UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS

Centro de Cincias Biolgicas e da Sade

Departamento de Gentica e Evoluo
Bioqumica 2

Experimento 01: Dosagem de Glicose e Fermentao em Saccharomyces

cerevisiae.

Professor Dr. Iran Malavazi

Alana Mendona de Sousa RA: 426571

Gabriela Frutuozo Muller

RA: 474452

Gabriella Oliveira Hernandez RA: 426865

Camila Pasqualoto

RA: 507830

Jheyce Cristina Moraes

RA: 426806

Julia Francesca da Silva

RA: 427322

Las Pereira Silva RA: 427187

Oneide Chire Quispe RA: 426776

So Carlos, 25 de maro de 2015

1. INTRODUO

1.1.1. Carboidratos.
Carboidratos so poliidroxialdedos ou poliidroxicetonas, ou substncias que
geram estes compostos quando hidrolisadas. Muitos carboidratos tem a formula
emprica (CH2O)n, alguns contem nitrognio, fsforo ou enxofre em sua composio.
Existem trs classes principais de carboidratos: (i) monossacardeos; (ii)
dissacardeos e (iii) polissacardeos. Os monossacardeos so aucares simples,
constitudos de uma nica unidade poliidroxicetona ou poliidroxialdedo. Os
oligossacardeos constituem em cadeias curtas de monossacardeos, unidos por
ligaes

glicosdicas.

Os

dissacardeos

possuem

duas

unidades

de

monossacardeos. J os polissacardeos so polmeros de acar que contm mais

de 20 unidades de monossacardeos em sua constituio.
Os monossacardeos so agentes redutores, nos quais o carbono anomrico
pode ser oxidado por agentes oxidantes, como o on cprico (Cu2+). O carbono do
carbonil oxidado a um grupo carboxil.
Os aucares redutores formam enediois, que so convertidos a cidos
aldonicos e, ento, a uma complexa mistura de cidos de dois, trs, quatro e seis
carbonos.

1.1.2. Mtodos para Identificao de Acares.

O mtodo mais utilizado o DNS, o qual utiliza a caracterstica redutora de

acares para sua quantificao. A molcula de cido 3,5 dinitro saliclico (DNS),
que apresenta uma colorao alaranjada quando pura e quando reduzido por
aucares o DNS se torna cido 3-amino 5 nitro saliclico, e passa a apresentarse com uma colorao acastanhada.
Atravs dessa mudana de colorao possvel medir a quantidade de
acares relacionando a quantidade de DNS reduzido (a estequiometria da reao
1:1). Todavia, um dos principais substratos para a fermentao de microorganismos
a sacarose, que no possui poder redutor, necessrio neste caso, a hidrlise

cida desses acares em glicose e frutose, para apenas depois disto proceder
como uma anlise pelo mtodo DNS comum.
J o mtodo de Benedict geralmente utilizado para detectar a presena de
acares e acares redutores, nos quais se incluem glicose, galactose, lactose,
maltose e manose. O Reagente de Benedict consiste, basicamente, de uma soluo
de sulfato cprico em meio alcalino (com muitos ons OH-).

1.2.

Metabolismo de Carboidratos.

1.2.1. Digesto.
A digesto dos carboidratos se inicia na boca, quando amidos e glicognio
so reduzidos a estruturas menores pela ao da enzima alfa-amilase. No duodeno,
ainda pela enzima alfa-amilase, so reduzidos ao monossacardeo glicose. A alfaamilase quebra apenas ligaes glicosdicas do tipo alfa-1,4.
A hidrlise final de oligossacardeos a monossacardeos realizada no
intestino delgado, por enzimas de superfcie das clulas epiteliais, como a lactase e
a alfa-1,6-glicosidase.
1.2.2. Gliclise.
caracterizada como uma via metablica usada pelas clulas do corpo para
extrair parte da energia da glicose, gerando dois lactatos. Esse processo chamado
de fermentao anaerbica, pois no ocorre consumo de oxignio molecular e gera
dois moles de ATP a cada mol de glicose.
O efeito Pasteur se d quando h presena de oxignio molecular, que acaba
suprimindo a via glicoltica.
A gliclise se d em trs etapas: [2]

A primeira etapa irreversvel, a glicose fosforilada sob ao da

enzima hexocinase e a glicose-6-fosfato (G6P) no pode sair da clula. A enzima

glicose-6-fosfatase catalisa a reao reversa reao catalisada pela hexoca
inase, dando origem a glicose que o fgado exporta para outros tecidos. Pela
ao da enzima fosfoglicose isomerase, a G6P transformada na frutose-6fosfato (F6P). A F6P recebe mais um fosfato, convertendo-se no composto
frutose-1,6-bisfosfato.

Tal

reao

catalisada

pela

enzima

alostrica
3

fosfofrutocinase, sendo uma reao irreversvel.

Na segunda etapa gerada uma molcula de diidroxiacetona fosfato e

uma de gliceraldedo-3-fosfato (GAP). A diidroxicetona fosfato convertida em

gliceraldedo-3-fosfato, pela enzima triose fosfato.

A terceira etapa iniciada com a produo 1,3-bisfosfoglicerato, que se

d pela ao do gliceraldedo-3-fosfato desidrogenase sobre o GAP. H ao da

coenzima nicotinamida adenina di-nucleotdeo (NAD). O composto produzido
um anidrido misto de cido fosfrico e cido carboxlico, que por apresentar um
elevado potencial energtico, permite que na prxima reao catalisada pelo
fosfoglicerato

cinase,

haja

produo

de

ATP.

A terceira reao irreversvel da gliclise onde ocorre a sntese de ATP,

catalisada pela enzima piruvato cinase, que transforma o fosfoenolpiruvato em
piruvato.
As trs etapas irreversveis acima constituem os pontos de regulao da
gliclise. A hexocinase inibida pelo G6P e est presente na maioria dos tecidos. A
hexocinase est presente no fgado, assim como a glicocinase, que utilizando ATP,
fosforila a glicose. A glicose utilizada tanto no fgado, em alta velocidade, quanto
no crebro, em baixas concentraes.
A fosfofrutocinase o ponto regulatrio mais importante da maior parte dos
tecidos, uma enzima alostrica que catalisa a reao limitante da gliclise.
1.2.3. Fermentao.
Em microorganismos que vivem na carncia de oxignio, a gliclise termina
no piruvato. Isso ocorre porque as etapas seguintes dependem de oxignio, a cadeia
transportadora de eltrons e o ciclo do cido ctrico no so ativos. A gliclise
vivel porque o NADH produzido pode ser devolvido ao piruvato ao final da via. Isto
pode ocorrer diretamente (com a formao de cido ltico fermentao ltica) ou
aps a descarboxilao do piruvato (com a formao de etanol fermentao
alcolica).
Nas reaes de fermentao h baixo rendimento energtico, se comparado
oxidao completa da glicose, isso causa um desenvolvimento restrito dos
organismos estritamente anaerbios.
Quando um tecido (geralmente o msculo) trabalha em anaerobiose
4

(exerccio intenso), pode ocorrer fermentao ltica. O cido ltico pode ser
reaproveitado no fgado pela gliconeognese (o que tambm pode ocorrer
diretamente a partir de piruvato) e transportado juntamente com o grupamento
amino liberado na quebra de aminocidos. Isto constitui um ciclo til porque o fgado
gasta a energia necessria para a regenerao da glicose, podendo ento envi-la
para o msculo.
A via glicoltica, tambm chamada de gliclise, fundamental para a
fermentao.
1.2.4. Respirao.
Refere-se ao processo de extrao de energia dos carboidratos por meio de
uma transformao progressiva, tornando-os molculas menores. Tal energia
utilizada pela clula para o funcionamento do organismo.
Na presena de oxignio, a molcula de glicose se converte em CO2 e gua,
gerando ATP. A respirao ocorre na mitocndria, onde h presena de oxignio.
No citoplasma a glicose degradada em duas molculas de piruvato e
NADH2. Aps isso, o piruvato entra na mitocndria e ocorre sua degradao
completa para CO2 e H2O.
1.3.

Inibio Enzimtica.

Como as reaes da gliclise (tanto aerbia quanto a anaerbia

fermentao) so controladas por enzimas, pode-se inibi-las atravs de compostos
especficos, chamados inibidores enzimticos. Algumas dessas substncias so
constituintes normais da clula; outras so estranhas ao organismo e sua presena
acidental ou intencional nas clulas provoca alteraes significativas no
metabolismo.
Existem dois tipos de inibidores: os reversveis e os irreversveis. Os
inibidores irreversveis reagem quimicamente com as enzimas, levando a uma
inativao praticamente definitiva. H tambm os inibidores reversveis que so
classicamente divididos em: competitivos, no competitivos e mistos.
Inibio Reversvel: ocorre ligao no-covalente entre inibidor e enzima. Aps a
dissociao com o inibidor, a enzima retorna a sua atividade. Inibio Irreversvel:
5

envolve modificaes qumicas da molcula enzimtica, levando a uma inativao

definitiva. O critrio utilizado para esta diviso o estabelecimento (ou no) de
competio entre o inibidor e o substrato pelo centro ativo da enzima. A identificao
pode ser sugerida ela comparao entre a estrutura do inibidor e a do substrato,
mas revelada inequivocamente pela cintica da reao catalisada em presena do
inibidor.
1.3.1. Inibidores competitivos.

So molculas estruturalmente semelhantes ao substrato e compete com o

substrato normal pelo stio ativo da enzima Certas molculas, por apresentarem
configurao espacial semelhante do substrato, so capazes de ligarem-se ao
centro ativo da enzima, produzindo um complexo enzima/inibidor, semelhante ao
complexo enzima-substrato. A constante de equilbrio desta reao, chamada
constante do inibidor (Kic) mede a afinidade da enzima pelo inibidor, como o K m
mede a afinidade da enzima pelo substrato:

KIc =
Equao 1: Equao da constante do inibidor.

Um exemplo de inibidor reversvel competitivo o Fluoreto de Sdio (NaF).

Ele atua sobre a enzima enolase. Tal enzima catalisa a eliminao de gua do 2
fosfoglicerato para que ocorra a formao de fosfoenolpiruvato - composto dotado
de potencial energtico elevado em uma das reaes da gliclise, que permitir a
formao de ATP na reao seguinte. O fluoreto de sdio forma um complexo
(fluorofosfato de magnsio) que inibe a enzima. A enolase tem como cofatores o
Mg2+ ou Mn2+. Os ons metlicos se ligam a radicais de aminocidos da cadeia
protica ou esto em grupos prostticos. O on fluorofosfato liga-se ao Mg2+ que o
verdadeiro agente inibidor. Sendo assim, h o bloqueio da gliclise e o nvel de
glicose

inicial

permanece

igual.

2-fosfoglicerato

no

convertido

fosfoenolpiruvato e, conseqentemente, a piruvato que no ir ser convertido a

lactato ou etanol na fermentao.
6

Equao 2: Equao de Michaelis-Menten para uma Inibio Competitiva.

Onde
= 1 + [I] e KI = [E][I]
KI [EI]
O Km observado na presena de um inibidor, chamado freqentemente de
Km aparente. Devido ao fato de a ligao do inibidor com a enzima ser reversvel, a
competio pode tender a favor do substrato simplesmente por adicionar mais
substrato. Quando [S] exceder em muito [I], a probabilidade de uma molcula
inibidora se ligar enzima minimizada e a reao exibir um Vmx normal. Porm,
a [S] em que Vo = Vmx, o Km aparente, estar aumentada de um fator na
presena do inibidor. Este efeito no Km aparente, combinado com a ausncia de
efeito no Vmx, diagnstico de inibio competitiva e facilmente revelada por um
grfico dos duplos-recprocos. A constante de equilbrio para a ligao do inibidor, KI,
pode ser obtida pelo mesmo grfico.

Reao 1: Reao de inibio competitiva reversvel.

Figura 1: Grficos caractersticos de uma inibio competitiva pela Equao

de Michaelis Mentem e Linearizao de Lineweaver-Burk.

1.3.2. Inibidores no competitivos:

O inibidor liga se diretamente ao complexo enzima-substrato, mas no

enzima livre. Tal inibidor no precisa se assemelhar ao substrato, mas provoca uma
distoro do stio ativo da enzima, fazendo com que a mesma seja cataliticamente
inativa. Assim, no guardam qualquer semelhana estrutural com o substrato da
reao que inibem. Seu efeito provocado por ligao a radicais que no pertencem
ao centro ativo; esta ligao altera a estrutura enzimtica a tal ponto que inviabiliza a
catlise. O ponto de ligao do inibidor no competitivo a cadeia lateral de um
aminocido. Como os grupos laterais que so utilizados nessas ligaes so
frequentes nas enzimas, a ao de inibidores no competitivos bastante
inespecfica.

Equao 3: Equao de Michaelis-Menten para Inibio no Competitiva.

Onde,
= 1 + [I]; e KI = [ES][I]
KI [ESI]
Conforme descrito na equao acima, em altas concentraes do substrato
Vo se aproxima de Vmx/. Assim, um inibidor no-competitivo diminui a Vmx. O
valor do Km aparente tambm diminui porque a [S] requerida para alcanar a
metade do valor de Vmx diminui de um fator .

Reao 2: Reao de inibio no competitiva.

Figura 2: Grficos caractersticos de uma inibio no competitiva pela

Equao de Michaelis Mentem e Linearizao de Lineweaver-Burk.

1.3.3. Inibidores Mistos:

Neste caso tanto a enzima como o complexo enzima-substrato ligam o

inibidor. O inibidor misto liga se a stios da enzima envolvidos tanto na ligao do
substrato como na catlise enzimtica. Exemplo: ons metlicos.
Inativadores de enzimas: ligam-se as enzimas de maneira forte; substncias
que modificam quimicamente resduos de aminocidos especficos podem agir como
inativadores; a cintica de um inativador se assemelha a de um inibidor nocompetitivo puro.

Reao 3: Reao de inibio mista.

10

Figura 3: Grficos caractersticos de uma inibio no competitiva pela

Equao de Michaelis Mentem e Linearizao de Lineweaver-Burk.

1.3.4. Inibio pelo NaF.

Algumas

molculas,

que

apresentam

caractersticas

estruturais

compatveis com enzimas especficas, so capazes de ligarem-se ao centro ativo de

tal enzima que catalisa processos biolgicos, produzindo um complexo enzimainibidor. Estes so os inibidores competitivos (Ic). O inibidor possui, muitas vezes,
caractersticas similares s do substrato.
A reao pode ser esquematizada como:

ENZIMA + Ic

ENZIMA(Ic)

O complexo ENZIMA(Ic) no apresenta as propriedades do complexo

entre enzima e substrato; assim, a atividade enzimtica fica diminuda de acordo
com a quantidade de enzima que estiver unida ao inibidor. Uma vez que este tipo de
inibidor de liga ao mesmo stio onde se liga o substrato, a ligao do inibidor
enzima impede a ligao do substrato mesma.
O NaF - inibidor reversvel competitivo - age como um inibidor da
enzima fosfoenol piruvato hidratase (enolase) numa etapa da gliclise descrita
abaixo:

11

2-fosfoglicerato

Fosfoenolpiruvato

A enzima glicoltica responsvel por catalisar essa reao a enolase.

Essa enzima promove a remoo reversvel de uma molcula de gua do 2fosfoglicerato (desidratao) para liberar fosfoenolpiruvato (PEP)- composto dotado
de potencial energtico elevado em uma das reaes da gliclise, que permitir a
formao de ATP na reao seguinte.
O inibidor NaF, forma um complexo (fluorofosfato de magnsio) que inibe a
enzima e impede que ela participe da reao, fazendo com que o 2-fosfoglicerato
no seja convertido a fosfoenolpiruvato e, conseqentemente, a piruvato que no
poder ser convertido a lactato ou etanol durante a fermentao. [1]

2. OBJETIVOS

O experimento tem por objetivo verificar a eficincia da fermentao da

glicose por S. cerevisiae a partir do desprendimento de CO2 medido pela diferena
de massas e do consumo de glicose e tambm observar o poder de inibio do NaF
neste processo. Por fim, elaborar uma curva padro de glicose para a dosagem de
acares redutores por meio do mtodo espectrofotomtrico.
3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

3.1.

Produo de CO2 e consumo de glicose na ausncia e presena de

inibidor.

3.1.1. Material Utilizado.

Erlenmeyers (250 mL);

Micropipeta de volume varivel (100 1000 L);

Micropipeta de volume varivel (20 200 L);

Banho Maria;

Balana;
12

Centrfuga;

Banho de gelo;

YED (1,4% extrato de levedo e 14% de glicose);

Agente fermentativo: fermento Fleishmann, suspenso 6,7% em gua (peso

mido/volume);
A um dos frascos de erlenmeyer contendo 20 mL de YED, adicionou-se cerca

de 3,0 mL (j alquotado) de NaF 1mol/L, sendo em seguida identificado como

cultura com inibidor. Em seguida, a cada um dos frascos adicionou-se cerca de
10 mL de suspenso celular 67% (fermento Fleishman). Ao frasco sem inibidor
adicionou-se 3 mL de gua miliQ e, identificado como cultura sem inibidor.
As misturas foram homogeneizadas, o tempo foi anotado e imediatamente
retirou-se uma alquota de 1,0 mL de cada erlenmeyer, transferindo-a para um tubo
de microcentrfuga. Manteve-se as alquotas em banho de gelo.
Os dois erlenmeyers foram pesados e incubados a 30C, e depois foram
colocados para agitar a 300 rpm num tempo de 90 minutos. Os frascos de cultura
foram pesados para que a quantidade de CO2 desprendido pudesse ser calculada
por meio da subtrao das massas obtidas.
As alquotas retiradas aps a homogeneizao, foram centrifugadas numa
velocidade de 1200 rpm num tempo de 2 minutos. Em seguida transferiu-se os
sobrenadantes para dois novos tubos onde foram conservados em banho de gelo
para que no houvesse qualquer consumo de glicose.
Descartou-se o sedimento formado pelas clulas.
Pesaram-se os frascos da cultura com e sem inibidor- depois de 90 minutos
para ento calcular a quantidade de CO2 desprendido no perodo de fermentao.
Isso por meio de uma subtrao das massas final e inicial.
Aps a pesagem, retirou-se uma alquota de 1mL de cada erlenmeyer para
novos tubos de microcentrifuga e manteve-se as alquotas em banho de gelo.
Centrifugaram-se as alquotas a uma velocidade de 14.000 rpm num tempo
de 2 minutos.
Os sobrenadantes que foram obtidos foram usados para quantificar a glicose
residual depois do processo de fermentao. Em seguida foram descartados os
sedimentos celulares.
13

A seguir, foi montada uma tabela com os resultados obtidos durante o

processo de fermentao da glicose pela levedura Saccharomyces cerevisiae:
Tabela 1: Resultados obtidos durante o processo de fermentao da glicose.
Cultura sem inibidor

Cultura com inibidor

Tempo Massa do erlenmeyer

Massa CO2

Massa do erlenmeyer

Massa CO2

(min) contendo a cultura (g)

(g)

contendo a cultura (g)

(g)

122,131

124,879

90

119,836

2,295

123,925

0,954

Observa-se que a massa de CO2 menor na cultura com inibidor, pois o

inibidor retrocede o processo de fermentao durante reao.
Foi calculada a eficincia (E) de fermentao a partir da quantidade de CO2
produzido em relao quantidade de glicose que foi consumida. Assim como
tambm se calculou o grau de inibio causado pelo NaF 0,125mol/L, aps o tempo
de 90 minutos.
3.2.

Determinao da glicose consumida durante a fermentao (inicial e

residual).

3.2.1. Material utilizado.

Banho Maria;

Micropipeta de volume varivel (100 1000 L);

Micropipeta de volume varivel (20 200 L);

Espectrofotmetro;

Banho de gelo;

Clula ptica (1cm)

cido 3,5 dinitrossaliclico em soluo alcalina (DNS) 10g/L

14

As alquotas que foram obtidas nos tempos 0 e 90 minutos foram

conservadas em banho de gelo e fizeram parte de quatro pontos experimentais,
denominados:
T0 sem inibidor
T0 NaF
T90 sem inibidor
T90 NaF
E a partir destes pontos se determinou a concentrao da glicose. Fazendo
as diluies necessrias e obedecendo de forma rigorosa os volumes finais
indicados, utilizou-se em cada diluio a amostra inicial, isto T0 com e sem inibidor
e T90 com e sem inibidor.
Tabela 2: T0 sem inibidor e To NaF.

Tubos Propores
A

1:2

1:10

1:100

Volumes (L)

Tabela 3: T90 sem inibidor.

Tubos Propores
A

1:2

1:10

1:30

Volumes (L)

15

Tabela 4: T90 NaF.

Tubos Propores Volumes (L)

A

1:2

1:10

1:100

Utilizou-se as diluies de cada ponto experimental (T0 sem inibidor; T0 NaF;

T90 sem inibidor; T90 NaF) para efetuar o teste de DNS e obteve-se a absorbncia.
Assim, a partir de cada uma das diluies, transferiu-se para os tubos de
reao cerca de 200 microlitros de cada amostra e 200 microlitros de DNS.
Procedeu-se com a reao de DNS, incubando-a 100C por um tempo de 5
minutos. Resfriou-se e completou-se o volume para 3mL com gua destilada (ou
seja adicionando-se cerca de 2,6 mL a todas as reaes.
Zerou-se o espectrofotmetro utilizando-se o tubo Branco e determinou-se a
absorbncia em 540 nm.
Finalmente, depois da obteno das absorbncias, determinou-se as
concentraes com auxlio da curva padro.
Apresentou-se o clculo da concentrao esperada de glicose da amostra do
tempo zero no relatrio. Massa molecular da glicose= 180,16g/mol, massa molecular
CO2= 44g/mol.

3.3. Dosagem de acares redutores pelo mtodo do 3,5 dinitrossalicilato

(DNS) e obteno da curva padro.

16

3.3.1. Material utilizado.

Tubos de ensaio;

Banho maria;

Banho de gelo;

Espectrofotmetro;

Tabela 5: Dados para obteno da curva padro de glicose. A partir da soluo

padro 10 mM (0,182g/100mL).

Glicose (Sol. Padro) 10 mol/mL

gua destilada

DNS

(L)

(L)

(L)

Branco

--

200

200

40

160

200

80

120

200

120

80

200

160

40

200

200

--

200

TUBO

Lanou-se ao grfico as leituras de absorbncia (Y) versus as concentraes

de glicose (X). Cuja montagem do grfico destinou-se medio de concentrao
de glicose da alquota inicial e final do processo fermentativo.
Ao grfico demonstrou-se a mdia +/- desvio padro dos valores obtidos,
como tambm o coeficiente de correlao (r2 ).

4.

RESULTADOS E DISCUSSO

4.1. Produo de CO2 e consumo de glicose na ausncia e presena de

17

inibidor.

Tabela 6: Resultados obtidos pela produo de CO2 e consumo de glicose na

ausncia e presena de inibidor.
Cultura sem inibidor

Cultura com inibidor

Tempo

Massa do

Massa de

Massa do

Massa de

(min)

Erlenmeyer

CO2 (g)

Erlenmeyer

CO2 (g)

contendo a cultura

contendo a cultura

(g)

(g)

122,131

90

119,836

2,295

124,879

0,954

123,925

Calculou-se a quantidade de massa de glicose presente no meio reacional e a

quantidade de massa de CO2 esperada, como abaixo:

14 g glicose--- 100 mL YED

X ---- 20 mL YED
X = 2,80 g de glicose.
Logo, pela reao de fermentao tem-se a seguinte relao:
1 mol de glicose 2 mols de CO2

Assim, a quantidade de massa de CO2 esperada 5,60 g.

Calculou-se a eficincia (E) de fermentao a partir da quantidade de CO2

produzido em relao quantidade de glicose consumida, utilizando a frmula:
=

2 ()
2 ()

Equao 4: Eficincia (E).

A eficincia para a cultura sem inibidor foi de 0,41 e para a cultura com
inibidor foi de 0,17.
Em seguida calculou-se o grau de inibio ocasionado pelo NaF, utilizando a
seguinte frmula:
18

2( ) 2( )
100
2( )

Equao 5: Grau de inibio da molcula de NaF.

Deste modo, o grau de inibio para o NaF foi igual a 58,43 %.
4.2.

Dosagem de acares redutores pelo mtodo de 3,5 dinitrossalicilato

(DNS) e obteno da curva analtica.

Tabela 6: Dados obtidos experimentalmente para curva de calibrao.

[Glicose]

I*

II

III*

IV*

VI

0,16

0,03

0,141

0,113

0,097

0,188

0,33

0,21

0,301

0,300

0,187

0,346

0,43

0,31

0,470

0,358

0,342

0,447

0,54

0,43

0,564

0,527

0,348

0,696

0,73

0,65

0,817

0,647

0,411

1,036

/ mol
mL-1

*estes dados foram utilizados para a construo do grfico, com mdia e desvio
padro.

Assim construiu-se a curva de calibrao com a mdia e desvio padro,

obtendo o grfico abaixo:

19

Absorbncia

0.9
0.6
0.3
0.0
-0.3
0

-1

[glicose] / mol mL

Grfico 1: Curva de calibrao de absorbncia versus concentrao de glicose.

A curva y = a + b*x, onde:

a = 0,00114; b = 0,14234.
Com coeficiente de correlao (r2) de 0,99392 e desvio padro de 0,2437.
4.3.

Concentrao esperada de glicose.

Comentado [LP1]: Meninas calcular aqui a concentrao de

glucose esperada para uma reao com 100% de rendimento.
Abaixo, eu j calculei a quantidade de glicose e a concentrao
inicial

A partir da massa esperada de glicose pode-se calcular a sua concentrao

no meio.
2,8g glicose ------20mL
X ------1000mL
Obteve-se 140g/L de glicose.
4.4.

Determinao da glicose consumida durante a fermentao (inicial e

residual).

Aps a obteno das absorbncias nos pontos T0 sem inibidor, T90sem

inibidor, T0 com inibidor e T90com inibidor, cujos dados foram:

tempo
T0
T0 NaF
T90
T90NaF

Tabela 7: Dados experimentais obtidos de absorbncia.

I
II
III
IV
VI
0,10
0,170
0,400
0,308
0,138
0,13
0,220
0,340
0,309
0,166
0,03#
0,100#
0,390*
0,143**
0,098*
0,5
0,200
0,490
0,249
0,292**

VI
0,708
0,744
0,112#
0,844*
20

# diluies de 1:30
*diluies de 1:2
**diluies de 1:10
O restante foram diluies 1:100.

Com o auxlio da curva padro de glicose obtida anteriormente, calculou-se a

concentrao de glicose.

Tempo
T0
T0 NaF
T90
T90NaF

Tabela 8: Concentrao de glicose nas amostras em mol mL-1

I
II
III
IV
VI
0,694534 1,186314 2,802164 2,155824 0,961501
0,905297 1,537586 2,380638
2,16285 1,158213
0,202754 0,694534
2,73191 0,996628 0,680483
3,504707 1,397077 3,434453 1,741324 2,043417

VI
4,965997
5,218912
0,778839
5,921456

Tabela 9: Concentrao de glicose nas amostras em mol mL-1, considerando o

fator de diluio.
tempo
I
II
III
IV
VI
VI
T0

69,4534 118,631 280,216 215,582 96,1501 496,5997

T0 NaF 90,5297 153,759 238,064 216,285 115,821 521,8912

T90

6,08262

20,836 5,46382 9,96628 1,36097 23,36517

T90NaF 350,471 139,708 343,445 174,132 20,4342 11,84291

4.5.

Clculo da concentrao inicial de glicose no tempo zero.

Calculou-se a concentrao de glicose no tempo zero da seguinte maneira:

2,80
=
= 0,47 1

180,16
33 103

5.

CONCLUSO
Com base neste experimento, pode-se concluir que o mtodo DNS mostrou-

se eficaz, possibilitando a quantificao de glicose no processo de fermentao pela

levedura Saccharomyces cerevisiae.
Foi produzido cerca um de 2,295g de dixido de carbono na ausncia do
inibidor e 0,954g na presena do inibidor, durante o processo fermentativo. Assim, a
eficincia do mesmo a partir da quantidade de CO2 produzido em relao
21

Comentado [LP2]: Meninas falta considerer o fator de diluio,

s pegar essa tabela abaixo e multiplicar pelo fator de diluio. Por
ex. Quando diluimos vc multiplica o valor que est na tabela por 2.
Tem que fazer isso para todos os valores, ento montem uma nova
tabela considerando o fator de diluio de cada um. J deixei tudo
marcado quais so fatores de diluio na tabela acima.

quantidade de glicose consumida foi de 41% na ausncia do inibidor e 17% na

presena de inibidor.
Deste modo, o inibidor NaF apresentou grau de inibio de 58,43%,
interrompendo satisfatoriamente o processo oxidativo da glicose.
6.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

[1] LEHNINGER, A. L. Princpios de Bioqumica. Trad. De Arnaldo A. Simes e

Wilson R. N. Lodi. Vol.2, 4Edio. Editora Sarvier. So Paulo, 2006. p. 526;
[2] MARZZOCO, A., Bioqumica Bsica, 3 edio. Editora Guanabara Koogan S.A.
Rio de Janeiro, 2007. Cap.9

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