabidura
para
profundizar
nuestros
conocimientos en la ciencia de investigacin, y
todos los que nos apoyaron para la realizacin de
este trabajo.
TRABAJO DE INVESTIGACION/CROMATOGRAFIA, APLICACIONES CUALITATIVAS Y CUANTITATIVAS,

HPLC/QUIMICA ANALITICA/UNIA
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DEDICATORIA
El trabajo de investigacin, lo dedicamos a las personas
que confiaron en nuestra capacidad de anlisis e
investigacin; a nuestros profesores quienes son
nuestros guas en el aprendizaje, que nos brindan
grandes conocimientos que nos servirn en el futuro.
INDICE GENERAL:
1. INTRODUCCION
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVOS GENERALES
2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
3. MARCO TEORICO
3.1 ANTECEDENTES
3.2 BASE CIENTIFICA
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3.3 TERMINOLOGIA
4. CLASIFICACION
4.1 CROMATOGRAFIA PLANA Y CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
4.1.1 CROMATOGRAFIA EN PAPEL
4.1.2 CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA (TLC)
4.1.3 CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
4.1.4 CROMATOGRAFIA DE GASES
5. CROMATOGRAFA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA O RENDIMIENTO (HPLC):
5.1 CLASIFICACION
5.1.1 CROMATOGRAFA DE ADSORCIN (LQUIDO-SLIDO).
5.1.2 CROMATOGRAFA DE REPARTO/ADSORCIN
5.1.3 CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO.
5.1.4 CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR.
5.1.5 CROMATOGRAFA DE FASE NORMAL
5.1.6 CROMATOGRAFA DE FASE REVERSA (INVERSA)
5.2 INSTRUMENTACIN
5.2.1 SISTEMA DE SUMINISTRO DE FASE MVIL
5.2.1.1 LA BOMBA
5.2.1.2 TIPOS DE BOMBAS
5.2.1.3 SISTEMAS DE MEZCLA DE FASE MVIL
5.2.1.4 MEZCLADO A ALTA PRESIN
5.2.1.5 MEZCLADO A BAJA PRESIN
5.2.1.6 SISTEMAS DE INYECCIN
5.2.1.7 LA COLUMNA
5.2.1.8 ELECCIN DE LA COLUMNA Y DE LA FASE MVIL
5.3 ECUACIONES FUNDAMENTALES
5.4 PROCEDIMIENTO PARA UN ANALISIS CROMATOGRAFICO HPLC
5.5 CARACTERISTICAS QUE DEBE TENER UNA FASE MOVIL (SOLVENTE)
6. APLICACIONES EN CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE ALTA RESOLUCIN
(HPLC
6.1 APLICACIONES CUANTITATIVAS Y CUALITATIVAS
7. CONCLUSIONES
8. BIBLIOGRAFIA
1.
INTRODUCCION
La cromatografa es una tcnica que se

emplea para separar entre
si
los
componentes de una sustancia.
Esta tcnica fue creada por el botnico ruso
Michael Tswett en 1906, el cual llam a su
mtodo cromatografa, palabra griega que
significa escritura a color, porque lo utilizo
para separar compuestos coloreados. Tswett
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llev a cabo una extraccin de una mezcla de pigmentos de hojas verdes

utilizando ter de petrleo, un disolvente no polar, y descubri que era capaz de
separar los pigmentos al hacer pasar el extracto atravs de una columna, un tubo
de vidrio rellenado con carbonato de calcio (tiza). Tswett utiliz como detector del
experimento la simple observacin, ya que los compuestos que separ tenan
color y era posible detectar bandas o zonas de distintas materias por su color en la
columna, demostrando que la clorofila es solo uno de los muchos pigmentos que
se encuentran en las hojas de las plantas.
A pesar de que el mtodo cromatogrfico prometa simplificar la separacin de
sustancias de mezclas complejas, no fue sino hasta finales de la dcada de los 30
y principio de los 40 cuando se empez a desarrollar la tcnica teniendo este
mtodo diversas aplicaciones. En la actualidad la cromatografa se emplea
principalmente para separar compuestos incoloros pero el nombre permanece
para describir cualquier tcnica que se base en los mismos principios.
La columna sencilla de Tswett, un tubo vertical de cristal, abierto por su parte
superior, rellena de un slido comn donde el eluyente se mueve conducido por su
propio peso, ha evolucionado hasta los modernos equipos que hoy conocemos
(fig1).
Fig. 1. Cromatgrafo de gases con espectrmetro de masas
Fig. 2. Equipos para HPLC (C. de alta resolucin para lquidos)

2.
OBJETIVOS
2.1.
OBJETIVOS GENERALES:
Conocer la definicin de Cromatografa y los Tipos de Tcnicas de

Separacin cromatografas en diferentes sustancias.
Determinar las aplicaciones cualitativa y cuantitativamente en el

proceso de Cromatografia Liquida de Alta Resolucin-HPLC.
2.2.
OBJETIVOS ESPECFICOS:

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3.
Aportar informacin para futuros trabajos de investigacin sobre

las diferentes tcnicas de separacin de la cromatografa.
Conocer las tcnicas de separacin de las molculas orgnicas a
travs de diferentes tipos de la cromatografa.
Conocer los Instrumentos usados en el Proceso de Separacin
Cromatografico.
Conocer las fases para la Separacion Cromatografica Tipo HPLC.
Reconocer cualitativa y cuantitativamente la diferencia de una
muestra analizada en el proceso cromatografico-HPLC.
MARCO TEORICO
3.1 ANTECEDENTES
La Cromatografa gaseosa fue descubierta por un botnico ruso

llamado Mikhail Tswett quien separ los pigmentos de las plantas sobre
una columna de tiza en 19033.
Qumicos Britnicos Martin y Synge desarrollaron la cromatografa de
particin en 1942; Martin y James desarrollaron la (GC) in 1952.
Desde 1940, qumicos utilizaron columnas de silica para purificar
materiales orgnicos.
En los ltimos aos de la dcada 60, LC cambi debido a que

se
empacaron columnas con pequeas partculas que necesitaron
bombas de presin.
en 1906, martin tswett public un artculo sobre la cromatografa. tswett separo
los componentes de la clorofila utilizando carbonato de calcio como absorbente
y ter de petrleo como eluyente.
En 1931, Kuhn y sus colaboradores aislaron y carotenos de la zanahoria,
empleando el mismo mtodo de Tswett.
Por los aos de 1940, Martin y Synge trabajaron en las bases Tericas de la
cromatografa, lo cual hizo posible el definir Mtodos que habilitan la eficiencia
de la separacin cromatografica. Ello hizo posible que la Cromatografa tuviera
una amplia aceptacin.
En la dcada de 1950, el mtodo cromatografico fue aplicado a la
cromatografa de Gases.
En 1957, Golay propuso el uso de Columnas Capilares para la Cromatografa
de Gases.
En la dcada de 1960, naci la Cromatografa Liquida de alta performance
(HPLC).

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En 1975, Small y sus colaboradores propusieron la Cromatografa de

Intercambio Inico de Alta Performance.
1979, Gierde y sus colaboradores desarrollaron el sistema de Cromatografa
de iones supresores.
Anteriormente a los aos 60, pocos mtodos cromatografico confiables estaban
disponibles comercialmente para el cientfico del laboratorio. Durante los aos 70,
la mayora delas separaciones qumicas eran realizadas usando una variedad de
tcnicas incluyendo la cromatografa columna abierta, la cromatografa de papel,
y la cromatografa de capa delgada. Sin embargo estas tcnicas cromatograficas
eran inadecuadas para la cuantificacin de compuestos similares.
Durante este tiempo, la cromatografa de presin liquida comenz a ser utilizada
para disminuir el tiempo del flujo, reduciendo as tiempo de purificacin de los
compuestos que son aislados por la columna cromatografica.
A fines de los 700s, los nuevos mtodos incluyendo la cromatografa liquida de la
fase reserva permitieron una mejor separacin entre los compuestos similares.
3.2 BASE CIENTIFICA

En la cromatografa se separan los componentes de las mezclas a medida
que son transportadas por un fase fluida mvil a travs de una fase
estacionaria slida o lquida, la separacin de las molculas se logra porque
la movilidad de cada soluto depende de un equilibrio en la distribucin entre
la fase mvil y la estacionaria, y esta separacin se puede realizar en
funcin de sus cargas, masas, tamaos moleculares, la polaridad de sus
enlaces, sus potenciales redox.
Como resultado hay una gran variedad de tcnicas para llevar a cabo la
separacin de una sustancia, que se clasifican en cuatro grandes grupos
segn el mecanismo de separacin:
C. de reparto: separa los solutos basndose en la solubilidad.
C. de adsorcin: se basa en la afinidad de adsorcin.
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C. de exclusin: separa solutos segn el peso molecular.

C. de intercambio inico: separa solutos segn la carga inica.
Tambin se pueden clasificar segn el estado de la fase mvil en :
C. de gases: la fase mvil es un gas y pueden ser dos sistemas:
C. gas-liquido
C. gas-slido
C. lquida: la fase mvil es un liquido y puede ser:
C. liquido-liquido
C. liquido-slido
C. de exclusin
C. de intercambio ionico
Las nicas sustancias que no pueden ser examinadas por cromatografa
son las insolubles y aquellas que se descomponen con el solvente o con la
fase estacionaria. Dentro de las tcnicas cromatogrficas no se incluyen los
mtodos que utilizan campos elctricos para separar molculas cargadas,
mtodos que se denominan electro separaciones, electromigraciones o
electroforesis.
El proceso cromatogrfico, aparentemente simple, es en realidad una
compleja unin de fenmenos tales como hidrodinmica, cintica,
termodinmica, qumica de superficie y difusin. Hasta la fecha se han
propuesto muchas teoras, que incluyen complejos matemticos para poder
explicar el comportamiento de los solutos en las columnas cromatogrficas,
por citar alguna de estas teorias las ms estudiadas son:
Teora de los Platos Tericos (Martin & Synge).
Teora Cintica (Van Deemter, Zuiderweg, Klinkenberg & Sjenitzer).
Teora Desarrollada para Columnas Capilares (Golay).
3.3 TERMINOLOGA
" Absorcin: es la retencin de una especie qumica por parte de una masa y
depende de la tendencia que tiene sta a formar mezcla o a reaccionar
qumicamente con la misma.
" Adsorbente: fase estacionaria en la C. de adsorcin y de reparto.
" Adsorcin: Es la retencin de una especie qumica en los sitios activos de la
superficie de un slido, quedando limitado el fenmeno a la superficie que separar
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las fases o superficie interfacial, esta retencin superficial puede ser fsica o
qumica.
" C. en fase inversa: C. con una fase estacionaria no polar y una fase mvil polar.
" C. en fase normal: C. con una fase estacionaria polar y una fase mvil no polar.
" Disolvente o revelador: Cualquier fase mvil.
" Elucin: Proceso de extraer un soluto de la fase estacionaria.
" Eluyente: La fase mvil una vez que se extrae de la columna.
"
Fase
estacionaria:
Material
que
permanece
dentro
de
la
columna
cromatogrfica durante la cromatografa y que retiene algn componente de la

muestra, posee una gran rea superficial y puede ser un slido o un lquido
dispuesto sobre un slido que acta como soporte.
" Fase mvil: Es un fluido que puede ser lquido, gas o fluido supercrtico que se
usa como portador de la mezcla y que se hace pasar a travs de la columna
cromatogrfica y la fase estacionaria.
" Origen: Lugar fsico donde se coloca la muestra al principio.
" Revelado: Proceso de separar un soluto de la muestra por medio de
cromatografa.
" Soporte: El material slido inerte que en la C. de reparto sirve para sostener la
fase estacionaria lquida en su sitio.
" Sorbente: Cualquier fase estacionaria
4.
CLASIFICACIN
4.1 CROMATOGRAFIA PLANA Y CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
La cromatografa puede llevarse a cabo por cinco tcnicas analticas:
C. En papel
C. En capa fina
C. en columna
C. de Gases
C. Lquida de alta resolucin HPLC

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4.1.1 CROMATOGRAFIA EN PAPEL

Es una forma combinada de cromatografas de
particin y adsorcin en la que la fase
estacionaria es el agua absorbida presente en el
papel, y el soporte es el papel mismo. La fase
mvil es una solucin que consiste de un solvente
o de una mezcla de varios lquidos, incluyendo el
agua. Se deja secar sobre el papel unas gotas del
extracto de la muestra y se forma una mancha.
Para impedir la evaporacin, el papel se cuelga dentro de una cmara de tal forma
que la mancha pueda ser irrigada con la fase mvil ya sea hacia abajo por efecto
de la gravedad, hacia arriba u horizontalmente por efecto de la capilaridad.
Cuando la fase mvil ha saturado el papel hasta una distancia predeterminada en
la que se logre la separacin cromatogrfica, se saca el papel de la cmara y
se desarrolla el cromatograma rociando agente reveladores.
En el caso de sustancias coloreadas tales como los colorantes de alimentos, la
separacin resulta evidente aun sin la ayuda de tales agentes. Las sustancias no
polares tambin pueden separarse recubriendo el papel con un compuesto no
polar y usando solventes polares como fase mvil. Es una tcnica barata pero
relativamente lenta, con limitaciones en el uso de agentes reveladores, algunos de
los cuales pueden atacar y destruir el papel. Las manchas tienden a ser difusas.

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4.1.2 CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA (TLC)

Es un procedimiento rpido y sencillo para separar mezclas de sustancias y para
identificar/caracterizar o para determinar semicuantitativamente componentes
individuales.
La separacin se basa en
que
las
sustancias
investigadas se reparten de
modo diferencial entre una
fase estacionaria y otra mvil:
en la TLC el eluyente (fase
mvil) se desplaza por una
fina capa del sorbente (fase
estacionaria), transportando
as
los
componentes
individuales de la mezcla de
sustancias ms o menos lejos
dependiendo de su solubilidad y/o de su comportamiento frente a la adsorcin. Al
contrario, que en la cromatografa en columna, el proceso separativo transcurre en
un sistema abierto, la placa separativa plana. El recorrido particular de cada
sustancia se emplea as para su identificacin.
Las separaciones se realizan generalmente por el procedimiento ascendiente,
introduciendo el borde inferior de la placa cromatografa en el solvente, que ser
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succionado por accin de las fuerzas capilares del recubrimiento de la superficie

de la placa.
APARATOS Y MATERIALES. GENERALIDADES
- Cubeta cromatogrfica (con tapa hermtica); la mayora de las veces se trata de

la cubeta Normal (profundidad del espacio para el gas: 3mm)
- Placas de cromatografa: preparadas por uno mismo o ya fabricadas.
- Pipetas de microlitro
- Recipiente de vidrio con pulverizador
- Probeta o matraz Erlenmeyer con tapn (para preparar y mezclar la fase
mvil)
- Secador
- Plantilla para TLC o regla
- En caso necesario: lmpara UV para comprobar la fluorescencia o la
disminucin de la misma.
DESARROLLO
El eluyente, cuya composicin depende de cada problema concreto, se pone en la

cubeta cromatogrfica por lo menos 30 minutos antes del principio de la
separacin hasta una altura de 0.5 cm. La cubeta se cerrar con su tapa para que
se sature con los vapores del disolvente y se coloca en un lugar adecuado. Para
que la saturacin sea mejor, se recubre la cubeta con papel secante (se indicar
en el protocolo en el caso que sea necesario).
Para desarrollar la placa, su extremo inferior se introduce en el diluyente y se
vuelve a cerrar la cubeta inmediatamente. Para evitar eluciones, las manchas
cargadas debern estar completamente por encima del nivel de eluyente.
El eluyente se ve impelido hacia arriba por capilaridad a travs del
recubrimiento. El recorrido ser, dependiendo de la separacin, de 5 a 15 cm
mximo, y el tiempo necesario depender del sorbente, del espesor del mismo y
de la composicin del eluyente. El recorrido ptimo es por lo general de 10 cm.

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CLCULOS
Tras el desarrollo del cromatograma, se saca la placa de la cubeta y (despus de
marcar el frente) se seca cuidadosamente al aire o con un secador. La posicin de
las manchas se determina:
-por su color propio
-por su fluorescencia
-por la disminucin o amortiguacin de la fluorescencia
-por reaccin qumica: la placa una vez seca se roca parcial o totalmente con un
determinado reactivo, de manera que aparecern coloraciones caractersticas o
una fluorescencia particular.
La identificacin de cada una de las manchas se realiza de acuerdo con su color y
del denominado valor rf (factor de retencin , llamado tambin factor Rf o hRf (=Rf
x 100), es decir, el cociente entre el recorrido de la sustancia (ls) y el del eluyente
(lL).
rf = ls [cm] / lL[cm]
Para conseguir la identificacin, los colores propios o consecuencia del revelado y

los rf se comparan con los de sustancias de referencia, obtenidos en las mismas
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condiciones de desarrollo y tincin (si es posible en el mismo cromatograma).

Como control se realizan adicionalmente los denominados cromatrogramas mixtos
(la disolucin problema y la de la sustancia de referencia se cargan en una misma
mancha).
4.1.3 CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
Fue la forma original de cromatografa lquida realizada

por primera vez en 1906 por Tswett. La fase
estacionaria normalmente se encuentra dentro de una
columna de vidrio de 5 a 30 mm de dimetro. Se
utilizan muchas clases de materiales de empaque que
van desde la almina, gel de slice, tierra de diatomeas,
hasta resinas sintticas y derivados polisacridos.
Se usan todos los tipos de cromatografa lquida. Lo
habitual es que la fase mvil se deje percolar a travs
de la columna por gravedad. No se usa mucho en el
anlisis de alimentos ya que es una tcnica para la
separacin cromatogrfica de mezclas de sustancias.
Sin embargo, hoy en da existe un sistema
cromatogrfico completo y automtico diseado para el
anlisis bioqumico que se conoce como cromatografa
lquida rpida para protenas. Estos instrumentos emplean un rango de fases en
columnas de plstico de 5 o 10 cm que operan bajo presin moderada.
Se revolucion el uso de la cromatografa en columna para la purificacin de
soluciones de prueba o para extraer las sustancias deseadas de las soluciones,
debido a la introduccin de cartuchos cortos de plstico y desechables de
minicolumnas, preempacados con una variedad de fases de separacin con
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partculas de tamao relativamente grandes, por ejemplo, cartuchos de Bond-Elut

y Sep-Pak. Las soluciones de prueba, de lavado o extraccin pasan rpidamente a
travs de los cartuchos con un poco de vaco generado a travs de una bomba
de agua. La mayora de los mtodos de purificacin tales como la extraccin
lquido-lquido, la TLC y la cromatografa en columna de vidrio que se usan antes
de la espectofotometra, la GLC, la HPLC etc, pueden ahora realizarse en forma
ms eficiente usando estos cartuchos.
4.1.4 CROMATOGRAFA DE GASES:

Se utiliza para la separacin de sustancias gaseosas. La Fase Mvil es un Gas
(llamado Gas Portador) y la Fase Estacionaria puede ser un slido (Cromatografa
Gas-Slido) o una Pelcula de lquido de alto punto de ebullicin (Generalmente
Polietiln-Glicol o Silicn) recubriendo un slido inerte (Cromatografa GasLquido).

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El cromatgrafo de gases est constituido

normalmente por un suministro y una entrada del gas
portador, un puerto de inyeccin, una columna
normalmente localizada en el interior de una cmara
termostatizada (horno), un detector y un sistema
computarizado para analizar, registrar e imprimir el
cromatgrama.
La muestra se introduce a travs del sistema de
inyeccin dentro de la columna que es el sitio donde
ocurre la separacin.
La columna de aluminio, acero inoxidable, vidrio o
tefln contiene la fase estacionaria slida o lquida y
est sujeta a la superficie por un soporte que es
generalmente de slice. La fase mvil o gas portador
transporta los componentes de la muestra a travs de
la columna, por esta razn debe ser inerte para evitar interacciones con la muestra
o la fase estacionaria, y ser capaz de minimizar la difusin gaseosa.
Al final de la columna existe el detector que permite la deteccin y cuantificacin
de las sustancias, midiendo conductividad trmica y electronegatividad de las
sustancias eludas. Se produce una seal tipo elctrico, que posteriormente se
amplifica por un registrador grafico o un integrador permitiendo indicar el momento
en que salen de la columna los componentes. La salida de la sustancia se
registra en un cromatgrama en forma de picos y se determinan medidas como la
altura y el rea del pico.

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5. CROMATOGRAFA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA O RENDIMIENTO (HPLC):

La cromatografa lquida de alta eficacia se encuadra dentro de la cromatografa
de elucin. En sta, un lquido (fase mvil) circula en ntimo contacto con un slido
u otro lquido inmiscible (fase estacionaria); al introducir una mezcla de
substancias (analitos) en la corriente de fase mvil, cada analito avanzar a lo
largo del sistema con una velocidad diferente que depender de su afinidad por
cada una de las fases. Esto supone que despus de terminado el recorrido de la
muestra por la columna, cada una de las substancias introducidas en el sistema
eluir con un tiempo diferente, es decir, estarn separadas.
5.1 CLASIFICACIN DE LA CROMATOGRAFA LIQUIDA
Los diferentes tipos de cromatografa lquida se pueden clasificar de diferentes
maneras, pero la forma ms habitual de clasificacin es la realizada en base a la
naturaleza de la fase estacionaria, ya que es sta la que impone
fundamentalmente el mecanismo de separacin; de este modo, se pueden
enumerar cuatro tipos de tcnicas:
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5.1.1 CROMATOGRAFA DE ADSORCIN (LQUIDO-SLIDO).

La fase estacionaria es un adsorbente y la separacin se basa en repetidas etapas
de adsorcin-desorcin.
5.1.2 CROMATOGRAFA DE REPARTO/ADSORCIN (FASES LIGADAS

QUMICAMENTE).
La separacin en este caso, se basa en un reparto del soluto entre la fase mvil y
la fase estacionaria.
5.1.3 CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO.
Este tipo de cromatografa se da cuando la fase estacionaria presenta en su
superficie grupos ionizados capaces de retener selectivamente a iones de signo
contrario que circulan en la fase mvil.
5.1.4 CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR.
La fase estacionaria, en este caso, es un material poroso de tamao de poro
controlado, que permite la entrada de ciertas molculas de manera selectiva,
dejando fuera otras de mayor tamao.
El mecanismo de retencin en los dos primeros casos es similar, variando
nicamente el tipo de interacciones que se producen y cul de ellas es la
predominante; por esta razn, en la prctica se realiza otra divisin de los dos
primeros tipos de cromatografa atendiendo a polaridad de la fase estacionaria:
5.1.5 CROMATOGRAFA DE FASE NORMAL:
La fase estacionaria presenta puntos activos de alta polaridad y las interacciones
que se producen con el soluto son especficas del grupo activo. La fase
estacionaria puede ser un slido adsorbente (slice o almina), o bien, un soporte
al que se unen qumicamente molculas orgnicas que presentan grupos
funcionales de alta polaridad (ciano, amino, etc).
5.1.6 CROMATOGRAFA DE FASE REVERSA (INVERSA):
La fase estacionaria tiene una naturaleza apolar (cadenas hidrocarbonadas,
grupos fenilo) y las interacciones que se producen son inespecficas (efecto
solvfobo).
5.2 INSTRUMENTACIN

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Si bien es cierto que para realizar una cromatografa lquida tan solo es necesario
disponer de las dos fases implicadas en el proceso y de la columna, la moderna
cromatografa de lquidos de alta eficacia, debido al pequeo dimetro de las
partculas de fase estacionaria que se utilizan, requiere de la utilizacin de unos
dispositivos que constituyen el cromatgrafo.
Los componentes bsicos de un cromatgrafo de lquidos son:
Dispositivo de suministro de eluyentes (bomba y dispositivo de mezclado de

eluyentes).
Dispositivo de inyeccin.
Conducciones y conexiones.
Detector y registrador.
Columna.
Los componentes bsicos de un cromatgrafo se muestran en la figura 1.
Figura 1.- Esquema de un cromatgrafo de lquidos

Adems de los dispositivos anteriormente mencionados se pueden incorporar en
el sistema otros que pueden simplificar el trabajo o bien mejorar algn aspecto
concreto de la tcnica cromatogrfica, como pueden ser:
Inyectores automticos.
Colectores de fracciones.
Hornos termostatizados para las columnas
Sistemas de tratamiento de datos.

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5.2.1 SISTEMA DE SUMINISTRO DE FASE MVIL

5.2.1.1 LA BOMBA
La misin de la bomba es la de suministrar un caudal constante y libre de pulsos
de la fase mvil a travs de la columna, sin que el flujo sea influido por la presin
en cabeza de columna,y ya que sta puede variar por obstruccin de las lneas de
conduccin, del filtro de la cabeza de la columna, etc.
Un sistema de bombeo ideal debe cumplir las siguientes caractersticas:
- Estar construido con materiales qumicamente inertes frente a la fase mvil.
- Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.
- Proporcionar un flujo libre de pulsaciones o llevar asociado un amortiguador de
stas, ya que las pulsaciones, aunque no afectan a la separacin en s, pueden
contribuir al ruido de fondo del detector y por lo tanto disminuir la sensibilidad.
- Suministrar flujos adecuados para los diferentes tipos de columnas. El rango de
caudales para las columnas que se utilizan habitualmente vara desde los 10 :l/min
hasta los ml/min (columnas microbore, analticas y semipreparativas).
- El caudal que suministran debe ser constante a lo largo del tiempo, ya que de l
depende la reproducibilidad de los tiempos de retencin.
5.2.1.2 TIPOS DE BOMBAS
Una primera clasificacin de las bombas utilizadas en CLAE, se puede realizar
atendiendo a la fuerza motriz, as se tendrn:
Bombas neumticas.
Bombas de desplazamiento directo.
Bombas amplificadoras de aire.
Bombas de motor elctrico.

Bombas de jeringa.
Bombas alternantes (pistn o membrana).

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Bombas neumticas: (A) Bomba amplificadoras de aire. (B) Bomba de desplazamiento directo.

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Bombas de motor elctrico. (A) Bomba de jeringa. (B) Bomba alternante (membrana)
5.2.1.3 SISTEMAS DE MEZCLA DE FASE MVIL

En cromatografa de lquidos, es posible trabajar en dos modalidades; isocrtico, cuando
la fase mvil mantiene la misma composicin durante la elucin, y en gradiente, cuando la
composicin de la fase mvil cambia segn una funcin dependiente del tiempo.
Para trabajar en la modalidad de gradiente, es necesario que el equipo cromatogrfico
tenga un dispositivo capaz de realizar mezclas de disolventes con un control preciso y
reproducible.
Los dos principales mtodos de mezclado de los componentes de la fase mvil se
conocen como mezclado a alta presin y mezclado a baja presin.
5.2.1.4 MEZCLADO A ALTA PRESIN

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Este sistema de mezclado utiliza una bomba para cada uno de los disolventes que se van
a mezclar, estando la salida de cada bomba conectada a una conexin en "T" o a una
pequea cmara de mezcla. La denominacin de mezcla en alta presin es debida a que
la mezcla se realiza una vez que los disolventes han pasado la bomba y, por lo tanto, han
adquirido la presin de trabajo.
5.2.1.5 MEZCLADO A BAJA PRESIN

En los equipos de mezcla en baja presin, el mezclado de los diferentes
componentes se lleva a cabo antes de stos entren en la bomba (en la zona de
baja presin del sistema), controlndose el caudal del sistema cromatogrfico por
medio de una sola bomba. El mezclado de los componentes se realiza por medio
de vlvulas porcentuales controladas por rels, que estn calibradas para dar la
mezcla adecuada. El dispositivo de control simplemente abre cada vlvula durante
un perodo de tiempo adecuado, que ser funcin del porcentaje de cada
componente que se precise en la mezcla (figura 6).

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Figura 6.- Sistema de mezcla en baja presin
5.2.1.6 SISTEMAS DE INYECCIN

El mtodo de introduccin de la muestra en CLAE, es de importancia capital, pues
un mal sistema de inyeccin puede dar lugar a ensanchamientos de la banda
cromatogrfica que deterioren la eficacia del sistema cromatogrfico.
Un inyector ideal debe tener las siguientes caractersticas:
- Introducir la muestra en la columna como una banda lo ms estrecha posible.
- Ser de fcil manejo.
- Dar lugar a resultados reproducibles, tanto en la cantidad de muestra inyectada
como en el ensanchamiento que origina en la banda cromatogrfica.
- Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.
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Fundamentalmente existen dos tipos de inyectores manuales: los de jeringa y los

de vlvula.
5.2.1.7 LA COLUMNA
La columna es el elemento fundamental de un
cromatgrafo de lquidos, puesto que es en ella donde
tiene lugar la separacin; por lo tanto, resulta
fundamental una correcta eleccin nde la columna
adecuada para cada separacin, ya que con una
columna inadecuada o de mala calidad se nunca se
obtendrn buenos resultados aunque se disponga del
mejor instrumental.
Las partes de que se compone una columna de
cromatografa lquida se muestran en la figura 21.
Las columnas ms utilizadas en cromatografa de
lquidos son las de relleno; estas columnas consisten
en un tubo, generalmente de acero, relleno de una
fase estacionaria adecuada al tipo separacin que se
pretende llevar a cabo. El dimetro interno vara entre
2 y 60 mm dependiendo su utilizacin, a escala
analtica o semipreparativa, y su longitud vara entre 5
y 30 cm.
Tambin se encuentran hoy en da en el mercado
columnas de pequeo dimetro (microbore), con
dimetros comprendidos entre 2 y 0,5 mm y longitudes entre 25 y 100 cm. Este
tipo de columnas permite reducir el consumo de disolventes y, por lo tanto,
facilitan la posibilidad de acoplar la cromatografa lquida a otras tcnicas
analticas (fundamentalmente espectrometra de masas). Por otro lado, se
empieza a introducir la denominada cromatografa de lquidos capilar, en la que se
utilizan como columnas tubos (de slice fundida generalmente) de un dimetro
interno muy pequeo (entre 200 y 500 :m) y de gran longitud (varios metros); en
este tipo de columnas, la caracterstica ms importante es que la fase estacionaria
se encuentra ligada qumicamente a las paredes del tubo, por lo que se hace
innecesaria la utilizacin de partculas de fase estacionaria como en los dos casos
anteriores.
Pgina 25
Las caractersticas de la columna que influyen sobre su capacidad de separacin

son:
- Dimetro interno
- Longitud
- Conexiones (reducciones)
- Relleno
- Tamao de partcula del relleno.
5.2.1.8 ELECCIN DE LA COLUMNA Y DE LA FASE MVIL
La eleccin del sistema cromatogrfico debe realizarse en funcin de la naturaleza
de las substancias a separar.
El conocimiento de la naturaleza de la substancia va a permitir, a priori, orientar al
cromatografista sobre qu mecanismo de separacin puede ser el mas apropiado
o, dicho de otro modo, cul es la propiedad para la que existen diferencias ms
notables entre las substancias a separar (tamao, carga, polaridad, etc.), lo que
dar una idea de la fase estacionaria que puede ser apropiada (Figura 24).
Es necesario, por lo tanto, conocer los mecanismos de separacin ms generales
utilizados en cromatografa de lquidos. Bsicamente stos se pueden dividir en:
- Adsorcin. Cromatografa lquido-slido (CLS).
- Adsorcin/reparto. Cromatografa con fases ligadas (CFL).
Cromatografa de fase normal (CFL).
Cromatografa de fase reversa (CFR).
- Intercambio inico. Cromatografa de intercambio inico (CII).
Cromatografa de cambio catinico.
Cromatografa de cambio aninico.
- Tamao molecular. Cromatografa de exclusin molecular (CEM).
Cromatografa de filtracin en gel (CFG).
5.3 ECUACIONES FUNDAMENTALES

Constante de distribucin:
En general, los equilibrios de distribucin implicados en cromatografa se
describen por ecuaciones sencillas que suponen la transferencia de una analito
entre las fases estacionaria y la mvil.
As, para el soluto A, se puede escribir:
Pgina 26
A mvil
A estacionario
La constante de equilibrio K para este proceso se denomina constante de

distribucin y mide la distribucin del analito entre la fase mvil y la estacionaria.
Entonces tenemos:
K = CS/CM
Donde:
CS : Es la concentracin molar del soluto en la fase estacionaria
CM : Es la concentracin molar del soluto en la fase mvil.
La resolucin cromatogrfica de una columna es una medida cuantitativa de su
capacidad para separar sus analitos.
Se la define como:
Rs = 2 [(TRb- TRa)/(WA +WB)]
Donde:
WA y WB son la anchura de los picos A y B en el cromatgrafo
TR: Es el tiempo que tarda en aparecer el mximo de un pico.
A partir de esto se deduce que si R> 1,5 la separacin de los componentes es
completa, no ser as si R<1,5.
5.4 PROCEDIMIENTO PARA UN ANALISIS CROMATOGRAFICO HPLC
Parmetros a seguir:
1.- El compuesto pasa por la columna cromatogrfica a travs de la fase

estacionaria mediante el bombeo de lquido (fase mvil) a alta presin a travs de
la columna.

Pgina 27
2.- La muestra a analizar es introducida en pequeas cantidades y sus

componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones
qumicas o fsicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la
columna.(El grado de retencin de los componentes de la muestra depende de la
naturaleza del compuesto, de la composicin de la fase estacionaria y de la fase
mvil.)
3.- Despus los componentes pasan por un detector que genera una seal
(dependiendo de la concentracin y del tipo de compuesto)
4.- Se utilizar una bomba para impulsar a la fase mvil con velocidad y presin
constante.
5.- Luego llegan a las columnas en donde hay unos detectores que no hacen mas
que indicar el momento de aparicin de los distintos componentes que constituyen
la muestra.
5.5
CARACTERISTICAS QUE DEBE TENER UNA FASE MOVIL (SOLVENTE)

Pgina 28
6. APLICACIONES EN CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE ALTA RESOLUCIN

(HPLC)
6.1 APLICACIONES CUALITATIVAS Y CUANTITATIVAS
La HPLC permite muy buenas separaciones e identificaciones de sustancias o
grupos
de sustancias en un tiempo corto, tanto cualitativa como
cuantitativamente. Como condicin, es imprescindible que la muestra sea soluble
en un disolvente al ser la fase mvil un lquido.
Es la tcnica analtica de separacin ms ampliamente utilizada debido a sus
cualidades de sensibilidad, su fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas
exactas, su idoneidad para la separacin de especies no voltiles o termolbiles y
su gran adaptabilidad a sustancias que son de gran inters para la industria, la
ciencia y la sociedad.

Pgina 29
El empleo de HPLC en sus muchas variantes se ha especializado mucho.

Algunas aplicaciones incluyen sustancias tan diversas como aminocidos,
protenas, cidos nuclicos, hidrocarburos, carbohidratos, frmacos, terpenos,
plagucidas, antibiticos, esteroides, especies organometlicas y una gran variedad
de sustancias inorgnicas.
EJEMPLOS DE UTILIZACIN DE HPLC:
Deteccin y cuantificacin de sacarina, benzoatos, cafena y aspartame en

refrescos.
Deteccin de ciclomato en jugos de fruta.
Separacin de steres de cidos grasos por fase inversa y con
argentizacin de columnas (Silicato de Al con Ag).
Separacin de Triglicridos por la longitud de la cadena y el grado de
insaturacin por fase inversa y detector de dispersin luminosa, para el
estudio de aceites y grasas adulteradas.
Determinacin del contenido de Vit A y sus precursores ( y caroteno)
en margarina y aceites de hgado por fase inversa.
Determinacin del contenido en Vit D en leche en polvo y cereales por
fase normal.
Como aplicaciones de la cromatografa de reparto en productos de alimentacin :

edulcorantes artificiales, antioxidadntes, aflatoxinas, aditivos, colorantes,
aminocidos, proteinas, carbohidratos, lpidos.
Las aplicaciones de la cromatografa inica est el anlisis de drogas y sus
metabolitos, sueros, conservantes
de alimentos, mezclas para vitaminas, azcares, y preparaciones farmacuticas.
Respecto a las aplicaciones referidas a productos alimenticios en cromatografa
por exclusin de tamaos:
separacin de cidos grasos, determinacin de glucosa fructosa y sacarosa en
zumos enlatados.
La cromatografa lquida de alta presin a pesar de ser una tcnica relativamente

nueva, tiene numerosas aplicaciones en la qumica. En la mayora de los casos,
stas consisten en determinaciones de sustancias cuyo anlisis por otra tcnica
cromatografa resulta muy difcil.

Pgina 30
Compuestos inicos: como aminocidos,

inorgnicas, cidos orgnicos, etc.
sales
Compuestos de alto peso molecular: como polmeros,

hidrocarburos polinucleares, productos naturales, etc.
Compuestos no voltiles: como vitaminas, pesticidas,

esteroides, plastificantes, drogas y una parte muy grande de
otros productos farmacuticos.
Tiene grandes aplicaciones en lo que se refiere a la contaminacin ambiental la

HPLC se utiliza para analizar la capacidadque tienen algunos pesticidas
(insecticidas, larvicidas, herbicidas, etc.).
El anlisis de medicamentos constituye la Aplicacin ms grande de la

Cromatografa HPLC que nos sirve para determinar los componentes activos de
diferentes productos usados en la Industria Farmaceutica como por ejemplo en
tabletas analgsicas.

Pgina 31
7.
CONCLUSIONES
La cromatografa lquida de alta eficacia se encuadra dentro de la

cromatografa de elucin. En sta, un lquido (fase mvil) circula en ntimo
contacto con un slido u otro lquido inmiscible (fase estacionaria); al
introducir una mezcla de substancias (analitos) en la corriente de fase

Pgina 32
mvil, cada analito avanzar a lo largo del sistema con una velocidad
diferente que depender de su afinidad por cada una de las fases.
El proceso cromatogrfico, aparentemente simple, es en realidad una

compleja unin de fenmenos tales como hidrodinmica, cintica,
termodinmica, qumica de superficie y difusin. Hasta la fecha se han
propuesto muchas teoras, que incluyen complejos matemticos para poder
explicar el comportamiento de los solutos en las columnas cromatogrficas,
por citar alguna de estas teorias las ms estudiadas son:
Teora de los Platos Tericos (Martin & Synge).
Teora Cintica (Van Deemter, Zuiderweg, Klinkenberg & Sjenitzer).
Teora Desarrollada para Columnas Capilares (Golay).
8.
La HPLC
permite muy buenas separaciones e identificaciones de
sustancias o grupos de sustancias en un tiempo corto, tanto cualitativa
como cuantitativamente. Como condicin, es imprescindible que la muestra
sea soluble en un disolvente al ser la fase mvil un lquido.
Es la tcnica analtica de separacin ms ampliamente utilizada debido a

sus cualidades de sensibilidad, su fcil adaptacin a las determinaciones
cuantitativas exactas, su idoneidad para la separacin de especies no
voltiles o termolbiles y su gran adaptabilidad a sustancias que son de
gran inters para la industria, la ciencia y la sociedad.
BIBLIOGRAFIAS
1. Libro de Quimica analtica moderna DAVID HARVEY cdigo: 543/H22-2/2
2. http://es.slideshare.net/jmramos1978/cromatografa-lquida-de-alta-presin
3. http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/cromatografia
/cromatografia_liquida_de_alta_eficacia.pdf
4. MILLER, JC; MILLER JN. Estadstica para qumica analtica. Segunda
edicin. Estados Unidos: Addison-Wesley Iberoamericana. 1993.
5. CROMLAB. Procedimiento extraccin en fase solida. Estndares
certificados y materiales de referencia. Barcelona, Espaa. 2009.
Pgina 33
6. http://rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/8248/4/T4cromatliquid.pdf

Pgina 34

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UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL DE LA AMAZONA

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partculas de tamao relativamente grandes, por ejemplo, cartuchos de Bond-Elut

4.1.4 CROMATOGRAFA DE GASES:

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5.2.1 SISTEMA DE SUMINISTRO DE FASE MVIL

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5.2.1.3 SISTEMAS DE MEZCLA DE FASE MVIL

5.2.1.4 MEZCLADO A ALTA PRESIN

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5.2.1.5 MEZCLADO A BAJA PRESIN

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5.2.1.6 SISTEMAS DE INYECCIN

Fundamentalmente existen dos tipos de inyectores manuales: los de jeringa y los

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