Observacin Microscpica

El microscopio es una herramienta de gran importancia para la observacin e

identificacin de los microorganismos. Debemos distinguir entre las tcnicas para
observacin de microorganismos vivos y las preparaciones para tincin. Las
tinciones ofrecen una informacin adicional a la simple observacin de la
morfologa, ya que ponen de manifiesto caractersticas de la pared celular o la
existencia de estructuras especiales, como las esporas bacterianas.
Para observar bacterias al microscopio se utiliza el objetivo de
inmersin (mximo aumento). Para ello se coloca sobre la preparacin una gota
de aceite de inmersin. Para enfocar con este objetivo, colocar la preparacin con
el aceite en la platina del microscopio, aproximarla con el tornillo
macromtrico MIRANDO DESDE FUERA, hasta que el objetivo toque el aceite.
Posteriormente, ya mirando por el ocular, hacer un enfoque grosero con ayuda del
mismo tornillo. Cuando se aprecie una imagen ms o menos clara, ajustar
el enfoque con el tornillo micromtrico.

Observacin en fresco
Material

Cultivo puro

Portaobjetos

Cubreobjetos

Microscopio

Aceite de inmersin

A partir de cultivos en medio lquido se procede de la siguiente forma: Cargar el asa

bacteriolgica con una gota de de cultivo y depositarla en un portaobjetos limpio.
Colocar un cubreobjetos procurando que no queden atrapadas burbujas de aire. Si
la cantidad de cultivo que recoge el asa es muy pequea se carga 2 o 3 veces.

A partir de cultivos en medio slido, en primer lugar se procede a colocar una gota
de agua en el portaobjetos. A continuacin se carga el asa con una pequea
cantidad de bacterias de una colonia del cultivo y se re suspende en la gota de
agua. Colocar el cubreobjetos. La preparacin se observa al microscopio pudiendo
determinar su morfologa (cocos o bacilos) al igual que la movilidad.

Se debern reconocer las caractersticas morfolgicas y tintoriales de las

distintas bacterias.
El alumno deber informar el agrupamiento, forma, coloracin, pudiendo
utilizar como gua para dicha descripcin la siguiente clasificacin: Forma:
esfrica (COCOS) alargada (BACILOS) bacilos cortos (COCOBACILOS)
Agrupamiento: aislado (individual) diplos tetradas cadenas racimos
empalizada

A continuacin se muestran imgenes de preparaciones bacterianas en un

microscopio conectado a una televisin

Observacin en fresco de un cultivo

de Staphylococcus (cocos)

Observacin en fresco de un cultivo

de Pseudomonas (bacilos)

Fijacin al calor

A partir de cultivos en medio lquido se carga el asa bacteriolgica con una

gota de cultivo y se deposita en un portaobjetos limpio realizando una
extensin de la muestra hasta conseguir una capa fina (frotis). Si partimos
de un cultivo en medio slido, primeramente dispondremos una pequea
gota de agua en el portaobjetos. A continuacin se carga el asa con una
pequea cantidad de bacterias de una colonia del cultivo y se resuspende
en la gota de agua, tras lo cual realizaremos el frotis.

Posteriormente debemos secar la preparacin acercndola a la llama

del mechero evitando que se caliente demasiado (comprobar con el dorso
de la mano que no quema). Una vez seca, se procede a la fijacin, haciendo
pasar la preparacin 3-4 veces por la llama del mechero (la llama debe
tocar la parte inferior del portaobjetos). A partir de este momento la
preparacin est lista para teir y el procedimiento a seguir depende del
tipo de tincin.

Tincin de Gram
Material

Portaobjetos con muestra fijada al calor

Batera de colorantes. Cristal-Violeta y Safranina

Solucin de decoloracin de Alcohol-Acetona

Pinzas metlicas

Cronmetro

Procedimiento
1. Sumergir el portaobjetos en cristal-violeta de genciana y mantener durante
1 minuto.
2. Lavar con agua y dejar escurrir
3. Sumergir en lugol. Dejar actuar 1 minuto.
4. Lavar con agua y dejar escurrir
5. Decolorar con alcohol-acetona durante 15 segundos.
6. Sacarlo e inmediatamente sumergirlo en safranina para contrastar. Dejar actuar 1
minuto.
7. Lavar con agua y secar con papel de filtro.

En la observacin microscpica las bacterias Gram-positivas aparecen teidas de color

violeta, y las Gram-negativas de rosa.

Tincin de esporas
Material

Portaobjetos con muestra fijada al calor

Batera de colorantes. Verde Malaquita y Safranina

Hisopo para flamear

Pinzas metlicas

Cronmetro

Procedimiento
1. Cubrir el portaobjetos con verde malaquita.
2. Calentar hasta la emisin de vapores. Mantener durante 3 minutos.
3. Lavar con agua.
4. Cubrir del portaobjetos con safranina para contrastar. Dejar actuar 1 minuto.
5. Lavar con agua y secar con papel de filtro.
En la observacin microscpica las esporas aparecen teidas de verde y las clulas
vegetativas de rosa.
http://es.scribd.com/doc/39715369/Morfologia-Bacteriana-Tinciones-ycaracteristicas
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/guia.pdf
https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-demicrobiologia/indice/observacion-microscopica/tincion-de-ziehl-neelsen