PRACTICA Nro.

Determinacin de Lpidos
Lic. Zulema Gallardo Flores
OBJETIVOS:

Determinar los niveles de colesterol y triglicridos en sangre.

Conocer la importancia de los lpidos en sangre y sus efectos en la salud.

INTRODUCCION
Son
macromolculas
orgnicas
(mayoritariamente
biomolculas),
compuestas
principalmente por carbono e hidrgeno y en menor medida oxgeno, tambin pueden
contener fsforo, azufre y nitrgeno
Los lpidos tienen la propiedad de ser relativamente insolubles en agua, y solubles en
solventes no polares como el ter, cloroformo y benceno.
Los lpidos son constituyentes importantes de la alimentacin no solo por su elevado valor
energtico, sino tambin por las vitaminas liposolubles y los cidos grasos esenciales
contenido en las grasas de los alimentos naturales.
Es incorrecto referirse a todos los lpidos como grasas, puesto que stas son un subtipo de
lpidos.
Los lpidos cumplen funciones diversas en los organismos vivientes:

Reserva energtica (triglicridos).

Estructural (fosfolpidos de las membranas celulares).

Reguladora (hormonas esteroideas).

Las lipoprotenas como constituyentes celulares se encuentran en las membranas celulares

y en las mitocondrias y sirven como medio de transporte de los lpidos en la sangre.
El perfil lipdico comprende en:
1- lpidos totales
2- triglicridos
3- colesterol
4- fosfolpidos
5- electroforesis de protenas.
Las lipoprotenas plasmticas tienden a aumentar como resultado de:
a. una sobreproduccin
b. reducida utilizacin o hidrlisis
c. deficientes catabolismo de los mismos
Tambin pueden verse alteradas por:
a. Variacin fisiolgica: como la edad y peso.

La edad tiende a elevar o disminuir los valores de fosfolpidos y colesterol.

El peso tiende a elevar los valores de fosfolpidos y colesterol.
b. Variaciones patolgicas: dislipoproteinemia
Primaria:
Tipo I: aumento de quilomicrones
Tipo IIA: aumento de LDL
Tipo II b: aumento del LDL Y VLDL
Tipo III: Beta ancha
Tipo IV: aumento del VLDL
Tipo V: aumento del quilomicrones y VLDL
Secundaria:
Hipotiroidismo: aumento del colesterol
Diabetes sacarina: aumento de los triglicridos
Sndrome nefrotico: aumento de los lpidos totales
COLESTEROL
El colesterol es uno de los lpidos ms importantes. Una de sus principales funciones es
formar parte de la membrana plasmtica de las clulas eucariotas. Tambin es esencial
para el crecimiento y viabilidad celular.
Es peligroso cuando se halla en concentraciones demasiado elevadas en la sangre. Existen
mtodos tanto de tipo qumico como enzimtico para determinar su concentracin en
sangre.
El colesterol es transportado como lipoprotenas, encontrndose la porcin ms alta en la BLIPOPROTEINAS (LDL) que se forman a partir de las PRE- B LIPOPROTEINAS (VLDL) y una
pequea proporcin en las -LIPOPROTEINAS (HDL).
Su concentracin se ve alterada por:
Edad, factores genticos, sexo, dieta, actividad fsica y hormonas.
Se observa hipercolesterolemia en:
Condiciones fisiolgicas: embarazo
Condiciones patolgicas: ictericia obstructiva, colestasia, sndrome nefrtico y pancreatitis
aguda.
Se observa hipocolesterolemia en:
Condiciones fisiolgicas: desnutricin.
Condiciones patolgicas:
infecciosos agudos.

insuficiencia

heptica

grave,

hipertiroidismo

procesos

Para determinar su concentracin en la sangre se emplean dos tipos de mtodos:

Procedimientos qumicos: se utilizaron durante mucho tiempo para determinar el colesterol
colorimtricamente, no obstante fueron abandonados por presentar gran cantidad de fallas
y su dificultad para ser automatizados.
Procedimientos enzimticos: que determinan el colesterol total directamente en plasma en
una serie de reacciones en las que se hidrolizan los steres de colesterol, se oxida el
colesterol y el agua oxigenada resultante se determina enzimticamente. Adems se puede

incluir una reaccin con peroxidasas en la cual se obtiene un colorante cuya absorbancia a
520nm es equivalente a la concentracin de colesterol.

colester
ol +
colesterol
acidos
oxidasa
grasos
libres

estere
s de colesterol
esterasa
coleste (hidrolisis)
rol

4
colesteno
na +
peroxido peroxidasa
de
hidrogen
o

coloran
te
abso
quinole
rvan
ina

cia

Concentracin
srica de
colesterol
mg/dl
Colesterol Total
Deseable : menos 200
mg/dl

HDL - Colesterol
Hombres :30 70 mg/dl

LDL- Colesterol
Deseable : menos 130
mg/dl

Mujeres : 35 85 mg/dl
Limite alto: 200 239
mg/dl

Limite alto: 130 159

mg/dl

Alto: 240 mg/dl o por

encima

Alto: 160 mg/dl o por

encima

TRIGLICERIDOS (TAG)
Los triglicridos son esteres de glicerol, compuesto por tres cidos grasos distintos. Su
funcin es proporcionar cidos grasos libres para que la sangre los reparta a los diferentes
tejidos, por lo que constituyen un importante combustible metablico y se almacenan en
cantidades variables en los adipocitos, donde son suceptibles a la hidrlisis enzimtica.
Hipertrigliceridemia:
Primaria: se registra en hiperlipemias familiares.
Secundaria: se observa en la obesidad, diabetes sacarina, pancreatitis aguda y crnica y
sndrome
nefrtico.
Al igual que en la determinacin de la concentracin de colesterol, para medir la
concentracin de TAG se emplean dos tipos de mtodos:
Mtodos qumicos: Incluyen la extraccin de los TAG mediante solventes orgnicos, luego
estos triglicridos son hidrolizados a cidos grasos y glicerol, el cual es oxidado a
formaldehdo, pudiendo ser este ltimo medido por diversos mtodos.
Mtodos enzimticos: Los TAG son sometidos a hidrlisis, posterior a lo cual el glicerol
obtenido es sometido a una serie de reacciones enzimticas acopladas en las que se forma
un compuesto denominado nicotinamida adenina dinucletido fosfato (NADP) el cual puede
ser medido por espectrofotometa.
TRIACILGLICERIDOS
(VALORES NORMALES)
40 170 mg/dl

CONDICIONES QUE DEBE REUNIR LA MUESTRA PARA REALIZAR UN PERFIL

LIPIDICO.
1- PREPARACION DEL PACIENTE:
a- no se debe variar los hbitos alimenticios durantes 3 das.
b- tener un peso corporal estable
c-ayuno de 12 a 16 horas
d- no consumir alcohol 72 horas antes del da de la toma de muestra.
2-TECNICA DE EXTRACCION DE SANGRE:
Un mtodo conveniente consiste en tener al paciente sentado, sujeto a un mnimo de
tensiones y extraer la muestra de la vena ante cubital. Si se emplea torniquete se aconseja
retirarlo antes de la extraccin ya que se ha informado de que el uso prolongado produce
aumento en los valores lipiditos.
3-ELECCION DEL PLASMA O SUERO:
Para el anlisis qumico de lpidos y lipoprotenas se prefiere generalmente plasma. El
anticoagulante aconsejado es EDTA slido (1 mg/ml de sangre) y las clulas sanguneas
deben separase tan pronto como sea posible.
4- CONSERVACION DE LAS MUESTRAS:
Si no se va a realizar rpidamente las determinaciones de lpidos se recomienda la
congelacin de las muestras las muestras se han de analizar en unos pocos das es
suficiente su refrigeracin a 4 c. si la conservacin no es a corto plazo las muestras deben
ser congeladas.

Determinacin de triglicridos
Fundamento.:
1- el glicerol y los cidos grasos se forman en una primera etapa por la accin de la lipasa
sobre
los
triglicridos.
2- El glicerol de fosforila por la adenosin-5-trifosfato(ATP) para producir glicerol-3-fosfato(G3-P) y adenosin 5-difosfato(ATP) para producir glicerol- 3-fosfato (G-3-P) y adenosin 5difosfato (ADP) en una reaccin catalizada por el glicerol- Kinasa.
3- La G-3-P por la glicerol fosfato oxidasaproduciendo (DPA) y peroxido de hidrogeno.
4- Los perxidos reaccionan con 4-aminoantipirina y 4-clorofenol bajo la influencia cataltica
de la peroxidasa para formar quinoneimina.
Tcnica
Preparar:
Blanco reactivo: 1ml de reactivo
Estndar: 0.01 de estandar+1ml de reactivo
Muestra: 0.01 de muestra+ 1 ml de reactivo
Incubar los tubos por 5 minutos a 37 c
Lea el estndar y muestra contra el blanco reactivo a 500 nm antes de los 15 min.
RESULTADOS:
Estndar: 200mg/dl
Muestra: 38 mg/dl .
Determinacin de colesterol total
Fundamento:
La determinacin de Colesterol Total est basada en el procedimiento enzimtico descrito
por Allain, donde el colesterol--estearasa (CE) hidroliza los steres de colsterol a colesterol
libre y cidos grasoso. En presencia de oxigeno, el colesterol libre es oxidado por la
colesterol oxidasa (CO) a cholest-4-en-3-one y perxido de hidrogeno. Cuando el fenol est
oxidativamente acoplado con 4-aminoantipirina en la presencia de peroxidasa (HPO), y
perxido de hidrogeno se produce un cromoforo de quinoneimina. La intensidad de color
producido es proporcional a la concentracin de colesterol y se mide coiorimetricamente a
500nm.

REACTIVOS:

A. Reactivo A: solucin de 4-aminofenazona 25 mmol/l.

B. Reactivo B: solucin de fenol 55 mmol/l.
C. Reactivo C: suspensin conteniendo lipasa fungal 300 U/ml, colesterol oxidasa (CHOD) 3
U/ml y peroxidasa (POD) 20 U/ml.
S. Standard: solucin de colesterol 2 g/l.
MATERIAL REQUERIDO:

Espectrofotmetro o fotocolormetro.
Micropipetas, pipetas y material volumtrico adecuados.
Frasco de vidrio color caramelo.
Tubos o cubetas espectrofotomtricas de caras paralelas.
Bao de agua a 37C (opcional).

- Reloj o timer.
MATERIAL BIOLGICO:
Suero, estable 6 das a 2-8C.

Determinacin de HDL-COLESTEROL
La funcin principal de las HDL en el metabolismo lipdico es la captacin y transporte de
colesterol desde los tejidos perifricos al hgado. Por este motivo la determinacin de HDL
colesterol es una herramienta til en la identificacin de individuos de alto riesgo.
FUNDAMENTO
Las lipoprotenas de alta densidad (HDL) se separan precipitando selectivamente las
lipoprotenas de baja y muy baja densidad (LDL y VLDL) mediante el agregado de cido
fosfotngstico
en
presencia
de
iones
magnesio.
Las HDL quedan en el sobrenadante separado por centrifugacin, donde se realiza la
determinacin del colesterol ligado a las mismas, empleando el sistema enzimtico
Colesterol oxidasa/Peroxidasa con colorimetra segn Trinder.
REACTIVOS:

-A. Reactivo A (Reactivo Precipitante): solucin de cido fosfotngstico 0,44 mmol/l y cloruro
de magnesio 20 mmol/l.
-Colestat enzimtico, Colestat enzimtico AA o Colestat enzimtico AA lquida.
MATERIAL REQUERIDO:

Espectrofotmetro o fotocolormetro.
Micropipetas y pipetas para medir los volmenes indicados.
Tubos de Kahn.
Cubetas espectrofotomtricas de caras paralelas.
Bao de agua a 37C.
Reloj o timer.

MATERIAL BIOLGICO:

Suero, estable 6 das a 2-8C.

CLCULO DE LOS RESULTADOS:

VALORES DE REFERENCIA:

El panel de expertos del National Cholesterol Education Program (NCEP) provee los
siguientes Valores de HDL colesterol: 0,40 - 0,60 g/l.
No obstante, valores mayores de 0,40 g/l se consideran recomendables y los que se
encuentren por encima de 0,60 g/l se han considerado como protectivos. Por el contrario,
valores de HDL colesterol por debajo de 0,40 g/l se consideran como ndice significativo de
riesgo
de
enfermedad
cardaca
coronaria.

Determinacin de LDL-COLESTEROL
Estudios sealan al LDL colesterol como el factor clave en la patognesis de la
ateroesclerosis y la enfermedad cardaca coronaria (ECC), mientras que el HDL colesterol es
considerado como factor protectivo. Puede ocurrir un aumento en el LDL colesterol, an con
concentraciones normales de colesterol, asociado a un incremento en el riesgo de ECC.
FUNDAMENTOS DEL MTODO:
El presente mtodo es un ensayo homogneo sin precipitacin, en dos pasos. En el primero,
se agrega un tensioactivo (Reactivo A) que solubiliza las partculas lipoproteicas no-LDL. El
colesterol liberado es consumido por la colesterol esterasa y la colesterol oxidasa en una
reaccin sin desarrollo de color. Un segundo tensioactivo (Reactivo B) solubiliza las
partculas de LDL formndose, por la presencia de enzimas y un Reactivo cromognico, un
color proporcional a la cantidad de LDL colesterol presente en la muestra.

REACTIVOS:

- Reactivo A: solucinconteniendocolesterolesterasa1000 U/l, colesterol oxidasa 1200 U/l,

peroxidasa 1250 U/l, ascorbato oxidasa 3000 U/l, 4-aminoantipirina 1 g/l y tensioactivo 7 g/l
en buffer
MES
50
mM.
- Reactivo B: solucin conteniendo N,N-bis-(4-sulfobutil)-m-toluidina disdica (DSBmT) 0,4
g/l y tensioactivo 10 g/l en buffer MES 50 mM.
-Calibrador: suero humano liofilizado conteniendo lipoprotenas de diversos tipos incluyendo
LDL. La concentracin es variable lote a lote (ver ttulo en el rtulo).
MATERIAL REQUERIDO:

- Material volumtrico para medir los volmenes indicados.

- Analizador automtico.
MATERIAL BIOLGICO:
Suero, estable 6 das a 2-8C.

CLCULO DE LOS RESULTADOS:

VALORES DE REFERENCIA:
El panel de expertos del National Cholesterol Education Program (NCEP) provee los
siguientes valores de LDL colesterol en relacin al riesgo de contraer enfermedad cardaca
coronaria
(ECC):
- Riesgo bajo o nulo (sujetos normales): valores de LDL colesterol menores de 129 mg/dl.
- Riesgo moderado a elevado (individuos con probabilidad de contraer ECC): valores entre
130
y
189
mg/dl.
- Riesgo muy elevado (individuos sospechosos de padecer ECC): valores de LDL colesterol
190 mg/dl.
Determinacin de Triglicridos
FUNDAMENTOS DEL MTODO:

REACTIVOS:

-Reactivo A: viales conteniendo lipoprotein lipasa, glicerol kinasa (GK), glicerol fosfato
oxidasa (GPO), peroxidasa (POD), adenosina trifosfato (ATP) y 4-aminofenazona (4-AF).
-Reactivo B: solucin de buffer Good conteniendo clorofenol, pH 7,5.
-Standard: solucin de glicerol 2,26 mmol/l (equivale a 2 g/l de triolena).
-Calibrador A plus, cuando se emplea la tcnica automtica.
MATERIAL REQUERIDO:

Espectrofotmetro o fotocolormetro.
Micropipetas y pipetas para medir los volmenes indicados.
Tubos o cubetas espectrofotomtricas.
Bao de agua a 37C.
Reloj o timer.

MATERIAL BIOLGICO:

Suero, estable 6 das a 2-8C.

CLCULO DE LOS RESULTADOS:

VALORES DE REFERENCIA:

El panel de expertos del National Cholesterol Education Program (NCEP) provee los
siguientes valores de Triglicridos:
Deseable: < 1,50 g/l
Moderadamente elevado a elevado: 1,50 - 1,99 g/l

Elevado: 2,00 - 4,99 g/l

Muy elevado: 5,00 g/l
Conclusin
La determinacin de un perfil lipidico tiene gran importancia clnica ya que se puede
emplear como un diagnostico primario de ciertas enfermedades, as como tambin en el
seguimiento de algunas enfermedades como: diabetes mellitas, necrosis, obstruccin biliar
y varias anormalidades metablicas que resultan de disturbios endocrinos.
BIBLIOGRAFIA
ngel, G. ngel, M. Interpretacin Clnica del Laboratorio. Transaminasas. Bogot
Colombia. 2006.
Jimnez, E y otros. (1996) mejora contina de la calidad. Panamericana: Mxico, D.F