Manuallab Biote Ambiental2011 - PDF

1er Revisin
[http://planetabeta.com/aprendiendo-cuidar-ambiente]
2011
Dra. Ins Garca

Dra. Estela Flores Gmez
M. en C. Jessica Batalla
MANUAL DE PRCTICAS
BIOTECNOLOGA AMBIENTAL
NORMAS GENERALES DE TRABAJO EN EL LABORATORIO

El laboratorio de biotecnologa es un lugar adecuado para llevar a cabo prcticas
de las diversas reas de trabajo, cuenta con material de vidrio, equipo bsico de
laboratorio, as como reactivos y medio de cultivo.
Es necesario cumplir con los REQUISITOS BSICOS:
1. Pase de lista a los 10 min de la hora de entrada.
2. Traer lo indispensable para su trabajo dentro del laboratorio (cinta maskin,
encendedor, plumon indeleble, tijeras, franela limpia, etc) de no ser as se le
bajaran 5 puntos de su trabajo de laboratorio cada vez que carezca de
material de trabajo.
3. Evitar la contaminacin con microorganismos ajenos a nuestro sistema de
estudio
Para mantener ests condiciones tambin es necesario respetar una serie de
NORMAS DE SEGURIDAD:
1. Entrar con la bata puesta, abotonada y limpia. si va a trabajar extra clase
avisar al profesor que este en clase que actividad realizar y quin es su
profesor.
2. No comer dentro del laboratorio.
3. Limpiar mesa con franela limpia y de su propiedad.
4. Checar al inicio del laboratorio la tarja que le corresponde, no deber existir
material roto o sucio, si no es reportado dicho material ser su
responsabilidad lavarlo y/o pagarlo.
5. En caso de que exista material limpio y seco, este ser guardado
inmediatamente en su lugar asi prevenimos que se rompa el mismo.
6. Dejar limpio su lugar de trabajo en la parte superior e inferior.
7. Colocar su mochila en la parte inferior de la mesa de trabajo de lo contrario
se le quitaran 5 ptos de trabajo de laboratorio cada vez que se le llame la
atencin.
8. No est permitido abrir sus maquinas porttiles para realizar tareas ajenas
al laboratorio, de lo contrario se le recoger y se entregara al final de la
sesin del laboratorio.
9. No est permitido contestar llamadas de celular durante la discusin de lo
contrario se quedar con cero.
10. Se les asignara una gaveta y un lugar en el refrigerador por grupo, mismos
que tendrn que mantenerse limpios y ordenados.
11. Se deber mantener una conducta adecuada dentro del laboratorio, se
hablarn con respeto y manteniendo un nivel ptimo de sonido.
12. Etiquetar todo su material y reactivos con plumn indeleble o se desechara.
13. Usar agua destilada para preparar soluciones y/o enjuagar material, sta
agua se tomar del rea de bioingeniera ya que el equipo dentro del
Manual de Prcticas Biotecnologa Ambiental |2011
laboratorio nos proporciona agua desionizada y miliQ misma que ser

usada segn se requiera.
14. Si va a utilizar la campana de extraccin colocar un papel en la base para
evitar que se manche el acero con los diferentes reactivos.
15. Cuando requiera trabajar extra clase, lo har en la parte del fondo del
laboratorio y pedir acceso al profesor que se encuentre en ese momento,
solo tiene que decir: EXTRACLASE del profesor ______________
EVALUACIN
INICIO DE PRCTICA:
1. Se entregar bitacora con diagrama de flujo metodologa y cuestionario
contestado al inicio de cada sesion, misma que ser presentada en una
libreta exclusiva de la materia. o bien hojas sueltas que al final de la materia
se mostrarn engargoladas con las 6 prcticas realizadas junto con reporte
c/u.
2. Como parte de su trabajo de laboratorio se le preguntar al alumno la
metodologa a realizar y en caso de que no sepa se le descontarn 5
puntos.
3. El laboratorio de biotecnologa ambiental tiene un valor de 30 % de la
calificacin final que se califican de la siguiente manera:
Bitcora
Examen
Trabajo Experimental
Discusin
Informe de la prctica
10% diagrama flujo metodologa y cuestionario

20% escrito
35% desempeo global en el laboratorio
10% ser realizada por los alumnos
25%
Se entregar en la libreta u hojas sueltas consta:

Portada
Titulo
Introduccin
Objetivos
Resultados y anlisis de resultados
Conclusiones
Referencias Bibliogrficas
Anexo: Cuestionario
4. Se requiere de un mnimo de 80% de asistencia a las sesiones prcticas

para acreditar el laboratorio.
5. Recuerde que si no acredita laboratorio no puede acreditar la teoria.
FINAL DE PRCTICA:
1. Al final de cada sesin se entregar mesa y material limpio.
2. Al final del semestre se entregar una libreta con las bitcoras y/o las hojas
engargoladas y se anexarn sus reportes de cada prctica.
3. Al final del semestre durante la ltima sesin de laboratorio se entregar su
gaveta y lugar de refrigerador vacio y limpio.
INDICE
X
Prctica 1. Extraccin de ADN genmico de suelo
X
Prctica 2. Degradacin de fenoles
Dra. Ins Garca
X
Prctica 3. Produccin de Metano
Prctica 4. Determinacin de DQO

Dra. Ins Garca
X
Prctica 5. Produccin de bioetanol
Dra. Ins Garca
X
Prctica 6. Determinacin del Kla por el mtodo del sulfito
M. en c. Jessica Batalla Mayoral
Pendiente
Prctica 7. Biodisel
Pendiente
Prctica 8. Prctica de Campo
Dra. Ins Garca
Prctica 1. EXTRACCIN Y ANLISIS ADN genmico de suelo

I. INTRODUCCIN
Podemos considerar el ADN o cido desoxiribonucleico, como el cerebro
celular que regula el nmero y naturaleza de cada tipo de estructura y
composicin celular, transmitiendo la informacin hereditaria y determinando la
estructura de las protenas, que a travs de enzimas determinar el resto de
funciones celulares. A finales del siglo pasado se descubri tambin la existencia
de una segunda clase de cido nucleico, denominado cido ribonucleico (ARN). El
ARN se encuentra tanto en el ncleo (concretamente en el nuclolo) como en el
citoplasma de las clulas de manera abundante.
Ambos tipos de cido nucleico, ADN y ARN, se encuentran simultneamente en
organismos eucariotas (con clulas de ncleo diferenciado) y procariotas
(bacterias, etc.), y slo uno de ellos en los virus.
Para una extraccin de ADN efectiva se deber conocer las caractersticas
bsicas de la muestra con la que trabajar, se debe conocer si el ADN a ser
extrado proviene de una clula procaritica o eucaritica dado que los
componentes que forman la pared y membrana celular de estos organismos es
distinta. Existen diversos mtodos de extraccin de ADN que se ajustan a las
necesidades de cada tipo de muestra, estos incluyen tratamientos fsicos,
qumicos, enzimticos o una combinacin de los mismos.
Por otro lado, la Ingeniera Gentica (IG) es una herramienta que trabaja
bsicamente con cidos nucleicos. Su anlisis, manipulacin o clonaje requieren
poder disponer de una cantidad adecuada de material y en estado suficientemente
puro para su utilizacin con garantas; en general, se podra definir como un
conjunto de metodologas que permite transferir genes de un organismo a otro y
expresarlos (producir las protenas para las cuales estos genes codifican) en
organismos diferentes al de origen. El ADN que combina fragmentos de
organismos diferentes se denomina ADN recombinante. As, es posible no slo
obtener protenas recombinantes de inters sino tambin mejorar cultivos y
animales. Los organismos que reciben un gen que les aporta una nueva
caracterstica se denominan organismos genticamente modificados (OGM) o
transgnicos. A su vez, la IG es lo que caracteriza a la biotecnologa moderna que
implementa estas tcnicas en la produccin de bienes y servicios tiles para el ser
humano, el ambiente y la industria.
El objetivo general de sta prctica es la extraccin de ADN genmico de suelo, y
como objetivos especficos, determinar la calidad del material gentico extrado
mediante una electroforesis en gel de agarosa as como la estimacin de la

concentracin y pureza del mismo.
II. Objetivos
III. Material y reactivos

- Micropipeta 1 ml, 200 y 20 ul
- Puntas para micropipeta 1 ml, 200 ul y 20 ul estriles
- Tubos de plstico de 5 ml estriles
- Tubos para microcentrifuga eppendorf 2 ml
- Un cuadrito de parafilm
- 300-400 mg de suelo.
- Guantes
EQUIPO
- Microcentrfuga
- Espectrofotmetro
- Celdas de cuarzo.
- Cmara de Electroforesis
- Campana de extraccin
REACTIVOS
-Buffer de extraccin CTAB
- Cloroformo:Octanol (24:1)
- Fenol:Cloroformo (1:1)
- Isopropanol fro
- NaCl 5.0 M pH 5.2
- EtOH
- Solucin de lavado 1: 76% EtOH, 0.2 M NaOAc

- Solucin de lavado 2: 76% EtOH, 10 mM NH4OAc
- Buffer TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM Na2EDTA, pH 8.0)
- Buffer de corrimiento TAE 50X (Trisbase, Ac. actico glacial, Na 2EDTA pH 8.0)
- Buffer de carga (Tris, azul de bromofenol y glicerol)
- Bromuro de Etidio.
- Marcador de peso molecular como control.
- RNAsa (10mg/ml)
IV. METODOLOGIA
3.1 Extraccin de ADN genmico de suelo
1. PONTE TUS GUANTES
2. Pesar 300-400 mg de suelo en un tubo de centrifuga de polipropileno de 15 ml.
3. Adicionar 9.0 ml de CTAB precalentado (65C) al suelo y mezclar suavemente
por inversin varias veces.
Nota: Se recomienda distribuir el suelo a lo largo del tubo antes de aadir el buffer,
para evitar el aglutinamiento del suelo en el fondo del tubo.
4. Incubar 60-90 min a 65 C con agitaciones continuas.

5. Sacar los tubos de la incubadora y esperar de 45 min que se enfren, y
despus adicionar 4.5 ml cloroformo:octanol (24:1). Cerrar el tubo para mezclar de
5-10 min.
6. Centrifugar por 10 min a 3200 rpm a Temperatura Ambiente (TA).
OJO: debajo de 15C el complejo CTAB/ADN puede precipitar, por lo tanto evitar
esta condicin.
7. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo de 15 ml. Adicionar 4.5 ml de

cloroformo/octanol y mezclar suavemente por 5-10 min.
8. Centrifugar por 10 min a 3200 rpm a TA.
9. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo de 15 ml que contenga 30 ul de
RNAsa (10mg/ml) precalentada. Mezclar por inversin e incubar 30 min a TA.
10. Adicionar 6 ml de isopropanol (2-propanol). Mezclar suavemente por inversin.
11. Remover el ADN precipitado con una varilla de vidrio en forma de gancho o
bien centrifugar para obtener la pastilla de ADN.
Extraccin con Fenol para obtener ADN de alta pureza

sta opcin es altamente recomendada para anlisis de ADN basados en la
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), as como RAPDs.
12. Colocar el ADN en un microtubo eppendorf de 2 ml que contenga previamente

1 ml de TE; suavemente girar el gancho hasta depositar el ADN del paso anterior.
Tapar los tubos y mezclar, dejar toda la noche a que se disuelva el ADN a TA.
13. Aadir 1 vol de fenol:cloroformo en relacin 1:1. Centrifugar los tubos a 3200
rpm durante 10 min.
14. Transferir la fase acuosa a un tubo eppendorf nuevo estril de 2 ml. Extraer el
ADN con 1 ml (1X volumen TE original) de cloroformo:octanol. Centrifugar la
muestra 10 min a 3000-3200 rpm.
15. Transferir la fase acuosa a un nuevo tubo eppendorf de 2ml estril.
Precipitacin con Etanol

16. Precipitar el ADN adicionando 50 ul de NaCl 5 M y despus 1 ml de EtOH
absoluto. Mezclar suavemente por inversin.
17. Centrifugar a 12000 rpm, 1 min para recuperar la pastilla de ADN.
Lavados de la pastilla
18. Aadir 2 ml solucin de lavado 1. Dejar la pastilla 10-20 min agitando

suavemente de manera continua.
19. Centrifugar a 12000 rpm, 1 min para recuperar la pastilla y
sobrenadante.
decantar
20. Adicionar la solucin de lavado 2 y enjuagar la pastilla de ADN. Centrifugar

para recuperar la pastilla de ADN 12krpm, 1 min.
21. Decantar la solucin de lavado 2 y dejar secar la pastilla.
22. Adicionar 0.3 a 0.5 ml de TE al tubo eppendorf hasta que se disuelva la pastilla
de ADN. Tapar el tubo y dejar toda la noche disolver el ADN a TA. Almacenar las
muestras a 4 C.
3.2 Electroforesis en gel de agarosa.
La calidad de ADN se determina mediante una corrida de electroforesis en gel de

agarosa al 1%.
1. Pesar 1 gr de agarosa y aadir Buffer TAE 1X para completar 100 ml.

2. Se funde en un horno de microondas y se aaden 5 ul de BrET
Nota: La adicin del BrEt puede hacerse de diferentes formas.
3. Se deposita en el carro con peine para el gel.
4. Se deja solidificar en una campana de extraccin.
5. Se desmonta y se coloca en la cmara de corrimiento con Buffer TAE 1X
que tape el gel de agarosa.
6. Para cargar la muestra, se coloca 5 ul de ADN y una gota de buffer de
carga sobre un cuadrito de parafilm, se mezclan y se cargan en el gel.
Nota: se puede colocar marcador de peso en el primer carril (1Kb).
7. Se carga el gel de agarosa.
8. Se conecta la fuente de poder y se corre el gel a un voltaje de 70-90 V
segn el tamao de la cmara.
9. Una vez que se separaron los dos colorantes y estos llegaron partes del
gel, se saca el gel de la cmara de corrimiento y se observa en el
transiluminador con la luz UV.
3.3 Estimacin de la concentracin de ADN
a. Diluir 20 l de muestra de ADN en 980 l de agua desionizada y estril

(dilucin 1/50)
b. Medir absorbancia por espectrofotometra a una DO 260 nm usando
celdas de 1 ml de cuarzo.
c. La concentracin de ADN a DO260 = 1.0 en una celda de 1 cm equivale
a 50 g de ADN por ml de agua. Para calcular la concentracin de la
muestra:
Concentracin de ADN [ug/ul] = 50 g / ml x DO260 x 50 (factor de dilucin)
1000
[ADN total] = [ADN] x volumen eludo en ml
3.4 Estimacin de la pureza del ADN
El grado de pureza o ausencia de protenas y otros contaminantes de una

disolucin de ADN puede estimarse calculando el cociente A260/A280.
Cuando este se encuentra entre 1.8-2.0 la muestra contiene casi exclusivamente
ADN.
V. Resultados y Anlisis de Resultados

a) Discute los resultados obtenidos en tu prctica:
Obtencin de ADN
Electroforesis en gel (FOTO GEL con ubicacin de tu carril de corrimiento)
Espectrofotometra (Concentracin y pureza del ADN)
b) Elabore un dibujo de la cmara de electroforesis donde muestras el corrimiento
de tu gel y las caractersticas de la corrida.
CUESTIONARIO
1. Lleve a cabo un diagrama de flujo del procedimiento efectuado y coloca del

lado derecho la funcin de cada solucin utilizada en el proceso de obtencin
de ADN.
VI. Conclusiones
VII. REFERENCIAS
- Perera J, Tormo A y Garca JL. 2002. Ingeniera Gentica (Vol.1): Preparacin,
anlisis, manipulacin y clonaje de ADN. Ed. Sntesis, S.A. Madrid, Espaa.
- Hoisington D, Khairallah M. y Gonzlez de Len D. 1994. Laboratory Protocols
CIMMYT Applied Molecular Genetics Laboratory. Second edition. Mxico,
D.F.:CIMMYT
- www.cuadernosdebiotecnologia.ar Cuaderno No 4
ANEXO 1
Cuestionario (Parte Bitcora)
NOTA: Se entregar con las respuestas correctas en su Reporte
2. Qu aplicacin ambiental tendra el ADN extrado de bacterias del suelo?
3. Qu carga posee el ADN y a que se debe?
4. Para que se usa el buffer de corrimiento TAE?
5. Cuales son las caractersticas del buffer de carga (componentes)?
6. Cmo funciona el Rojo Texas?
7. Existen otros colorantes adems del Rojo Texas para hacer visible el ADN en
el gel de agarosa?
8. Por qu se utilizan celdas de cuarzo y no de plstico para leer ADN en el
espectrofotmetro?
9. Por qu se lee el ADN a una absorbancia de 280 para valorar su pureza?
10. Qu es un marcador de peso molecular?
Prctica 2. Degradacin de contaminantes: cinticas de crecimiento y

degradacin.
Introduccin
Los compuestos fenlicos forman una parte importante de la gran fraccin de
contaminantes que ingresan al medio ambiente da a da. Las aguas residuales
generadas por las industrias qumicas, petroqumicas y del acero contienen con
mucha frecuencia altas concentraciones de compuestos fenlicos [11], los cuales
representan un serio problema ecolgico debido a su uso extenso, a su toxicidad y
a que tambin se generan a travs de los procesos aerobios en el ambiente [21].
Los fenoles son intermediarios en la produccin de algunos otros qumicos, la
produccin global de resinas fenlicas en el ao 2001 fue estimada de 2.9
millones de toneladas. Tambin se desechan en las corrientes acuosas de las
industrias refineras de petrleo, obtencin y conversin de carbn, plantas
qumicas, fundidoras de metal y plantas de papel [2, 17,48].
Los compuestos fenlicos se utilizan para diversos propsitos en muchas reas,
por ejemplo los compuestos fenlicos clorados se utilizan especficamente como
preservativos de la pintura, cuero, mercancas textiles y como agentes
antimicrobianos. Se producen en plantas petroqumicas y procesos de blanquear
corteza durante la produccin de papel [52]. Debido al tratamiento incorrecto de
estos materiales, se han contaminado extensamente el suelo y el agua
subterrnea y su toxicidad afecta seriamente organismos vivos. Estos son agentes
carcingenos y se sospecha como precursores de la dioxina [10].
Los compuestos fenlicos clorados y otros derivados son usados extensamente
como insecticidas, fungicidas y herbicidas por la industria y usos agrcolas
alrededor del mundo. Estos compuestos tienden a incrementar su toxicidad con el
aumento
del
grado
de
cloracin.
Algunos
clorofenoles
tienden
ser
bioacumulables dentro del medio ambiente pudiendo llegar a ser un peligro pblico
[26].
Algunos procesos de refinera producen pequeos volmenes de agua, con altas

concentraciones de fenoles y alquilfenoles, los datos reportados son de 16.3 g/L y
20.1 g/L, donde regularmente el 75% es fenol y el 10% son compuestos alquilossustituidos, como lo son los cresoles, xilenos y etilfenoles [24].
El fenol es un agente potencialmente carcingeno humano y es de considerable

preocupacin para la salud, aun a concentraciones bajas. En Mxico en la NOM127-SSA1-1994 el lmite mximo permisible de fenol es de 0.001 mg/L en agua
potable. Por lo tanto, el tratamiento de las aguas residuales que contienen fenol es
una necesidad.
Se han investigado muchas tecnologas para la remocin y/o desintoxicacin de
los compuestos fenlicos en aguas residuales, esta puede llevarse a cabo
mediante distintos procesos fsicos, qumicos o biolgicos entre los que se
Incluyen, la adsorcin [42], la biodegradacin [35], UV/Fe +3 [52], extraccin por
membrana lquida [32] y oxidacin [5,15,46]. El reto para la biotecnologa es
generar mtodos de bioremediacin con altas eficiencias, relacin costoefectividad y ambientalmente seguros, para reemplazar la tecnologa existente y
promover soluciones para la remediacin de sitios contaminados. Los tratamientos
enzimticos son una tecnologa relativamente nueva en el tratamiento de aguas
residuales y promueven una alternativa ambiental para el sanamiento de efluentes
peligrosos o contaminantes orgnicos xenobioticos [27].
Para tratar compuestos fenlicos, los mtodos biolgicos muestran algunas
ventajas sobre los mtodos fsicos y qumicos, ya que estos son econmicos y no
generan subproductos. Muchos estudios apoyan el tratamiento biolgico de aguas
residuales
del
agua
subterrnea.
Los
microorganismos
usados
son
generalmente aerobios, incluyendo Pseudomonas sp. [13,16, 23], Alcaligenes sp.

[22,47], Azotobacter sp. [31], Rhodococcus sp. [3,40], Phanerochaete sp. [30,41],
y Cryptococcus sp. [37]. Estos cultivos aerobios son ms eficientes en degradar
compuestos txicos debido a que crecen ms rpidamente que los anaerobios y
transforman generalmente los compuestos orgnicos a compuestos inorgnicos

(CO2, H2O).
La diferencia de la estructura y de la toxicidad entre los compuestos fenlicos
requiere que varias bacterias tengan cualidades especficas para degradar cada
compuesto y un cultivo mixto puede ser aplicado. El cultivo mixto significa que
varias clases de microorganismos son cultivados simultneamente. El cultivo mixto
se divide en tipos indefinidos y definidos. Los lodos activados constituyen un
ejemplo de un cultivo mixto indefinido. El lodo activado es un grupo complejo de
microorganismos que pueden oxidar las aguas residuales bajo condiciones
aerobias. Para tratar aguas residuales especiales, incluyendo compuestos muy
txicos y recalcitrantes mediante un lodo activado, la adaptacin es generalmente
necesaria. Si se agregan los microorganismos que pueden degradar estos
materiales, el tiempo de la adaptacin puede ser reducido y las eficiencias se
pueden incrementar. Para hacer esto, un estudio de cultivos puros o cultivos
mixtos definidos es importante.
Las clulas inmovilizadas han sido bien definidas como clulas que son atrapadas,
asociadas a una matriz insoluble. Mattiasson [33] discuti varios mtodos de
inmovilizacin: pares covalentes, adsorcin, atrapamiento en una red de polmero
tridimensional, confinamiento en una emulsin liquido-liquido, y atrapamiento con
una
membrana
semipermeable.
Bajo
algunas
condiciones,
las
clulas
inmovilizadas, tienen ventajas sobre las clulas libres y enzimas inmovilizadas. El

uso de clulas inmovilizadas permite la operacin de bioreactores a flujos que son
independientes de la velocidad de crecimiento de los microorganismos empleados
[39]. La estabilidad cataltica puede ser mas grande por las clulas inmovilizadas
que por las clulas libres, y algunos microorganismos inmovilizados son tolerantes
a las altas concentraciones de compuestos txicos en comparacin con las clulas
libres [19, 29]
La degradacin del fenol por microorganismos puros y consorcios mixtos ha sido
extensamente estudiada. [1,11,14,21,43,44]. La mayora de los cultivos evaluados
son capaces de degradar el fenol en bajas concentraciones.
Un gran nmero de los estudios en la degradacin del fenol se han realizado con
cepas puras de
bacterias, principalmente del gnero de las Pseudomonas.
[1.21.51] Un gran numero de levaduras y hongos filamentosos
tienen una
capacidad que degradar fenol. Entre los tipos de levaduras, la Candida tropicalis
ha sido la ms estudiada. C. tropicalis es una levadura hidrocarbonoclastica capaz
de degradar el fenol, derivados del fenol y compuestos alifticos, en
concentraciones relativamente altas (<3,000 ppm). [11,43] Sin embargo, como en
muchos otros microorganismos, el fenol inhibe el crecimiento de la C. tropicalis y
pueden tambin causar lisis.[43]
Existen tambin algunos estudios llevados a cabo con cultivos mixtos. Morsen y
Rehm [36] estudiaron un cultivo mixto de Psuedomonas putida y Cryptococcus
elinovii para degradar fenol. Oh et al.[38] reportan un cultivo mixto de una bacteria
conocida y un lodo para el tratamiento de aguas residuales. Tambin, Wiesel et al.
[50] usaron 5 tipos de bacterias para tratar hidrocarburos aromticos policclicos.
En estos estudios varias interacciones entre estos microorganismos pudieron ser
analizadas
Arthrobacter chlorophenolicus A6 es un actinobacterium Gram positivo que fue
aislado previamente de una mezcla del suelo enriquecida con el aumento de
concentraciones de 4-clorofenol (4CF) [49]. Esta bacteria puede degradar
concentraciones inusualmente altas de 4-CF hasta 2.7 mM y otros fenoles psubstituidos,
tales
como
4-nitrofenol
4-bromofenol
[49].
Adems,
A.
chlorophenolicus A6 puede degradar 4-CF a bajas temperaturas (5C) y durante

fluctuaciones entre 28C y 5C [6]. La A6 fue marcada previamente con los genes
del marcador que codificaban la protena fluorescente verde (gfp) o luciferasa (luc)
para establecer especficamente su capacidad de sobrevivir en suelo no estril
degradando 4-CP [20]. Las clulas marcadas con luciferasa sobrevivieron bien y
eran metablicamente activas en el suelo contaminado con 4-CP [20,25]. Una
fraccin importante de la poblacin microbiana se mantuvo viable despus de la
incubacin en suelo a 5C [7].
Objetivos.
Observar, describir y analizar la degradacin de fenoles en cultivo en lote con un

consorcio microbiano especializado.
Durante la prctica se podr evaluar la degradacin de un contaminante orgnico
como el fenol.
Se describir y analizar la cintica de crecimiento bacteriano a diferentes
concentraciones de fenol (50, 100, 150 y 200 mg/L).
Metodologa
Inoculo y medio de cultivo.
El consorcio microbiano fue donado de la UAM-I de un proyecto de degradacin de
solventes orgnicos. Como medio de cultivo se utiliz medio mineral basal, con las
siguientes componentes (por litro de agua destilada): NH4SO2, 3g; KH2PO4 0.60 g;
K2HPO4 2.4 g; MgSO4 1.5 g; FeSO4 0.03 g/L. El medio ser inoculado con 10% de
del consorcio microbiano.
La prctica se llevara a cabo en matraces de 200 o 250 mL a los cuales se les
agregaran 100 mL de medio de cultivo estril. Cada equipo preparara una
concentracin diferente de contaminante. Se tomaran muestras diarias durante una
semana para determinar el crecimiento y la degradacin.
Tcnicas analticas
Determinacin de consumo de sustrato. Espectrofotometra UV.
Los compuestos fenlicos seran analizados con una previa filtracin a travs de un
filtro de membrana de celulosa de 0.45 m con el fin de capturar
material
biolgico para que no exista interferencia en las lecturas por espectrofotometra

usando espectrofotmetro UV Beckman DU 650 y UNICO. La absorbancia sera
medida a una longitud de onda de 254 nm.
La biomasa producida se determinara en la regin visible a 650 nm.
Se determinara la concentracin final de CO2 por cromatografa de gases.
Cuestionario.
1. Por que se requiere degradar compuestos fenolicos?

2. Cul es el principio que se utilizara para la determinacin del consumo de
sustrato?
3. Cul es el modelo de crecimiento bacteriano ms conocido?
4. Describa los parmetros de dicho modelo.
Prctica 3. PRODUCCIN DE METANO

I.INTRODUCCIN
Qu son los biocombustibles?
A diferencia de los combustibles fsiles que provienen de la energa almacenada
durante largos perodos en los restos fsiles, los biocombustibles provienen de la
biomasa, o materia orgnica que constituye todos los seres vivos del planeta. La
biomasa es una fuente de energa renovable, pues su produccin es mucho ms
rpida que la formacin de los combustibles fsiles.
Entre los cultivos posibles de utilizar para la elaboracin de biocombustibles, estn
los de alto tenor de carbohidratos (caa de azcar, maz, mandioca), las
oleaginosas (soja, girasol, palmas) y las esencias forestales (eucalipto, pinos).
La siguiente tabla resume los biocombustibles, que se pueden obtener a partir de
la biomasa:
Tipos de combustibles obtenidos de la biomasa

Slidos
Lquidos
Gaseosos
Paja
Alcoholes
Gas
Gasgeno
Lea sin procesar Biohidrocarburos

Astillas
Briquetas
Carbn vegetal
Aceites vegetales
derivados
steres
de
Biogs
Hidrgeno
Aceites de pirolisis
Fuente: http://usuarios.lycos.es/biodieseltr/hobbies4.html
En gran parte del mundo, la lea (o carbn vegetal) que se obtiene a partir de la
madera sigue siendo el principal biocombustible empleado para la cocina, la
calefaccin y la luz. Esta fuente de energa es un recurso renovable si se obtiene a
partir de bosques convenientemente reforestados. Asimismo, muchos vehculos
utilizan biocombustibles a base de metanol y etanol mezclado con gasolina. Se
puede obtener etanol a partir de la caa de azcar, de la remolacha o el maz. En
algunos pases como la India y la China producen biogs a partir de la
fermentacin natural de desechos orgnicos (excrementos de animales y residuos
vegetales).
La obtencin de biocombustibles
Segn la naturaleza de la biomasa y el tipo de combustible deseado, se pueden
utilizar diferentes mtodos para obtener biocombustibles: procesos mecnicos
(astillado, trituracin, compactacin), termoqumicos (combustin, pirolisis y
gasificacin), biotecnolgicos (micro bacterianos o enzimticos) y extractivos. En
la siguiente tabla se presenta una sntesis de estos principales procesos de
transformacin y de los biocombustibles derivados, as como las aplicaciones ms
frecuentes en cada uno de ellos. Cada uno de estos procesos se inicia con la
biomasa vegetal que se forma a partir del proceso de fotosntesis, con el aporte de
la energa solar que captan y transforman estos organismos.
Proceso de obtencin de biocombustibles

Mecnicos
Termoqumicos
Astillado
Pirolisis
Biotecnolgicos
Extractivos
Gasificacin Fermentaci Digestin

n
anaerobia
Tcnicas
Trituracin
Extraccin
fsicoqumica
Compactaci
n
Productos
Leas
Carbn
Astillas
Aceites
Gas de
gasgeno
Briquetas
Biogs
Aceites
Varios
Co2, CH4
steres
Hidrocarburo
s
Aserrn
Aplicacion Calefaccin
es
Electricidad
Etanol
Calefaccin
Electricidad
Transporte
Industria
qumica
Calefaccin Transporte Calefacci Transporte

n
Electricidad Industria
Industria
qumica Electricida
qumica
Transporte
d
Industria
qumica
Fuente: http://usuarios.lycos.es/biodieseltr/hobbies4.html
Cada tcnica depende del tipo de biomasa disponible. Si se trata de un material
seco puede convertirse en calor directo mediante combustin, el cual producir
vapor para generar energa elctrica. Si contiene agua, se puede realizar la
digestin anaerbica que lo convertir en metano y otros gases, o fermentar para
producir alcohol, o convertir en hidrocarburo por reduccin qumica. Si se aplican

mtodos termoqumicos es posible extraer metanol, aceites, gases, etc. El mtodo
de la digestin por el cual se obtiene biogs es el ms empleado.
El Biogs
Casi tres mil millones de personas en el mundo emplean todava la lea como
fuente de energa para calentar agua y cocinar, lo que provoca, entre otros
efectos, la prdida de millones de hectreas de bosques tropicales y zonas
arboladas.
En respuesta a esta situacin surgen otras alternativas para obtener energa, entre
ellas, la produccin de biogs a partir de la fermentacin de la materia orgnica.
Para la obtencin de biogs se puede utilizar como materia prima la excreta
animal, la cachaza de la caa de azcar, los residuales de mataderos, destileras y
fbricas de levadura, la pulpa y la cscara del caf, as como la materia seca
vegetal.
Esta tcnica permite resolver parcialmente la demanda de energa en zonas

rurales, reduce la deforestacin debida a la tala de rboles para lea, permite
reciclar los desechos de la actividad agropecuaria y, es un recurso energtico
limpio y renovable.
El biogs que se desprende de los tanques o digestores es rico en metano que
puede ser empleado para generar energa elctrica o mecnica mediante su
combustin, sea en plantas industriales o para uso domstico.
Digestor domstico
Digestor industrial
Las fotografas muestran digestores de uso domstico y otros industriales para la
obtencin de biogs. La primera instalacin domstica para producir biogs se
habra construido en la India alrededor del 1900. Actualmente funcionaran en ese
pas alrededor de 200 mil biodigestores, y en China alrededor de 6 millones. Las

instalaciones industriales de produccin de biogs emplean tanques de metal que
sirven para almacenar la materia orgnica y el biogs por separado. Debido al
gran volumen de materia orgnica que necesita para garantizar la produccin de
biogs y la cantidad de biofertilizante que se obtiene, se disea con grandes
estanques de recoleccin y almacenamiento construidos de ladrillo u hormign.
Fuente: http://www.cubasolar.cu/biblioteca/energia/Energia22/HTML/articulo04.htm
El biogs se obtiene al descomponerse la materia orgnica debido a la accin de

cuatro tipos de bacterias, en ausencia de oxgeno:
a. las hidrolticas, que producen cido actico, compuestos monocarbonados,
cidos grasos orgnicos y otros compuestos policarbonados;
b. las acetognicas, productoras de hidrgeno;
c. las homoacetognicas, que pueden convertir una cantidad considerable de
compuestos carbonados en cido actico;
d. las metanognicas, productoras del gas metano, principal componente del
biogs, con una proporcin de 40 a 70 % de metano (CH4).
Algunas ventajas del empleo de biogs:
1. Permite disminuir la tala de los bosques al no ser necesario el uso de la lea
para cocinar.
2. Presenta diversidad de usos: alumbrado, coccin de alimentos, produccin de
energa elctrica, transporte automotor y otros.
3. Produce biofertilizante rico en nitrgeno, fsforo y potasio, capaz de competir
con los fertilizantes qumicos, que son ms caros y daan el medio ambiente.
4. Elimina los desechos orgnicos, por ejemplo, la excreta animal, contaminante
del medio ambiente y fuente de enfermedades para el hombre y los animales.
Materiales y Mtodo: Produccin de biogs.
Actividad adaptada de El Libro de la Naturaleza y la tecnologa 8, EGB. Editorial
Estrada (1998), y Biologa II. Polimodal. Ecologa y Evolucin. Editorial Estrada
(2001) visto en cuadernos de biotecnologa No 58
(http://www.porquebiotecnologia.com.ar/educacion/cuaderno/ec_58.asp?cuaderno
=58)
El biogs es un gas producido por la accin de microorganismos sobre materia

orgnica de desecho, por ejemplo restos vegetales (cscaras de frutas, hojarasca,
etc.) o estircol (excremento de animales). Durante este proceso de
transformacin de la materia los microorganismos obtienen energa mediante
diferentes procesos. Algunos de los microorganismos liberan dixido de carbono
en el proceso de respiracin, que otros microorganismos emplean en la
fermentacin y producen metano que liberan al entorno.
El metano producido por este mtodo es una fuente de energa alternativa,

denominada bioenerga, que puede reemplazar a las fuentes tradicionales de
energa.
Propsito de la actividad
La experiencia consiste en la construccin de un digestor de materia orgnica,
donde se podr comprobar la produccin de biogs por la accin de los
microorganismos anaerobios (bacterias metangenas), que estn presentes en los
desechos orgnicos. Mediante esta experiencia es posible demostrar la accin de
un tipo de microorganismos que se incluye en el grupo de los extremfilos: las
bacterias metangenas que viven en ausencia de oxgeno.
Construccin del digestor de materia orgnica
1. Materiales
botella plstica de dos litros de capacidad, con tapa

manguera de goma
pinza o llave para cerrar la manguera
tapn agujereado por donde atravesar la manguera de goma o un tubo de vidrio
al que se unir la manguera de goma
mechero
caja de cartn, de madera
lmpara de 60-75 watt que proveer de calor al sistema
estircol de caballo, de vaca o de aves y restos vegetales
agua hervida (sin cloro)
agua de cal (se utiliza para comprobar la presencia de dixido de carbono).
2. Armado del digestor
colocar los restos orgnicos dentro de la botella hasta la mitad de su capacidad;

llenar la botella con agua hasta cubrir la materia orgnica (y un poco ms);
cerrar la botella con el tapn que ya tiene atravesada la manguera o el tubo de
vidrio;
adems de poner el tapn se puede sellar la botella con una resina o con la
misma tapa a rosca de la botella (que debe estar perforada para que entre el
tapn) para evitar la fuga de gas o que el tapn se libere (ya que puede ser
despedido por la presin que ejerce el gas que se acumula en la botella);
unir la manguera al mechero y cerrarla con la pinza;
colocar la botella dentro de la caja junto con la lmpara que debe permanecer
encendida todo el tiempo para mantener la temperatura a 40 oC
aproximadamente.
3. Desarrollo
Al cabo de 7 - 10 das, aproximadamente, el lquido de la botella tendr

burbujas. al tocar la manguera que la cierra, es posible comprobar que la
presin es diferente a ambos lados de la llave.
Colocar el extremo de la manguera dentro de un recipiente con agua de cal.
Abrir la manguera para dejar salir el gas acumulado en la botella. Si el agua se
pone turbia indica que la manguera despidi dixido de carbono que se produjo
en la botella. Estrangular la botella para sacar la mayor cantidad posible de
dixido de carbono.
Volver a cerrar la llave de la manguera.
A partir de este momento, habiendo poco oxgeno en la botella (consumido en
una primera etapa por la respiracin de algunos microbios) se intensifica la
produccin de gas metano por otro tipo de bacterias que no necesitan oxgeno.
La produccin de biogs (metano) lleva varios das y, a medida que se produce,
la botella estrangulada se hincha.
Para comprobar la produccin de biogs abrir la llave de la manguera y prender

el mechero.
Aclaracin: hay que tener en cuenta que se trabaja con microorganismos que,
como otros seres vivos, necesitan condiciones adecuadas para cumplir con sus
actividades. Puede ocurrir que haya fluctuaciones en las condiciones de la
experiencia y que la produccin de biogs sea escasa. En ese caso, se debe
probar nuevamente hasta que se encuentren las condiciones adecuadas.
Preguntas para el anlisis de la experiencia
a) Cul es el significado del trmino bioenerga?
b) Cmo se denomina al tipo de bacteria responsable de la produccin de
metano? Respuesta: metangenas. Esta pregunta se relaciona con la nota
analizada en la pregunta anterior.
c) Por qu ser necesaria una temperatura de 40oC para lograr la produccin
de biogs?
d) Se obtendran los mismos resultados si se realizara esta experiencia a
0C o a 100C? Por qu?
e) A qu se debe la aparicin de burbujas en el lquido y la presin que se
siente en la manguera a los 7-10 das de la experiencia?
f) Por qu se debe eliminar del digestor el dixido de carbono que se genera
en la primera etapa?
g) Cul es la ventaja de la utilizacin del biogs como fuente de energa?
PRACTICA 5. PRODUCCIN DE ETANOL A PARTIR DE COMPUESTOS

LIGNOCELULSICOS.
OBJETIVOS
General:
Se evaluar la capacidad de la levadura Saccharomyces cerevisiae de
producir etanol a partir de diferentes compuestos.
Especficos:
Preparar diferentes medios de cultivo variando la fuente de carbono para el
crecimiento de la levadura S. cerevisiae en un sistema de lote.
Monitorear la cintica de crecimiento de la levadura S. cerevisiae y la
produccin de etanol en los diferentes medios preparados.
Comparar los rendimientos obtenidos en cada ensayo
INTRODUCCIN
La creciente demanda energtica por parte de la poblacin mundial ha alcanzado
niveles que no pueden ser mantenidos con las actuales reservas de combustibles
fsiles. De acuerdo al informe
de Fatih Birol, economista jefe de la Agencia
Internacional de la Energa (AIE), durante el World Energy Outlook 2007 (WEO

2007), [] La demanda energtica mundial se incrementar en un 55%, con los
combustibles fsiles cubriendo el 84% de dicho aumento [...], lo cual [...] se
traducir para el 2030 en un aumento del 57% de las emisiones de CO2.
Ante
esto, la bsqueda de fuentes alternativas de energa ambientalmente sostenibles y

econmicamente
rentables
ha
pasado
ser
el
eje
central
de
diversas
investigaciones. La CONAE ha realizado estudios en los cuales describe la

situacin actual de las diversas fuentes de energa alternas, que se resumen en la
tabla 1.1:
Tabla 1.1. Fuentes alternas de Energa (CONAE, 2005)
Por su impacto mundial la CONAE ubica a las energas elica, de biomasa y

geotrmica como las ms prometedoras. De estas, la energa proveniente de
biomasa tiene como principal inconveniente su alto costo.
Los autotransportes cubren gran parte del consumo de energticos derivados del
petrleo. Los alcoholes han sido utilizados como combustibles a partir de la crisis
del petrleo en los 70s, por lo que diversos pases implementaron programas
para el desarrollo de nuevos combustibles a partir de materias primas econmicas,
accesibles y renovables. As, desde 1980 el etanol es usado como un combustible
alterno en diferentes pases. Existen tres mtodos principales para la produccin
de etanol (Morrison & Boyd, 1983). Estos son: (a) hidratacin de alcanos
provenientes del cracking del petrleo; (b) hidrlisis quimica de compuestos
celulsicos ya sea en medios cidos o bsicos; y (c) Fermentacin de
carbohidratos. Estos mtodos pueden clasificarse en sintticos /qumicos (a, b) y
biolgicos (b, c), siendo este ltimo grupo el que reporta menor impacto ambiental.
De esta forma, al etanol producido por estas vas se le conoce como bioetanol.
La transformacin de azucares a etanol mediada por microorganismos ha

sido ampliamente estudiada, se lleva a cabo principalmente por levaduras y
bacterias acido-lcticas. Microorganismos como Saccharomyces cerevisiae,
Zymomonas mobilis y Escherichia coli han sido utilizados como modelos para
estos anlisis, siendo la primera la levadura mas usada. El siguiente esquema
muestra de forma general la asimilacin de azucares y su transformacin a etanol
(fermentacin alcohlica):
Figura 1.1 Mapa metablico general para la produccin de etanol. (a)

Ciclo de las pentosas fosfato; (b) Glucolisis; (c) Ciclo Entner-Doudoroff
(Zaldivar, 2001)
Como se aprecia en el esquema, la fermentacin de azucares simples es proceso
relativamente sencillo, siendo glucosa, xilosa, manosa, arabinosa y galactosa los
azucares asimilados ms fcilmente por las clulas. Las levaduras poseen una
maquinaria metablica capaz de asimilar azucares complejos como dmeros
(galactosa, sacarosa) o polmeros (celulosa, celobiosa, almidn), mediante la
sntesis de enzimas llamadas celulasas.
Dentro de las diversas formas de biomasa, la biomasa lignocelulosica es

considerada una excelente fuente de energa (y de carbono) debido a su gran
disponibilidad y bajo costo. En Mxico, la industria azucarera genera alrededor de
6.5 km de toneladas mtricas de bagazo de caa, compuesto lignocelulsico
considerado subproducto del proceso y utilizado comnmente como combustible
en los ingenios azucareros. Comparando el rendimiento energtico del bagazo de
caa contra el de etanol producido a partir del mismo as como el impacto
ambiental originado por la combustin de estos compuestos, el etanol resulta ms
conveniente.
En una fermentacin alcohlica, es posible obtener tericamente 51.4 g de
etanol a partir de 100 g de glucosa1 (Demirba, 2005), algunos estudios reportan
rendimientos porcentuales en base al terico desde 10.6% (Tantirungkij et al.,
1993) hasta 102% (Ohta et al.,1991). Sin embargo, han sido pocos los estudios
realizados utilizando fuentes de carbono complejas y organismos diferentes a S.
cerevisiae, Z. mobilis o E. coli.
La produccin de etanol se da bajo condiciones de anaerobiosis dentro de
un cultivo, aunque se ha comprobado la produccin del alcohol en condiciones
aerobias muy especificas.
MATERIALES Y METODOS
Se conseguir una cepa de S. cerevisiae comercial o de resiembra. Esta ser
activada en medio complejo PDA. Se prepararn 100 mL de medio PDA y se
vaciaran las cajas (5). Sembrar la levadura por tcnica de estra cruzada, a fin de
obtener colonias aisladas y asegurar la axena de los experimentos. Incubar a
30C hasta el inicio de las fermentaciones.
Para la produccin de etanol, se probaran diferentes sustratos. Como base, se
usar glucosa, que servir como referencia, y bagazo de caa. Se podrn elegir
disacridos y polisacridos dependiendo de la disponibilidad de los mismos:
1
Cuando se trata de compuestos lignocelululsicos, se consideran los equivalentes de glucosa de acuerdo al

nmero de monmeros contenidos en el polmero.
xilosa, lactosa, sacarosa, etc. La composicin del medio de cultivo en g/L es: 20
fuente de carbono, 2 (NH4)2SO4, 0.4 MgSO4 7H2O, 5 KH2PO4, 1 extracto de
levadura.
La produccin ser por duplicado para cada fuente de carbono en matraces de
500 mL, cada uno con 250 mL de medio. Esterilizar en autoclave a 121C por 15
min. En condiciones estriles, inocular los matraces con al menos 3 colonias de la
levadura previamente reactivada e incubar a 30C y 150 rpm durante una semana.
Diariamente tomar al menos 3 muestras para evaluar el estado del cultivo.
Se determinar el crecimiento celular por absorbancia a 620 nm, usando como
blanco agua. El etanol producido ser cuantificado por tcnica de microdifusin..
El ensayo se realizara en dos tubos colocados uno dentro del otro. En el
compartimiento exterior (tubo ancho) se colocar 0.5 ml de solucin saturada de
carbonato de potasio que causar que el alcohol sea menos soluble en la solucin
acuosa. Por otro lado se prepara el compartimiento interior (tubo angosto) que
contendr 1.0 ml de solucin de dicromato de potasio 0.145 % en cido sulfrico
10 N y se coloca dentro del tubo ancho con la ayuda de una pinza; en presencia
de esta solucin el etanol es oxidado a cido actico y el Cromo pasa a Cr3+
cambiando su color de amarillo anaranjado a transparente. Una vez preparado el
dispositivo se agrega al compartimiento exterior 0.1 ml de solucin standard o
muestra y se tapa con un tapn de goma. Se incuba 60 min a 45C, se saca el
tubo angosto y se le agrega 0.5 ml de agua destilada y se mide la absorbancia a
450 nm.
Reportar el rendimiento de produccin de etanol para cada una de las fuentes de
carbono y elaborar un anlisis de resultados detallado, en el que se comparen los
resultados obtenidos y las conclusiones respectivas.
CUESTIONARIO
1. Cul es la importancia de obtener etanol a partir de compuestos
lignocelulsicos?
2. En qu consiste la tcnica de microdifusion de Conway?

3. Describa el proceso de fermentacin alcohlica y mencione por que no se
requiere oxigeno para este ensayo.
4. Qu desventaja tiene la produccin de alcoholes a partir de biomasa
lignocelulosica? Cmo se puede resolver este problema?
5. Investigue los rendimientos reportados en la produccin de etanol a partir de
distintos sustratos como los usados en esta prctica.
REFERENCIAS
-
Gong, C.; Chen, L; Flickinger, M; et al. 1981. Production of Ethanol from

D-Xylose by Using D-Xylose Isomerase and Yeasts. Applied and
Environmental Microbiology. 14 (2): 430-436.
Alterthumb, F and Ingram, L. 1989. Efficient Ethanol Production from
Glucose, Lactose, and Xylose by Recombinant Escherichia coli.
Applied and Environmental Microbiology. 55 (8): 1943-1948.
Himmel, M. and Sheehan, J. 1999. Improved Cellulases for Bioethanol
Production. Biotechnology Center for Fuels and Chemicals.
P. Escalante-Minakata 1 , H.P. Blaschek 2 , A.P. Barba de la Rosa 1 , L.
Santos 1 and A. De Len-Rodrguez 1. Identification of yeast and bacteria
involved in the mezcal fermentation of Agave salmiana. Letters in
Applied Microbiology. Volume 46 Issue, Pages 626 - 630
Ostergaard, S., Olsson, L., Nielsen, J. Metabolic engineering of
Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. MolBiol. Rev. 64 (2000) 34-50.
Walker, G.M. Yeast Physiology and Biotechnology. John Wiley and Sons,
Chichester, 1997.
Demirba, A. 2005. Bioethanol from Cellulosic Materials: A Renewable
Motor Fuel from Biomass. Energy Sources, 21:327-337.
Zaldivar, J.; Nielssen, J.; and Olsson, L. 2001. Fuel ethanol production
from lignocellulose: a challenge for metabolic engineering and
process integration. Appl Microbiol Biotechnol. 56:1734.
Sun, Y.; Cheng, J. 2002. Hydrolysis of lignocellulosic materials for
ethanol production: a review. Bioresource Technology. 83 : 111.
Prctica 6. DETERMINACIN DEL KLA POR EL MTODO DEL SULFITO
OBJETIVO GENERAL: Conocer y entender los principios bsicos del coeficiente

de transferencia de oxgeno (Kla) en los cultivos aerobios en suspensin.
OBJETIVOS ESPECFICOS:
Analizar el mtodo para determinacin del Kla por el mtodo del sulfito.
Analizar y discutir los mtodos indirectos y directos que se utilizan en la
determinacin del Kla.
Estimar el Kla por el mtodo del sulfito.
I. INTRODUCCIN
La concentracin de oxgeno disuelto en una suspensin de microorganismos

aerbicos depende de diferentes factores:
Velocidad de transferencia de oxgeno de la fase gaseosa al

lquido.
Velocidad a la cual el oxgeno es transportado a las clulas (donde
este es consumido).
La concentracin de oxgeno utilizado por los microorganismos
para el crecimiento, mantenimiento y produccin.
Los biorreactores de tanque agitado y las columnas burbujeadas son los
biorreactores ms utilizados en bioprocesos.
Los biorreactores agitados mecnicamente presentan altos

valores de transferencia de masa y energa, as como excelente
mezclado.
Velocidad de agitacin
Tipo y nmero de agitadores
Flujo de gas
Las columnas burbujeadas y airlift presentan bajos esfuerzos de
corte lo cual es importante para aqullos cultivos sensibles a los
esfuerzos de corte (clulas filamentosas).
La transferencia de materia gas-lquido en un bioproceso est fuertemente
influenciada por las condiciones hidrodinmicas del biorreactor que principalmente
dependen de la disipacin de la energa:
Condiciones de operacin
Propiedades fisicoqumicas del cultivo
Parmetros geomtricos del biorreactor
Presencia de oxgeno consumido por las clulas
La transferencia de oxgeno frecuentemente es el paso limitante en los

bioprocesos aerbicos debido a su baja solubilidad en el medio de cultivo.
Las correctas mediciones y/o predicciones del coeficiente volumtrico de

transferencia de masa (kla) es un paso crucial en el diseo, operacin y
escalamiento de biorreactores.
La concentracin de saturacin de oxgeno se sita en las condiciones normales

de cultivo alrededor de 10 mg/L, concentracin de todo insuficiente para abastecer
un proceso aerobio.
La ecuacin bsica para describir el transporte entre fases considera que la

densidad de flujo de propiedad (en este caso transporte de oxgeno) es
proporcional al gradiente de concentraciones quedando definido un coeficiente
individual de transferencia de materia entre fases kL segn:
NO2=KL (CL-Ci)
NO2=Densidad de flujo de oxgeno entre fases, moles/s m2.

CL=Concentracin de oxgeno en la fase lquida.
Ci=Concentracin de oxgeno en la interfase.
Si se utiliza el coeficiente global KL y se expresa la velocidad de transferencia de

oxgeno por unidad de volumen de reactor NO2 la ecuacin se transforma en:
NO2=kLa (CL-C*)
C*= Concentracin de oxgeno en la fase lquida correspondiente a la saturacin.

a= Relacin rea interfacial/Vlumen de reactor (m2 de interfase/m3 reactor)
En cuanto al consumo del oxgeno por parte de la biomasa se define la velocidad

especfica de consumo de oxgeno QO2, como el oxgeno consumido por unidad
de biomasa y de tiempo.
En un cultivo en estado estacionario han de igualarse las velocidades de consumo

y transferencia, por tanto:
NO2=QO2 .X
X=Concentracin celular
La velocidad de consumo puede expresarse en funcin de la velocidad especfica

de crecimiento: Mx y del rendimiento biomasa/oxgeno, Y X/O de forma que:
Kla (CL-C*)=Mx . X/Yx/o
Esta ecuacin relaciona la capacidad de transferencia del reactor (Kla) con las
velocidades especficas de crecimiento que se pueden alcanzar en su interior.
La determinacin del coeficiente ser pues esencial para establecer la eficiencia
de aireacin y cuantificar los efectos que las variables de operacin tienen sobre el
transporte de oxgeno.
MTODOS INDIRECTOS PARA LA DETERMINACIN DEL KLA
La determinacin del coeficiente en las condiciones reales de operacin del

biorreactor, que contiene el medio de cultivo, la poblacin celular etc., implica una
serie de requerimientos experimentales (preparacin de medios, inoculacin,
prevencin de la contaminacin, control del proceso a nivel celular etc) que
pueden obviarse si se trabaja con un sistema sinttico libre de clulas, que

reproduzca lo ms fielmente posible el sistema real.
El objetivo del mtodo indirecto es encontrar el valor del coeficiente de

transferencia y su dependencia de las condiciones hidrodinmicas en el
biorreactor, utilizando un sistema que tenga las mismas propiedades
reolgicas que el sistema real, las mismas tendencias en la formacin de
interfases y los mismos valores para la difusividad y solubilidad del oxgeno.
La fiabilidad del valor del coeficiente depender de en qu medida se haya
conseguido esta similitud. Estos mtodos utilizan la ecuacin del balance
sin el trmino del consumo.
dC/dt=Kla (C*-C)
As se puede establecer la capacidad de un biorreactor para la absorcin de

oxgeno, haciendo burbujear aire a travs de una solucin a la que previamente se
le ha eliminado el oxgeno por desplazamiento de nitrgeno como se esquematiza
en la siguiente figura.
MTODO DE SULFITO PARA LA DETERMINACIN DE KLA
Este mtodo est basado sobre la reaccin del sulfito de sodio, un agente
reductor, con el oxgeno disuelto para producir sulfato en la presencia de un
catalizador (usualmente un catin divalente de Cu++op Co++, la ecuacin puede
ser expresada de la siguiente manera:
II. MATERIAL Y REACTIVOS
Soluciones:
1. Solucin de Na2SO3 0.03 M Considerando una pureza del 98.3%, adicionar
3.78 g de Na2SO3 a un litro de agua destilada.
2. Solucin de catalizador, CoSO4 La concentracin final de catalizador tiene que

ser de 2.5 x 10-4 mol Co++/L. Para esto se debe preparar una solucin stock de
CoSO4. Adicionar 0.736 g CoSO4 en 100 mL. Adicionar 5 mL de la solucin stock
a 1 L de reactor. Esta solucin se puede guardar.
3. Solucin de yodo (preparar justo antes de realizar la determinacin de sulfito)

En 50 mL de agua destilada adicionar 0.9 g de KIO3, 0.5 g de KI y 1.5 mL de
H2SO4. Agitar vigorosamente y dejar sedimentar. Evitar tomar residuos de las
sales formadas.
4. Solucin de Na2S2O3-5H2O 0.02 M En 500 mL de agua destilada disolver 2.48

g de Na2S2O3-5H2O (4.96 g/L). 5. Solucin de almidn 1% Adicionar 1 g de
almidn de papa a 100 mL de agua destilada, hervir por 2 minutos y dejar enfriar.
Preparar justo antes de realizar la determinacin de sulfito.
EQUIPO
- Agitadora orbital
- Bureta
- Soporte Universal
III. METODOLOGIA
1. Una vez que los matraces contengan la solucin de sulfito (50 y 100 mL segn
corresponda en cada uno), se inicia la agitacin/aireacin a 100 rpm y a 200 rpm.
Se permite la saturacin. Detener la agitacin/aireacin, y tomar una muestra de 1
ml.
2. Mezclar la muestra inmediatamente con 0.2 mL de solucin de yodo. La
reaccin de oxidacin de sulfito se detiene.
3. Titular la muestra con la solucin de tiosulfato de sodio hasta que el lquido se
torne amarillo claro. Aadir 1 mL de una solucin de almidn (la solucin se
tornar azul oscuro). Continuar la titulacin hasta que la solucin quede incolora.
4. Registrar los mililitros de tiosulfato utilizados y hacer los clculos
correspondientes para determinar la concentracin de sulfito remanente.
IV. RESULTADOS Y ANALISIS DE RESULTADOS
Discuta los resultados obtenidos:
Obtencin del kla por el mtodo del sulfito.

Estime el kla por este mtodo
Dibuje el diagrama para obtencin del kla por este mtodo
Explique el fundamento de la tcnica
V. REFERENCIAS
Cooper C.M., Fermstrom G.A., Millar S.A. 1944. Performance of agitated gas-liquid
contactors. Industrial and Engineering Chemistry. 36:504-509.
Kensy F., Zimmermann H.F., Knabben I., Anderlei T., Trauthwein H., Dingerdissen
U., Bchs Jochen. 2005. Oxygen transfer phenomena in 48-well microtiter plates:
determination by optical monitoring of sulfite oxidation and verification by real-time
measurement during microbial growth. Biotechnology and Bioengineering. 89: 698708.
Zhao S, Kuttuva SG, Ju LK. 1999. Oxygen transfer characteristics of multiplephase dispersions simulating water-in-oil xanthan fermentations. Bioprocess
Engineering. 20: 313-323.

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1er Revisin

Dra. Ins Garca

NORMAS GENERALES DE TRABAJO EN EL LABORATORIO

laboratorio nos proporciona agua desionizada y miliQ misma que ser

10% diagrama flujo metodologa y cuestionario

Se entregar en la libreta u hojas sueltas consta:

4. Se requiere de un mnimo de 80% de asistencia a las sesiones prcticas

Manual de Prcticas Biotecnologa Ambiental |2011

Prctica 4. Determinacin de DQO

Manual de Prcticas Biotecnologa Ambiental |2011

Prctica 1. EXTRACCIN Y ANLISIS ADN genmico de suelo

mediante una electroforesis en gel de agarosa as como la estimacin de la

III. Material y reactivos

Manual de Prcticas Biotecnologa Ambiental |2011

- Solucin de lavado 1: 76% EtOH, 0.2 M NaOAc

4. Incubar 60-90 min a 65 C con agitaciones continuas.

Manual de Prcticas Biotecnologa Ambiental |2011

7. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo de 15 ml. Adicionar 4.5 ml de

Extraccin con Fenol para obtener ADN de alta pureza

12. Colocar el ADN en un microtubo eppendorf de 2 ml que contenga previamente

Precipitacin con Etanol

18. Aadir 2 ml solucin de lavado 1. Dejar la pastilla 10-20 min agitando

20. Adicionar la solucin de lavado 2 y enjuagar la pastilla de ADN. Centrifugar

La calidad de ADN se determina mediante una corrida de electroforesis en gel de

1. Pesar 1 gr de agarosa y aadir Buffer TAE 1X para completar 100 ml.

3.3 Estimacin de la concentracin de ADN

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a. Diluir 20 l de muestra de ADN en 980 l de agua desionizada y estril

[ADN total] = [ADN] x volumen eludo en ml

3.4 Estimacin de la pureza del ADN

El grado de pureza o ausencia de protenas y otros contaminantes de una

V. Resultados y Anlisis de Resultados

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1. Lleve a cabo un diagrama de flujo del procedimiento efectuado y coloca del

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Prctica 2. Degradacin de contaminantes: cinticas de crecimiento y

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Algunos procesos de refinera producen pequeos volmenes de agua, con altas

El fenol es un agente potencialmente carcingeno humano y es de considerable

generalmente aerobios, incluyendo Pseudomonas sp. [13,16, 23], Alcaligenes sp.

transforman generalmente los compuestos orgnicos a compuestos inorgnicos

inmovilizadas, tienen ventajas sobre las clulas libres y enzimas inmovilizadas. El

bacterias, principalmente del gnero de las Pseudomonas.

[1.21.51] Un gran numero de levaduras y hongos filamentosos

chlorophenolicus A6 puede degradar 4-CF a bajas temperaturas (5C) y durante

Observar, describir y analizar la degradacin de fenoles en cultivo en lote con un

biolgico para que no exista interferencia en las lecturas por espectrofotometra

1. Por que se requiere degradar compuestos fenolicos?

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Prctica 3. PRODUCCIN DE METANO

Tipos de combustibles obtenidos de la biomasa

Lea sin procesar Biohidrocarburos

Proceso de obtencin de biocombustibles

Gasificacin Fermentaci Digestin

Calefaccin Transporte Calefacci Transporte

producir alcohol, o convertir en hidrocarburo por reduccin qumica. Si se aplican

Esta tcnica permite resolver parcialmente la demanda de energa en zonas

pas alrededor de 200 mil biodigestores, y en China alrededor de 6 millones. Las

El biogs se obtiene al descomponerse la materia orgnica debido a la accin de

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El biogs es un gas producido por la accin de microorganismos sobre materia

El metano producido por este mtodo es una fuente de energa alternativa,

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