16/06/2015

Secuenciacin del pptido

Anlisis de grupos terminales

N-terminal

C-terminal

Degradacin de Edman.
Mtodo de Sanger

Carboxipeptidasa

3. Identificar las N-terminales.

Mtodo de Sanger
El reactivo clave utilizado en el mtodo de Sanger para identificar le N-terminal
es el 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno.
1-Fluoro-2,4-dinitrobenceno es muy reactivo ante la sustitucin nucleoflica
aromtica.

F
-

N+
O

N+
O

El nuclefilo ataca aqu

desplazando al F.

O-

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3. Identificar las N-terminales.

El 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno reacciona con el
nitrgeno del grupo amino del aminocido de la Nterminal.

Mtodo de Sanger

La hidrlisis cida rompe todos los

enlaces peptdicos dejando una mezcla
de aminocidos, solo uno de ellos (el Nterminal) porta un grupo 2,4-DNP.

3. Identificar las N-terminales.

Degradacin de Edman
1. Mtodo para determinar la N-terminal.
2. Puede ser realizado secuencialmente un residuo a la vez en la
misma muestra. Usualmente se puede determinar los
primeros 20 aminocidos a partir de la N-terminal por este
mtodo.
3. 10-10 g de muestra es suficiente.
4.
Ha sido automatizado.
5.
El reactivo clave es el fenilisotiocianato.

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3. Identificar las N-terminales.

Degradacin de Edman

Una feniltiourea

pptido
pptido

Calor
H+

fenilisotiocianato

pptido

pptido

calor

Feniltiohidantoina

Una tiazolona

3. Identificar las C-terminales.

Carboxipeptidasa
La Carboxipeptidasa es selectiva para la ruptura del enlace peptdico del aminocido
C-terminal.

O
+
H3NCHC
R

protena

NHCHCO
R

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4. Organizar la informacin de las secuencias

de los fragmentos menores que pueden
revelar la secuencia entera.

Sntesis de pptidos
La formacin de una amida no es tan sencilla con los
aminocidos ya que el grupo carboxlico puede reaccionar con su
propio grupo amino.
La conectividad de los AA deben realizarse en la secuencia
correcta. La formacin aleatoria del enlace peptdico con una
mezcla de fenilalanina y glicina puede dar por ej. 4 dipptidos:
PhePhe
GlyGly
PheGly
GlyPhe.
Algunos AA tiene cadenas que podran interferir con la formacin
del dipptido. Como resultado, la sntesis de pptidos siempre
implica la activacin de ambos reactivos para formar los enlaces
peptdicos correctas y proteger grupos para bloquear la formacin
de enlaces incorrectos

Sntesis en fase slida

Sntesis en solucin

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Sntesis de pptidos
Estrategia general
1. Limitar el nmero de posibilidades protegiendo el
nitrogeno de un AA y el grupo carboxilico del otro.

N-Protegido
fenilalanina

C-Protegido
glicina

O
X

NHCHCOH

H2NCH2C

CH2C6H5

Sntesis de pptidos
Estrategia general
2. Enlazar los dos AA protegidos.

NHCHC

NHCH2C

CH2C6H5
O
X

NHCHCOH

O
H2NCH2C

CH2C6H5

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Sntesis de pptidos
Estrategia general
3. Desproteger el grupo amino de la N-terminal y el grupo
carboxlico de C-terminal

NHCHC

NHCH2C

CH2C6H5

O
+
H3NCHC

NHCH2CO

CH2C6H5

Phe-Gly

Sntesis de pptido en solucin

Paso preliminar: Proteccin de la N-terminal con Z

Paso 1: Activar al grupo carboxlico con cloroformiato de etilo

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Sntesis de pptido en solucin

Paso 2: Formacin del enlace peptdico para acoplarse al prximo AA.

Paso 3: Activar al grupo carboxlico del dipptido con cloroformiato de etilo

Sntesis de pptido en solucin

Paso 4: Formar el tripptido

Paso 5: desproteccin del extremo N-terminal del pptido completo.

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Sntesis de pptido en fase slida

Resina de Merrifield

Sntesis de pptido en fase slida por el mtodo

Merrifield

Dipptido

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Estructura de las protenas

Estructura primaria
Esta definida por la secuencia de aminocidos junto con los
puentes disulfuro. Todas las propiedades de la protena se
determinan, directa o indirectamente, por la estructura primaria.
Estructura secundaria
Es el plegamiento regular local entre residuos de AA cercanos
de la cadena polipeptdica. Este tipo de estructura se adopta
gracias a la formacin de puentes de hidrgenos entre los
grupos carbonilo (-CO-) y amino (-NH-) de los carbonos
involucrados en las uniones peptdicas de AA cercanos en la
cadena.
Estructura terciaria
La estructura terciaria de una protena es su completa
conformacin tridimensional. La estructura terciaria
incluye toda la estructura secundaria y todos los dobleces y
pliegues en el medio.
Estructura cuaternaria
se refiere a la asociacin de dos o ms cadenas de pptidos
para completar la protena

Estructura secundaria de las protenas

N H
O
H N

Cb
O

N H
O

H N

Cb

Cb
w
O
H N

O
N H
H

Cb
O

Cb

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a-hlice

ngulos tpicos de a-hlice

y = -47

f = -58

w = 180

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puentes H en la a-hlice

Hoja plegada b

antiparalelo

paralelo

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Disposicin espacial de una hoja b

y = 180

f = 180

Estructura secundaria
Estructura cuaternaria

Estructura terciaria

Estructura primaria

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Estructura secundaria

Estructura cuaternaria

Estructura terciaria

Estructura primaria

Desnaturalizacin de las protenas

Pequeos cambios en la medio ambiente puede causar un cambio qumico o conformacional de la
protena que resulta en la desnaturalizacin
Desnaturalizacin: Alteracin de la estructura normal y la prdida de la actividad biolgica de una
protena. Muchos factores que pueden favorecer a la desnaturalizacin, pero los ms comunes son el
calor y pH.
Al cambiar el pH, las cargas de los aminocidos cambian haciendo que partes que se atraian no lo hagan
ms o que grupos que no interaccionaban se repelan
Un aumento de temperatura puede aumentar la movilidad rompiendo puentes H y otras interacciones
dbiles
Los enlaces covalentes no se afectan
al desnaturalizarse:
Las enzimas pierden su actividad cataltica
La solubilidad disminuye drsticamente
En algunos casos puede revertirse

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