Extrao, Purificao e Caracterizao da Leucina Aminopeptidase de

Spinacia oleracea
Gonalo Figueir1
1

Departamento Cincias da Vida, Faculdade de Cincias e Tecnologia, Universidade de Coimbra.

Abstract
A leucina Aminopeptidase (LAP) uma protease sernica que pode ser encontrada em diferentes organismos, tais
como o Spinacia oleracea (espinafre) e o Solanum tuberosum (batata). Utilizando folhas de espinafre e com o objetivo
de purificar esta protena, procedeu-se precipitao das protenas presentes no extrato inicial com sulfato de
amnia a 75% e dilise. Aps isto, de forma a obter a protena purificada realizou-se uma cromatografia de troca
aninica em QAE-Sephadex. Caraterizou-se esta protena procedendo a uma eletroforese em gel de
poliacrialamida 12.5% (SDS-PAGE), na qual obteve-se uma banda com massa molecular aparente de 60kDa, que
permitiu confirmar que a protena em estudo homohexamrica; e a uma zimografia, em que no obteve-se
qualquer degradao da gelatina, j que a protena era muito pesada (360 kDa) e possua uma reduzida densidade
de carga. A utilizao da L-leucina p-nitroanilina (Leu-pNa) como substrato da leucina Aminopeptidase,
possibilitou a realizao do estudo da atividade cataltica da enzima, do qual no se conseguiu obter o Km e Vmx.
Por ltimo, a purificao desta enzima teve um rendimento de 1,5 e um grau de pureza mximo de 0,98.

Palavras-chave: Leucina Aminopeptidase, Spinacia oleracea, espinafre, extrao, purificao, caracterizao,

cromatografia de troca aninica

Introduo
As aminopeptidases (EC 3.4.11.1-15) pertencem
ao grupo das exopeptidases, e, portanto, catalisam a
hidrlise da ligao peptdica no terminal amnico (Nterminal) de protenas ou peptdeos. Estas enzimas
encontram-se amplamente distribudas pelo reino das
plantas e animal, sendo importantes em diversas
funes ao nvel celular, como por exemplo a
maturao de protenas e degradao hormonal e nohormonal de peptdeos. A classificao das diferentes
aminopeptidases feita de acordo com o nmero de
aminocidos clivados a partir do N-terminal do
substrato; a sua especificidade pelo substrato; a
localizao da enzima; a suscetibilidade a certos
inibidores (por exemplo a bestatina); a necessidade de
ies metlicos como cofatores; e, por fim, com o pH a
que a enzima possui maior atividade cataltica, isto , o
seu pH timo [1, 3, 5 e 16].
Das vrias aminopeptidases, a leucina
aminopeptidase (LAP; 3.4.11.1) catalisa a hidrlise de
resduos de leucina no N-terminal das protenas e
peptdeos. No entanto, a esta enzima no especfica
para o aminocido de leucina, j que tambm catalisa a
hidrlise de outros aminocidos hidrofbicos, como
por exemplo a arginina e a metionina. Esta enzima
considerada, estruturalmente, um homohexmero
(Figura 1) com uma massa molecular de 360 kDa, pelo
que cada subunidade possui um peso molecular de 60
kDa [3 e 7]. Em diferentes organismos, a estrutura

primria das subunidades muito semelhante,

nomeadamente no terminal carboxlico (C-terminal),
onde o zinco se encontra ligado, desta forma esta
enzima apresenta uma elevada conservao quer ao
nvel estrutural (especificidade do substrato) quer ao
nvel cataltico (mecanismo de reao catalisada).

Figura 1 Estrutura tridimensional da LAP e representao a

cores das 6 subunidades que a constituem.

Nas plantas a caracterizao da LAP, ao nvel

estrutural e funcional, tem sido realizada durante anos,
assim sendo que ela encontra-se melhor caraterizada
no tomate [7]. Esta enzima, na maioria das plantas,
participa em diversas funes fisiolgicas tais como na
defesa, no transporte de recetores de auxina e na
meiose. No entanto a sua principal funo sintetizar
novas protenas, organizando de forma diferente os
aminocidos de uma dada protena, e degradar
protenas no-funcionais (processo conhecido como
turnover). Devido a esta funo estas enzimas so,
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Extrao, Purificao e Caraterizao da Leucina Aminopeptidase

muitas vezes, designadas como enzimas de
manuteno celular [7 e 11].
Neste trabalho efetuado, utilizou-se folhas de
espinafre da espcie Spinacia oleracea de forma a extrair
a enzima LAP, que encontra-se localizada no citosol,
mais precisamente no estroma dos cloroplastos desta
planta. Neste organismo, a atividade cataltica da LAP
mximo a pH 8,5 possuindo tambm um ponto
isoeltrico de 6,2. Ao possuir uma temperatura tima
no intervalo 4 60C, esta enzima pode ser
considerada termoestvel. A ativao desta enzima
pode ser feita na presena de caties metlicos como o
Mn2+ e Zn2+. Sendo, portanto, uma metaloenzima, esta
pode ser inibida por agentes quelantes como o EDTA,
a amastatina e a betastina [14]. Utilizando compostos
sintticos, principalmente amino acil-p-nitroanilina,
como por exemplo a Alanina p-nitroanilina, a Leucina
p-nitroanilina e a Lisina p-nitroanilina possvel
estudar cineticamente esta enzima [14]. Durante o
processo de extrao e purificao desta enzima a
partir da Spinacia oleracea, pensa-se que os pigmentos
podero ser os principais contaminantes.

Materiais e Mtodos
Material. As folhas de espinafres frescos (Spinacia
oleracea) foram fornecidas pela docente responsvel
pela cadeira de Laboratrios de Enzimologia e
Qumica de Protenas, a Professora Paula Verssimo.
As solues tampo utilizadas no decorrer deste
projeto, nomeadamente, tampes 50 mM e 100 mM
Tris-HCl pH 8, foram preparadas pelo grupo de
trabalho, enquanto que as restantes solues, reagentes
e materiais de laboratrio foram disponibilizados pelo
Departamento de Cincias da Vida da Universidade de
Coimbra.
Preparao do extrato inicial. Fez-se a lavagem
das folhas escolhidas, e a tiragem das nervuras. No
final deste procedimento a massa total obtida foi de
221.5 g. Aps isto, procedeu-se triturao das folhas
em 170 mL de tampo 100mM Tris-HCl pH 8, de
forma obter uma soluo homognea, que foi filtrada
atravs de 8 camadas de gaze. Posteriormente
realizao de uma centrifugao a 8000 x g durante 10
minutos a 4C, desprezou-se o pellet, j que nele se
encontravam clulas intactas e organelos densos. Desta
mesma centrifugao obteve-se um sobrenadante com,
aproximadamente, 248 mL, dos quais 50 mL foram
armazenados para ensaios enzimticos e, cerca, de 198
mL utilizados para os restantes passos de purificao
da enzima.

Purificao
da
enzima
Leucina
aminopeptidase. Com o objetivo de purificar a
enzima em estudo iniciou-se por precipitar as protenas
existentes no extrato inicial, de volume 198 mL, e por
realizar uma dilise, de acordo com Noriyuki Ogiwara
et al [12]. Nesta referncia a precipitao foi feita a uma
saturao 70%, no entanto adicionou-se 102.2 g de
(NH4)2SO2 ao extrato inicial, sob agitao constante,
obtendo, assim, uma saturao de 75%. Seguidamente
efetuou-se uma centrifugao a 10000 x g durante 12
minutos, na qual o pellet obtido foi recolhido e
guardado a 4C, para posterior utilizao.
Em seguida, o precipitado foi ressuspenso em 15
mL de tampo 100 mM Tris-HCl pH 8 e dialisado
overnight. Para a execuo da dilise foi usado uma
membrana de celofane semi-permevel, na qual
continha a nossa ressuspenso, num gobel com, cerca
de, 1 L de tampo 100 mM Tris-HCl pH 8, para que a
nossa protena no sofresse um choque osmtico. A
suspenso dialisada foi centrifugada a 7000 x g durante
10 minutos, com finalidade de remover o material
insolvel na mesma. O sobrenadante resultante desta
centrifugao foi recolhido e apresentava um volume
de 25 mL. Deste volume, 10 mL foram guardados para
ensaios enzimticos e os restantes 15 mL foram
aplicados na cromatografia de troca aninica, que
representa o passo seguinte do processo de
purificao.
A cromatografia de troca aninica foi efetuada
utilizando uma coluna de 50 x 10 mm de QAESephadex, que um trocador forte, e o seu equilbrio
foi realizado com tampo 50 mM Tris-HCl pH 8. Aps
este equilbrio foram aplicados os 10 mL de dialisado e
recolheu-se um volume de 12 de mL, que designou-se
por carregamento. Ao realizar lavagens com o mesmo
tampo foram recolhidas fraes de 2 mL.
Paralelamente, fez-se a leitura das absorvncias a 280
nm destas fraes usando um espectrofotmetro
UV/visvel. Iniciou-se a eluio com um gradiente
crescente de NaCl (0-1M) depois de se observar que
valor de absorvncia era inferior a 0,1. Para tal, usaramse, cerca de, 16 mL de soluo de NaCl (com
concentrao 1 M) e um volume igual de tampo de
equilbrio. Durante esta eluio, continuou-se a
recolher fraes 2 mL e a realizar as leituras da
absorvncia a 280 nm.
Ensaios Enzimticos. Com o objetivo de
estudar a atividade proteoltica da LAP monitorizou-se
espectrofotometricamente, durante 2 minutos a 405
nm, a formao do produto da reao catalisada. Este
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Extrao, Purificao e Caraterizao da Leucina Aminopeptidase

procedimento ocorreu em conformidade com Bernard
Erlanger et al [6]. O substrato usado nos diversos
ensaios enzimticos foi a L-leucina p-nitroanilina, e
portanto a libertao p-nitroanilina foi detetada por
espectrofotometria [15].
Para cada passo de purificao (extrato inicial,
precipitao com (NH4)2SO2 e cromatografia de troca
aninica) realizou-se um ensaio enzimtico. No extrato
inicial, na precipitao e no carregamento utilizou-se
40 L de amostra e 10 L de substrato, enquanto para
as pools usou-se um volume superior de amostra, 200
L. Tal como Bernard Erlanger et al [6], considerou-se
que o coeficiente de extino molar, a 405 nm, para
pNa de 8800 M-1cm-1, valor este usado nos clculos
da atividade especfica e total.
Estudo da Cintica Enzimtica. Foram,
igualmente, realizados ensaios enzimticos, nos quais
variou-se a concentrao de substrato, com o objetivo
de calcular os parmetros cinticos da enzima (Km e a
Vmx), tal como Zoran Vujcic et al [15]. Tendo em
conta que a soluo de Leu-pNa usada possua uma
concentrao de 10 mg/mL, as concentraes
utilizadas variaram entre os 884 M e 72.2 M.
Quantificao. A concentrao das protenas
nas amostras foi determinada atravs do mtodo do
Bio-Rad, que baseado no mtodo de Bradford (1976)
[2]. No entanto alterou-se o comprimento de onda de
absoro para o valor mais prximo da 595 nm a que
espectrofotmetro conseguia ler, a 655 nm. Optou-se
como protena padro a IgG, j que abrange uma maior
gama de concentraes que a BSA e a nossa protena
encontrava-se a concentraes relativamente elevadas.
Eletroforese em gel de poliacrilamida na
presena de dodecil sulfato de sdio (SDS-PAGE).

A eletroforese SDS-PAGE foi efetuada segundo o

mtodo de Laemmli modificado (1970) [9], utilizando
uma concentrao de 12,5% em poliacrilamida no gel
de separao, e 4% no gel de concentrao.
As amostras a aplicar no gel foram preparadas com
uma soluo desnaturante (8M Ureia, 4% SDS,
200mM Tris-HCl pH 8.0, 2% mercaptoetanol, 0,01%
Bromofenol azul) numa diluio de 1:1.
A corrida eletrofortica decorreu durante
aproximadamente 1 hora, tendo sido aplicado uma
voltagem de 180V. Aps a eletroforese, o gel foi
revelado com Coomassie Blue R-250, de forma a
verificar a eficcia da purificao.
Zimografia. Paralelamente eletroforese, foi
realizada tambm uma zimografia para as mesmas
amostras, de acordo com Lebber [10]. Foi utilizado
nesta tcnica um gel de poliacrilamida a 12,5% e uma
concentrao final de gelatina (substrato de proteases)
de 1 mg/mL. Como o objetivo principal desta tcnica
detetar atividade proteoltica, as amostras foram
aplicadas no gel numa diluio 1:1 com tampo de
carregamento (125 mM Tris-HCl pH 6,8 contendo 4%
SDS (v/v) e 20% glicerol (v/v)).
A zimografia ficou a correr juntamente com a
eletroforese, a 180 V durante 1 hora, em tampo de
eletroforese. Posteriormente corrida, o gel foi lavado
duas vezes com tampo de renaturao (0,25% (v/v)
Triton X-100 em tampo 100 mM Tris-HCl pH 7,5).
Cada lavagem durou, cerca de, 15 minutos e utilizou 50
mL de tampo de renaturao. Aps isto, o tampo de
renaturao foi substitudo por tampo fresco e
procedeu-se incubao overnight. No final, lavou-se o
gel com gua destilada e revelou-se com Coomassie
Blue R-250, de modo anlogo ao efetuado para a
eletroforese.

Tabela 1: Passos purificao da Leucina Aminopeptidase de folhas de espinafre Spinacia

oleracea.

A utilizao do Mtodo de Bradford permitiu determinar a concentrao proteica.

A utilizao da Leu-pNa como substrato da enzima LAP permitiu detetar a atividade enzimtica, a pH 8.

1 Unidade de atividade = 1 mol pNa formada/min. pNA (=405nm)=8800 M-1cm-1

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Purificao da Leucina Aminopeptidase
O processo de purificao da enzima LAP
encontra-se sumariado na tabela 1.
A partir de 221,5 g de folhas de espinafre extraiuse a enzima, obtendo uma concentrao proteica de
8,57 mg/mL (tabela 1).
A fase seguinte consistiu na precipitao com
(NH4)2SO2 a 75%, seguida de uma centrifugao e
dilise. A adio do sal permitiu a precipitao de
protenas, diminuindo as interaes entre estas e a gua
(processo designado por salting-out), enquanto a dilise
promoveu sada do sal, utilizando uma membrana
semipermevel. Este passo de purificao teve como
objetivo principal concentrar a nossa protena e
podemos verificar, pela tabela 1, isso mesmo (C =23.9
mg/mL). No entanto, devido grande descida de
rendimento (100% para 14.4%) pode-se considerar
que esta etapa foi o passo limitante do processo de
purificao da LAP. Esta diminuio deveu-se
precipitao da grande parte das protenas, incluindo a
LAP.
Finalmente, seguiu-se a cromatografia de troca
aninica, em que utilizou-se como matriz a QAE
Sephadex. Esta matriz sendo um quaternrio aminoetil (QAE), isto , que possui carga positiva, permitiu a
ligao forte de protenas com carga oposta. O
equilbrio da coluna foi feita com tampo 50 mM TrisHCl pH 8, e a este pH a nossa protena apresenta carga
negativa, j que o seu ponto isoelctrico 6,2. A
interao da protena com a nossa coluna possibilitou
que ficasse retida, facilitando a eliminao de outras

protenas. Para retirar a LAP da coluna efetuou-se uma

eluio com NaCl em tampo de equilbrio por
gradiente continuo (0 1 M). Ao analisarmos o perfil
cromatogrfico (Figura 2) apercebemo-nos que com as
lavagens com tampo 50 mM Tris-HCl pH 8 existiu a
diminuio da absorvncia a 280 nm, ou seja a sada de
protenas que no se fixaram coluna da matriz. Aps
aplicao do gradiente de sal, a absorvncia a 280 nm
aumentou existindo, portanto, a sada da nossa
protena. Podemos tambm notar que os valores de
absorvncia ultrapassaram o limite a que o
espectrofotmetro conseguia ler (Abs (280nm) = 3),
no sendo possvel observar a existncia de um pico de
absoro. Obtiveram-se estes valores, porque
possivelmente existia contaminao com pigmentos.
Assim, tornou-se necessrio efetuar clculos de
atividade total para cada frao para concluir onde se
encontrava a nossa protena (Figura 2).
Aps os clculos de atividade total, resolveu-se
formar duas pools: a 1 Pool foi formada a partir
fraes 48 54 mL, dando um volume total de 8 mL;
enquanto a 2 Pool foi formada a partir das fraes 56
e 58 mL, dando um volume total de 4 mL. Pela tabela
1, verificamos que a juno das fraes no permitiu a
purificao da protena, originando um grau de pureza
0,98 para a 1 pool e 0,68 para 2 pool. Estes valores
no foram superiores a 1, j que existia contaminao
com outras protenas. Pela tabela 1, pode-se ver, ainda,
que existiu uma perda significativa de protenas ao
longo do processo de purificao, pois a 1 Pool e 2
Pool apresentaram, respetivamente, um rendimento de
1.5% e 0,2%, valores estes muito baixos.

3,5

60

50

Abs a 280 nm

2,5

40

2
30
1,5
20

Atividade total (x10-3U)

Resultados e Discusso

10

0,5
0

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70

Figura 2 Cromatograma da Cromatografia de troca aninica

em eluio
QAE-Sephadex
do extrato proteico obtido da precipitao com
Volume de
(mL)
sulfato de amnia a 75% e da dilise. As absorvncias a 280 nm das fraes foram medidas na lavagem tampo 50 mM Tris-HCl pH 8
( ) e aps o gradiente de sal 0 1 M ( ). A atividade total ( ) foi calculada graas degradao do substrato de Leu-pNa, que foi
monitorizada a 405 nm. Os ensaios enzimticos realizados durante 3 minutos possuam: 200 L de amostra, 20 L de substrato e 800
L de tampo 50mM Tris-HCl pH8.

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No carregamento, os valores de rendimento
(8,8%) e do grau de pureza (1,35) foram superiores aos
das pools, o que significa que nem toda a LAP aplicada
na coluna interagiu com a matriz da QAE-Sephadex,
sendo, por isso, recolhida logo ao incio da
cromatografia. Este acontecimento pode ser explicado
devido existncia de uma grande quantidade proteica
no precipitado (239 mg) comparativamente aos
nmero de locais de ligao na matriz, que no foram
os suficientes. Assim, seria necessria aplicar um
volume menor de precipitado na coluna, ou fazer um
coluna com um volume maior de matriz, para que fosse
possvel a reteno de toda a protena aplicada. Pensase, ainda, que a existncia dos principais contaminantes
(os pigmentos fotossintticos) possa ter influenciado
estes valores, pois estes podem ocupar os locais de
ligao, impossibilitando a interao da LAP com a
nossa matriz.
Para verificar a eficcia do processo de purificao
fez-se uma SDS-PAGE, e os resultados desta
encontram-se na Figura 3.

Figura 3 Eletroforese em condies desnaturantes (SDS) das

amostras enzimticas nos diferentes passos de purificao de LAP.
Poo A Padro de pesos moleculares: 5 L; Poo B Extrato
inicial: 10 L; Poo C Precipitado com sulfato de amnia 75%:
10 L; Poo D Carregamento: 10 L; Poo E, F 1 Pool: 10
L e 5 L, respetivamente; Poo G, H 2 Pool: 10 L e 5 L,
respetivamente.

Como dito anteriormente a enzima em estudo

possui uma estrutura homohexamrica, e cada
monmero tem um peso molecular de 60 kDa.
Quando a enzima se encontra num ambiente
desnaturante, neste caso na presena de SDS, esta
dissocia-se nas suas subunidades. Podemos, ento,
corresponder na Figura 3 a banda de peso molecular
aparente de 60kDa ao monmero da enzima.
Podemos, tambm, constatar que a nossa enzima se

encontra presente em todos os passos de purificao,

incluindo o carregamento, pelo que houve perdas da
LAP ao longo deste processo. Portanto conseguiu-se
purificar de forma parcial a protena LAP.
Se compararmos a intensidade das bandas do poo
B com as de E, por exemplo, observamos que a
concentrao proteica diminuiu ao longo do processo
de purificao, nomeadamente de 8.57 mg/mL para
1.63 mg/mL.
Para alm da banda da LAP, conseguimos
observar outras bandas correspondentes a outras
protenas que no se conseguiram eliminar. As bandas
que se encontram na zona dos 32 kDa podero
corresponder protena light-harvesting chlorophyll a
(LHCPa) (36 kDa) e protena light-harvesting
chlorophyll b (LHCPb) (32 kDa), que so complexos
que possuem clorofilas e outras molculas
fotossensveis e, por isso, apresentam um mximo de
absoro nos 400-500 nm [4].
De forma avaliar atividade proteoltica da LAP
efetuou-se uma zimografia, e os resultados desta
encontram-se na Figura 4.

Figura 4 Zimograma obtido em gel de 12,5% de poliacrilamida

co-polimirizado com gelatina. Poo A Extrato inicial: 10 L;
Poo B - Precipitado com sulfato de amnia 75%: 10 L; Poo C
- Carregamento: 10 L; Poo D - 1 Pool: 10 L; Poo E 2
Pool: 10 L.

Com o objetivo de estudar a atividade da LAP a

zimografia utiliza condies no-desnaturantes, desta
forma a LAP no se dissocia nas suas formas
monomricas, mantendo, por isso, a estrutura
homohexamrica (360 kDa). Ao analisarmos os
resultados, podemos verificar que nossa enzima no
degradou a gelatina, como devia. Isto poder ter
ocorrido devido ao seu grande peso molecular de 360
kDa e sua baixa densidade de carga a pH 8,8, retendoPgina 5|7

Extrao, Purificao e Caraterizao da Leucina Aminopeptidase

se nos poos. A utilizao de um gel com uma
concentrao 12,5% de poliacrilamida (um pequeno
tamanho dos poros relativamente ao tamanho da
protena), tambm, poder ter dificultado a migrao
da nossa protena, o que permite explicar as bandas
transparentes no incio dos poos.
Pode-se confirmar, pela Figura 4, a existncia de
uma protease capaz de degradar a gelatina no
precipitado com sulfato de amnia a 75% (poo B). A
grande concentrao proteica no precipitado (23.9
mg/mL) comparativamente ao resto das amostras,
poder ser a razo pela qual s conseguimos assistir a
degradao da gelatina no precipitado.
Parmetros cinticos.
Para determinar os parmetros cinticos da enzima
LAP, nomeadamente o Km e a Vmx, foram
realizados vrios ensaios enzimticos em que se variou
as concentraes de substrato (884 M; 710 M; 180
M; 72,2 M). Sabe-se que a enzima em estudo segue
uma cintica de Michealis-Menten, desta forma para
obteno dos parmetros utilizou-se um grfico de
Eadie-Hofster (y=mx+b), que permite retirar o Km da
enzima pelo declive da reta (m=-Km) e o Vmx pela
ordenada na origem (b=Vmx). Podemos observar na
Figura 5 que o declive da reta positivo, pelo que nos
d um Km negativo (-21,769). Este valor no
corresponde realidade, j que no possvel existir
uma concentrao negativa de substrato a que a enzima
possua metade da velocidade mxima. Pode-se,
portanto, afirmar, pelos resultados obtidos, que no foi
possvel determinar nem o Km e nem o Vmx da
enzima em estudo.
1,6

v (nmol/min)

1,5

esculentum e na Gonyaulax polyedra, a enzima foi descrita

por possuir um Km igual a 140 M [8 e 13]. Admitindo
que o Km da LAP da Spinacia oleracea ronda estes
valores, as concentraes utilizadas foram maiores que
o Km, pelo que a enzima podia estar a catalisar a reao
de degradao sua velocidade mxima, neste caso
aproximadamente a 1,26 nmol/min.

Concluso
2

Atravs dos resultados obtidos possvel observar

que a LAP do espinafre foi parcialmente purificada,
devido a uma grande perda ao longo do processo de
purificao e existncia de alguns contaminantes aps
a cromatografia, nomeadamente as protenas lightharvesting chlorophyll.
Na cromatografia efetuada, o carregamento
apresentou um maior grau de pureza e rendimento que
as pools devido ao reduzido tamanho da coluna, pelo
que seria necessrio utilizar um maior volume de
matriz, de forma a permitir uma maior reteno da
LAP e melhores resultados.
de referir que no foi possvel determinar os
parmetros
cinticos
da
enzima,
mas
comparativamente com outras LAP de outros
organismos o Km poder ser muito pequeno e
portanto, seria necessrio um espectrofotmetro mais
sensvel para esclarecer esta questo.
Por fim, foi possvel, a partir deste trabalho,
comprovar afirmaes iniciais, como por exemplo a
estrutura homohexamrica da LAP e a sua capacidade
de hidrolisar o substrato sinttico Leu-pNa. Desta
forma, este trabalho contribuiu uma melhor
compreenso da LAP, o que poder ser importante
para futuros estudos relacionados com as suas funes
e possveis aplicaes.

1,4
1,3
y = 21,769x + 1,0879
R = 0,8004

1,2
1,1
1
0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

v/[S] (nmol/ min/M)

Figura 5 Grfico de Eadie-Hofster da atividade enzimtica da

LAP da Spinacia oleracea.

A Leucina Aminopeptidase pode ser encontrada

em outros organismos que no a Spinacia oleracea, como
referido anteriormente. Esta enzima j foi
caracterizada na Solanum tuberosum, onde possui um Km
igual a 9,25 M [15]. Enquanto que na Fagopyrum
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Extrao, Purificao e Caraterizao da Leucina Aminopeptidase

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