Criao e produo de animais transgnicos e nocautes

Eliana Saul Furquim Werneck Abdelhay

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ANDRADE, A., PINTO, SC., and OLIVEIRA, RS., orgs. Animais de Laboratrio: criao e experimentao
[online]. Rio de Janeiro: Editora FIOCRUZ, 2002. 388 p. ISBN: 85-7541-015-6. Available from SciELO Books
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Criao e produo de animais transgnicos e nocautes

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C riao
e Produo de Animais Transgnicos
e Nocautes

Eliana Saul Furquim Werneck Abdelhay

INTRODUO
Animais transgnicos so aqueles cujo genoma foi modificado pela introduo de seqncias de DNA de
outro organismo. Muitas vezes tais seqncias so manipuladas por engenharia gentica de tal forma que
constituem uma mistura de pedaos de DNA vindo de diversas origens.
No caso de animais nocautes, a modificao gentica introduzida capaz de interromper ou anular um
gene que, ento, no mais se expressa, sendo denominado de nocauteado.
A idia de se introduzir material gentico em um embrio data da dcada de 70 do sculo XX quando a
tecnologia de DNA recombinante se tornou uma realidade. As primeiras tentativas se valeram da infeco por
vrus que carreavam em seu interior pedaos de DNA exgenos, mas logo as tcnicas de microinjeo
revolucionaram a capacidade de se introduzir um gene clonado no interior do ncleo do embrio.
Hoje em dia algumas metodologias so utilizadas na produo de um camundongo transgnico, como:

MICROINJEO

NO

PR-NUCLEO MASCULINO

A microinjeo no pr-nucleo consiste na introduo de uma soluo de DNA diretamente no prnucleo de um ocito recm-fecundado. Em cerca de 30% dos ocitos assim manipulados, o DNA exgeno vai
se integrar no genoma e embries transgnicos sero produzidos.
OBS.: animal nocaute um animal que nulo para um determinado gene, ou seja, esse gene teve seus
alelos modificados geneticamente de modo a no mais produzirem uma protena ativa.
Figura 1 Esquema de microinjeo pr-nuclear

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ANIMAIS DE LABORATRIO
A) Introduo da agulha de microinjeo no pr-ncleo masculino do ovo fertilizado.
B) Aps a injeo, verifica-se o aumento do pr-ncleo. Em ambos os casos o ovo est mantido em
posio por uma pipeta de sustentao (Hogan et al., 1994).

TRANSGNESE MEDIADA POR CLULAS ES

Uma maneira diferente de se introduzir genes exgenos em uma linhagem de camundongo pela
transformao inicial de clulas-tronco embrionrias e posterior introduo dessas clulas no embrio em fase
de mrula ou blastocisto. As clulas totipotentes utilizadas nesses experimentos so as clulas ES (Embryonic
Stem Cell). Clulas ES so clulas obtidas da massa interna de um blastocisto e que so mantidas em sua forma
indiferenciada, podendo gerar toda e qualquer clula do organismo. Em geral o transgene contm, alm do
DNA a ser estudado, um gene de resistncia a drogas (neomicina) e um gene-reprter como o gene Lac Z de
Escherichia coli ou GFP. Esse transgene transferido para as clulas ES por eletroporao e 1% destas tero de
uma a vrias cpias do DNA exgeno integrado. Aps a eletroporao, aquelas que contm o transgene sero
selecionadas pela presena do antibitico no meio de cultura. As clulas transformadas sero ento injetadas
para a formao de um embrio quimrico, isto , formado por clulas ES transformadas e clulas do embrio
recipiente.
Essa tcnica a nica que pode ser utilizada para fazer o nocaute de um gene, uma vez que a troca do gene
normal pelo DNA exgeno que ir anular o gene ocorre por recombinao homloga e esse fenmeno acontece
em maior freqncia nas clulas ES.
Figura 2 Modificao gentica introduzida em um lcus

Fonte: modificado de Stephane Viville em Houdebine (1997).

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Criao e produo de animais transgnicos e nocautes

A) Modificao por troca do DNA no lcus.

B) Modificao do lcus pela insero de um fragmento de DNA.

INFECO POR RETROVRUS

Neste caso, o DNA exgeno deve ser inserido num vetor retroviral que ser, ento, injetado diretamente
no ocito fertilizado.
Figura 3 Construo retroviral para transferncia de um transgene
SEQNCIAS VIRAIS

Outras metodologias tm sido tentadas alternativamente, mas com menor eficincia.

Em todos os casos o primeiro passo dessa tecnologia consiste na obteno de ocitos fertilizados ou
embries no incio do desenvolvimento. Tendo em vista que cada fmea de camundongo produz, por ciclo,
cerca de 8 a 12 ovos que sero liberados naturalmente, torna-se necessrio encontrar maneiras de se aumentar
o nmero de ovos obtidos. Isso possvel estimulando as fmeas com um regime hormonal; este consiste na
injeo de 5UI de PMS (pregnant mare serum) e 46 horas aps 5UI de HCG (human chorionic gonadotrophin).
O acasalamento das fmeas logo aps a ltima injeo pode levar obteno de 30 a 60 ovos de cada fmea
dependendo da linhagem utilizada. Desses ovos, aqueles que estiverem fertilizados podero ser, ento, utilizados
para microinjeo. No caso de se estar trabalhando com a transgnese via clulas ES, os ovos s devero ser
recuperados nos estgios de mrula ou blastocisto (2,5 ou 3,5 dias ps-coito) quando sero injetados com as
clulas ES transgnicas. Nos dois casos, os ovos ou embries injetados devero ser reimplantados em camundongas
barriga de aluguel. Estas so pseudogrvidas obtidas pelo cruzamento de fmeas no perodo de estrus com
machos vasectomizados. A implantao se dar na ampola do oviduto, para os ocitos fertilizados; no oviduto
para as mrulas, e no tero para os blastocistos.

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ANIMAIS DE LABORATRIO
Figura 4 Esquema geral da obteno de um fundador portando um transgene

PSEUDOGRVIDA

Portanto, um aspecto importante para se produzir animais transgnicos o acesso a um biotrio de

qualidade que fornea uma quantidade razovel de camundongos de idades e linhagens determinadas.
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O BIOTRIO IDEAL PARA SE CRIAR ANIMAIS TRANSGNICOS

Idealmente todo animal de experimentao deve ser mantido num ambiente livre de patgenos como
vrus, bactrias e parasitas que podem alterar os resultados de um experimento. No caso de animais
transgnicos ainda mais importante a qualidade do biotrio, tendo em vista que eles so mais frgeis
devido manipulao gentica. Portanto, um biotrio projetado especialmente o ideal quando se deseja
produzir ou criar animais transgnicos.
Nos casos mais restritos, como quando se estabelecem colnias de camundongos nocautes para genes
imunolgicos, barreiras devem ser criadas para se aumentar o isolamento da colnia. Nesses casos, os bioteristas
e pesquisadores devem tomar uma ducha e trocarem toda a vestimenta ao entrar no biotrio. Todo o material
de consumo como gua, comida, maravalha, suplementos, gaiolas etc. devem ser autoclavados antes de penetrar
no ambiente. Os animais vindos de outros laboratrios ou fornecedores devem passar por uma quarentena e
serem testados para diferentes patgenos. Em casos em que a imunidade dos animais no est em questo,
barreiras menos rgidas so exigidas. Por exemplo, o banho dos que adentram o biotrio pode ser eliminado.
No entanto, quando os animais so extremamente frgeis, o melhor manter a colnia pequena e dentro de
isoladores. O mesmo deve ser feito quando o problema for a sade do experimentador e no a do animal.
Um aspecto importante a climatizao do biotrio. Biotrios com patgenos controlados, geralmente,
tm de manter as salas de animais com presso positiva para que os germes tenham dificuldade de entrar.
Porm, biotrios que mantenham animais geneticamente modificados devem, por lei, manter uma presso
negativa em relao ao meio ambiente, uma vez que o que deseja conter so os animais modificados. Assim
sendo, num projeto de biotrio em que se mantenham animais do tipo selvagem e aqueles geneticamente
modificados deve-se pensar em ter salas com presso positiva e filtros esterilizantes para se manter as colnias
selvagens e os animais imunologicamente deficientes. Entretanto, animais modificados que possam representar
um risco para o meio ambiente ou para o homem devem ser mantidos em salas com presso negativa. O
biotrio como um todo por sua vez deve ser mantido em presso negativa em relao ao meio externo.
Um desenho que pode ser tomado como modelo para um biotrio desse tipo pode ser visto na figura a seguir.
Figura 5 Planta de um biotrio de transgnicos

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ANIMAIS DE LABORATRIO

QUE ANIMAIS DEVEM SER UTILIZADOS NA PRODUO DE TRANSGNICOS

O background gentico parece ter influncia na penetrao de um fentipo nocauteado; portanto, muitas
vezes linhagens especficas tm de ser utilizadas.
Em princpio, qualquer linhagem de camundongo pode ser modificada geneticamente, mas algumas
apresentam vantagens experimentais. Linhagens inbred ou hbridas F1 variam em relao ao nmero de ovos
que produzem aps superovulao. Geralmente, elas podem ser divididas em duas categorias, as que so boas
superovuladoras (colocam 40 a 60 ovos por camundonga) e aquelas que superovulam mal (15 ou menos ovos
por camundonga). Como o nmero de ovos obtidos sempre um fator limitante num experimento de transgnese,
deve-se escolher uma linhagem boa superovuladora para trabalhar. Entre estas podemos citar a C57BL/6J, a
BALB/cByJ, a 129/SvJ ou ainda hbridas de C57BL/6J com CBA/CaJ, DBA/2J ou BALB/cByJ.
A deciso de qual dessas linhagens utilizar levam em conta se a cor do plo ser um indicador da transgnese.
Isso ocorre nos experimentos de nocaute em que o camundongo gerado uma quimera formada por clulas
do blastocisto e por clulas ES transformadas. Para se ter uma noo de quanto as clulas ES transgnicas
contriburam no desenvolvimento do animal, basta utilizar, por exemplo, clulas de um camundongo de plo
marrom num blastocisto obtido de camundongo de plo preto. A quimera resultante apresentar o plo de
duas cores, como pode ser visto na figura a seguir.
Figura 6 Esquema geral de obteno de quimeras

OBTENO DE BLASTOCISTO
3,5 dias aps a cpula, por
lavagem dos teros da fmea
de plo branco

Blastocistos so
colocados em cultura para
gerar linhagens ES

As clulas manipuladas
so injetadas de volta
em novos blastocistos,
agora obtidos de fmea
de plo preto
implantao do
blastocisto

Prole quimrica com plos

de duas cores

camundongo selvagem

Na F1 verificamos que filhotes

transmitiram a modificao gentica

Fonte: modificado de Stephane Viville em Houdebine (1997).

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Para se maximizar o nmero de ovos obtidos de camundonga superovulada, deve-se cruz-la com machos
que tenham uma alta contagem de esperma e uma boa capacidade de cpula. Esses machos so mantidos em
gaiolas separadamente.
Portanto, o biotrio de transgnicos dever manter camundongos, para diversas finalidades, que podem
ser de linhagens diferentes como listado a seguir:

FMEAS JOVENS PARA PRODUO DE OVOS FERTILIZADOS

Como dissemos anteriormente, vrias linhagens inbred ou hbridas podem ser utilizadas nessa etapa. Para
se produzir o nmero necessrio de fmeas jovens ( 3 semanas) para superovulao, necessrio um nmero
de 20 gaiolas contendo um macho e uma fmea que iro produzir uma prognie de cerca de 20 fmeas por
semana para experimentao.

MACHOS FRTEIS
Cerca de 20 gaiolas contendo machos jovens e frteis de pelo menos 8 semanas devem ser mantidas no
biotrio de transgnese. Esses machos sero utilizados para cpula com as camundongas superovuladas. Eles
podem ser hbridos como estas ou inbred de uma das linhagens utilizadas para a produo das hbridas.

MACHOS V ASECTOMIZADOS
Machos estreis so necessrios para gerao de camundongas pseudogrvidas. Eles so vasectomizados
e qualquer linhagem com boa capacidade de cpula pode ser utilizada. Aps a vasectomia, eles devem
ser testados para sua esterilidade antes de serem utilizados para experimentos. Para se obter 4 a 8 fmeas
pseudogrvidas 5 dias por semana, so necessrios cerca de 20 machos estreis a serem mantidos em
gaiolas separadas.

FMEAS

PARA

SERVIREM

COMO

RECIPIENTES

Fmeas pseudogrvidas so preparadas pelo acoplamento de fmeas em estrus natural com machos
vasectomizados. As fmeas devem ter, no mnimo, 6 semanas e pesar ao menos 20 g sem serem muito gordas.
Fmeas de algumas linhagens apresentam vantagens como recipientes. Por exemplo, camundongos CD1 (Charles
River Laboratories) tm ampolas muito largas que ajudam na transferncia para os ovidutos e hbridas F1
(B6x x CBA) so timas mes e so capazes de manter ninhadas to pequenas como dois filhotes.
Como, em geral, cada fmea entra em estrus e ovula a cada 4 a 5 dias, numa colnia 20% a 25% das fmeas
estar em estrus a cada dia. Desse modo, so necessrias pelo menos 50 fmeas de idade entre 2 a 5 meses para
a produo de cerca de 20 plugs por semana.

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ANIMAIS DE LABORATRIO

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
HOGAN, B. et al. Manipulating the Mouse Embryo. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994.
HOUDEBINE, L. M. (Ed.). Transgenic Animals generation and use. Amsterdam: Harwood Academic Publishers,
1997.

BIBLIOGRAFIA
JOYNER, A. L. Gene Targeting a pratical approach. Oxford: IRL Press, 1995. (The Pratical Approach Series)

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