Universidad San Francisco de Quito

Laboratorio de Bioqumica
Prueba de Biuret para determinar la concentracin de una Protena
Informe No. 1
Carlos Vintimilla. 00112180

17/03/2013

Jorge Alvarez Santana. 00112073

Objetivos de la prctica

Realizar una prueba de biuret para determinar la concentracin de la

albmina

Establecer una ecuacin y una curva de valoracin para la concentracin

de la albmina

Mtodo
Materiales

Esptula
Baln aforado 100mL
Soporte
Pinza para bureta
Bureta
Tubo de ensayo grande

Gradilla
Tubo de ensayo para
espectrofotmetro
Vaso de precipitacin de
150mL
Piceta
Parafilm

Reactivos

Albmina de bovino
Sulfato de cobre pentahidratado
Tartrato de sodio y potasio tetrahidratado
Hidroxido de sodio
Agua destilada

Equipos

Espectrofotmetro
Balanza de precisin
Ultrasonido

Procedimiento

Primero se prepararon 100mL de la solucin de Biuret, para esto se

pesaron 0.143 g de sulfato de cobre (II) y 0.8254 g de tartrato de sodio y
potasio. Ambos reactivos se pusieron en un baln volumtrico y a esta
mezcla se le aadi 30mL de agua. Despus se pes 9.9018 g de NaOH y
se disolvi en 99mL de agua para formar una solucin de NaOH al 10%. Se
aadieron 30mL de esta solucin a la que contena sulfato cprico y
tartrato de sodio y potasio y se la afor a 100mL.

Se prepararon 100 mL de soluciones de distintas concentraciones, a este

grupo le toco hacer la solucin con concentracin de 2mg/mL. Para esto se
pesaron 0.2123 g de albmina y despus de esperar que bajen las
burbujas se afor a 100mL. Para disolver la albmina se utiliz el
ultrasonido.

Posteriormente se arm el soporte universal con las pinzas y la bureta. Se

transfiri 1mL de la solucin de albumina 2mg/mL y 4mL de la solucin de
Biuret a un tubo de ensayo, despus se transfiri esta mezcla a un tubo
para espectrofotmetro y se procedi a medir la absorbancia. Despus se
dej reposar la solucin por 30 minutos y se midi la absorbancia
nuevamente.

Resultados

Tabla 1. Resultados de la concentracin de albmina vs la

absorbancia

Con
cent
raci
n
(mg/
ml)
Abs
orba
ncia

0
.
5
1
2

1
.
1
5
1

2
.
1
2
3

4
.
9
7
3

8
.
0
2
3

10.

0
.
0
0
9

0
.
0
2
9

0
.
0
9

0
.
2
1
8

0
.
3
3
6

0.3

La tabla 1 muestra los valores de absorbancia registrados para las

diferentes concentraciones de albmina.

Grfico 1. Prueba de Biuret para determinar la concentracin de

una Protena

Curva de valoracin de la albmina

0.4

f(x) = 0.04x + 0
R = 0.98

0.35
0.3
0.25

Absorbancia

Absorbancia

0.2

Linear (Absorbancia)

0.15
0.1
0.05
0
0

8 10 12

Concentracin (mg/mL)

Este grfico muestra la absorbancia de diferentes concentraciones

referenciales de lbmina. El grfico sirve para establecer una ecuacin y
determinar la concentracin de otras muestras de albumina.

Tabla 2. Clculo de las concentraciones desconocidas a partir de la

absorbancia

Muestra
Absorbancia
Concentracin
II
0.271
6.99
III
0.315
8.13
La tabla 2 muestra la absorbancia de dos muestras cuya concentracin
era desconocida. La concentracin en estas muestras se calcul mediante
la frmula obtenida en el grfico de absorbancia (Anexos).

Discusin y Conclusiones

El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en una solucin acuosa alcalina de

NaOH, al momento de mezclar la protena con este reactivo se observa
una coloracin violeta. Esta coloracin se debe a la formacin de un
complejo entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos
del N que forma parte del enlace peptdico. Esta prueba es muy especfica
con protenas y pptidos y no con aminocidos ya que estos no presentan
enlace peptdico. La intensidad del color es directamente proporcional a la
concentracin de protenas. (Fernndez y Galvn, s/f)

El espectrofotmetro es un instrumento para medir la concentracin de

una solucin, se basa en el principio por el cual el nmero de partculas es
directamente proporcional a la cantidad de luz emitida cuando un haz de

luz lo atraviesa. Se realizaron diferentes muestras de concentracin de

albmina y se las midi con el espectrofotmetro. Se obtuvo los resultados
esperados ya que a mayor concentracin de albmina se registr mayor
absorbancia (Tabla N 1).

La interpretacin del valor de R corresponde a una relacin lineal entre

dos variables cuantitativas, debido a que en el experimento se determin
que R=0.98147 se dice que existe una relacin directa positiva ya que es
cercano a 1. Esto quiere decir que mientras una de las variables aumenta
la otra tambin lo hace proporcionalmente. Debido a esto se determina
que la concentracin de albumina es directamente proporcional a la
absorbancia, es por ello que se obtiene una grfica lineal (Grfico 1).
Adems esto corresponde a que el experimento se realiz correctamente
ya que el valor de R tambin indica que tan cercanos estn nuestros
resultados de los valores reales.

Las muestras que se desconoca su concentracin se las calcul mediante

la frmula lineal:
y = 0,0387x + 0,0003. Se determin que la muestra II tiene una
concentracin de 6.99 mg/ml (Tabla 2), este valor concuerda con la curva
de valoracin de la albmina a partir de otras concentraciones (Grfico 1).
La muestra II obtuvo una absorbancia de 0.271 lo cual, en la curva de
valoracin corresponde a una absorbancia entre la concentracin 5mg/ml
y 8mg/ml. Se determina que las muestras realizadas para la concentracin
5mg/ml y 8mg/ml se las realizaron correctamente. Por otro lado, la
muestra III tiene una concentracin de 8.13mg/ml (Tabla 2), este valor no
concuerda con la curva de valoracin de la albumina. A una concentracin
de 8mg/ml se registra una absorbancia de 0.336 mientras que en la
muestra III se registra una concentracin de 8.13mg/ml a una absorbancia
de 0.315, este error de concentracin se puede deber a que el grupo
encargado de realizar la muestra de 8mg/ml no pes bien la muestra de
albmina ya que esta muestra debera tener una absorbancia menor a la
muestra III.

El tiempo de conservacin de la albumina es un factor principal para

determinar una curva de titulacin, ya que las protenas al pasar el tiempo
vienen a desnaturalizarse. Debido a que la muestra de albumina con la
que se trabajo fue del 2012 puede ser que se haya producido una
desnaturalizacin y sea responsable de las fluctuaciones de la
absorbancia.
En el presente laboratorio se logr realizar la prueba de Biuret para
determinar la concentracin de albmina en diferentes muestras, sin
embargo se produjo un error en la concentracin 8mg/ml ya que debera
presentar una absorbancia menor a la registrada a una concentracin de
8.13mg/ml. Se estableci una ecuacin de la curva de valoracin para
poder calcular la concentracin de otras muestras y el grafico de la curva
de valoracin posee una relacin directa entre las dos variable, debido a
que a mayor concentracin de albumina es mayor el valor de la
absorbancia.

Postlaboratorio

1.- Definir:

Absorbancia: Indica la cantidad de luz que es absorbida por la muestra.

Transmitancia: Relacin entre la cantidad de luz que llega al detector
una vez que ha atravesado la muestra (Daz et al, s/f)
Ley de Lamber Beer: Relacin entre absorbancia de luz
monocromtica y concentracin de un cromforo en solucin

A = log I/Io = cl ; en donde es el coeficiente molar de

extincin, c es concntracion molar y l es distancia en cm.

Se afirma que la cantidad de luz que abandona la muestra se

disminuye por la concentracin, distancia de la trayectoria ptica y el
fotn sea absorbido por el material que es conocido como coeficiente de
extincin. (Daz et al, s/f)
-

Absortividad: La absortividad es la medida de la capacidad de un

material o compuesto de absorber la luz a una determinada longitud de
onda (Crossbie, 1998).
Absortividad molar: La absortividad molar es la medida de cuan fuerte
una especie qumica es capaz de absorber la luz a una determinada
longitud de onda. Las unidades internacionales para la absotividad molar
son m2/mol aunque se usa ms cm -1M-1. La absotividad es directamente
proporcional a la absorbancia y la frmula que las une es la ley de BeerLambert:
A= ecl

Donde A es la absorbancia, e es la absortividad molar, c es la

concentracin de la especie qumica y l es la longitud de onda (Kemp,
1991).

2.- Cul de los siguientes mtodos es ms sensible: el de Biuret

el de Folin-Ciocalteu? Adems indique la menor concentracin que
cada uno de ellos puede detectar.

El mtodo ms sensible es de Folin-Ciocalteu. La menor concentracin

que puede detectar el mtodo de Biuret es de 1mg mientras que el
mtodo de Folin-Ciocalteu es de 300ug.

3.- Indique a que longitud de onda detectara la presencia de una

protena con alto contenido de triptfano y tirosina. Explique el
por qu.

El triptfano se reconoce a una onda de longitud de 280nm mientras que

la tirosina a 275nm. Las protenas con estos aminocidos tienen un
espectro de absorcin entre 275 a 290nm. Esto se debe a que estos
aminocidos contienen residuos aromticos los cuales aumentan la
absorbancia de las protenas. Esto sucede porque los grupos aromticos
de estos aminocidos actan como cromforos que absorben la luz
(Arenas y Lpez, 2004).

4.- En dnde se encuentra la albumina? Cmo se obtiene la

albumina
en
forma
industrial?
Indicar
las
principales
caractersticas de la albmina.

Es sintetizada por el hgado y se encuentra en mayor cantidad en el

plasma sanguneo. Estn formados por una sola cadena de aminocidos,
transporta y almacena cidos grasos y frmacos, es un componente
estructural de la sangre, son globulares, son solubles en agua y soluciones
salinas diluidas, coagulan con el calor y precipitan con sulfato de amonio,
formada por 585 aminocidos que comprende de 17 puentes disulfuro con
un peso molecular de 67.000 dalton (Velsquez y Ordirica, s/f).

La albumina se puede obtener a partir de plasma, placentas humanas. Se

toma cientos de plasmas y se los mezcla para luego son sometidas a un
despistaje serolgico para Hepatitis B, Hepatitis C, VIH tipo 1 y 2,
Tripanosoma cruzi y Treponema pallidium. Se desarroll en 1940, en
donde sufre un proceso de fraccionamiento con etanol frio a distintas
concentraciones y cambios de temperatura, fuerza ionica y pH. El primer
fraccionamiento esta conformado por factor VIII y fribringeno, el segundo
fraccionamiento presenta inmunoglobulinas, el tercer y cuarto poseen
otras protenas y factores de coagulacin y el ultimo fraccionamiento
posee albumina. Luego es sometido a pasteurizacin a 60C durante 10
horas. Presenta un pH entre 6.7 y 7.3. El etanol ayuda a la eliminacin de
bacterias y virus. (Benal, Jdar y Montoro, s/f)

5.- Resuelva el siguiente problema: 200mL de una solucin que

est a pH 7.4 contiene una concentracin desconocida de flavinaadenina-mono nucletido (FMN). Si usted conoce 3mL de esta
solucin en una cubeta de cuarzo de 1cm de ancho, 1cm de largo
y 4cm de alto y determinar que absorbancia de esta solucin es
de 0.258
a) Cul es la molaridad de la solucin de FMN?

A=E . c .l

c=

a
=
E .l

0.258
18500

( cm1. M ) 2.6 x 10

c=

(cm)

0.481 M

b) Cuntas moles de FMN hay en los 200mL de solucin?

0.481

c=

mol
L

mol
( molL )= 0.200
( L)

mol=0.0962

c) Cuntas micromoles de FMN coloc usted en la cuveta?

0.0962 mol

1 x 106 micromoles
=9.6 x 105 micromoles
1 mol

Bibliografa

Arenas, I. y Lpez, J. (2004). Espectrofotometra de absorcin. Universidad

Autnoma de Mxico. Cuernavaca, Mxico.

Bernal, C., Jdar, R. y Montoro, B. (s/f). Hemoderivados: Actualizacin.

Recuperado
el
13
de
septiembre
del
2014
desde
http://www.ub.edu/legmh/capitols/napal.pdf

Crosbie, M. J. (Ed.). (1998). The passive solar design and construction handbook. John Wiley
& Sons.

Daz, N., Brcena, A., Fernndez, E., Galvn, A., Jorr, J., Peinado, J., Toribio,
F. y Tnez, I. (s/f). Espectrofotometra: Espectros de absorcin y
cuantificacin colorimtrica de biomolculas. Departamento de Bioqumica
y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales. Crdoba, Madrid

Fernndez, E. y Galvn, A. (s/f). Mtodos para la cuantificacin de

protenas. Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus
Universitario de Rabanales. Crdoba, Madrid

Kemp, W. (1991). Organic spectroscopy. Edinburgh,.

Velsquez, M. y Ordirica, M. (s/f). Protenas. Recuperado el 15 de

septiembre
del
2014
desde
http://www.bioquimica.dogsleep.net/Teoria/archivos/Unidad30.pdf

ANEXOS

1.- Reactivo de Biuret

Composicin: Sulfato de Cobre 0.1430 g., Hidrxido de Sodio 9.9018 g.,
Tartrato de sodio 0.8254 g.

2.- Concentracin de Albmina: 2mg de Albmina en un volumen final

de 1ml

100 ml

2 mg
1g
3 =0.2 g de albmina
1 ml 10 mg

Se realiz el mismo clculo para obtener las concentraciones de 5mg,

8mg, 10mg, 0.5mg, 1mg y 10mg en un volumen final de 1ml.

3.- Calcular la concentracin de las muestras II y III

y=0,0387 x +0,0003

Siendo y: absorbancia y x: concentracin de albmina

x=6.99 mg/ml

Muestra III:

Muestra II:

0.315=0,0387 x +0,0003
x=8.13 mg/ml

0.271=0,0387 x +0,0003