ESTUDIOS DE TOXICIDAD DERMAL

Para la regulacin de muchos productos, incluyendo productos para el hogar

(detergentes, limpiadores, ceras, ceras), cosmticos, medicamentos, pesticidas, y
todos los productos qumicos industriales que pueden entrar en contacto directo con
la piel, los estudios sobre la piel de la especie animal adecuada. Los estudios de
irritacin primaria cutnea se llevan a cabo rutinariamente como son experimentos
de sensibilizacin cutnea, pero ms recientemente, la atencin se est dirigida
hacia la fototoxicidad y fotosensibilizacin con agentes que provocan estos efectos
inusuales en los seres humanos. La realizacin de estos estudios ha generado una
gran controversia entre los grupos de bienestar animal que hacen vlidos los puntos
de que pueden causar malestar y dolor, son inhumanas, y los resultados son difciles
de extrapolar al hombre. En defensa de estos estudios que, en primer lugar, estn
diseados para evaluar las consecuencias de exposicin accidental y/o laboral a
altas concentraciones de agentes, hay que sealar que, hasta la fecha, ninguna de
las pruebas in vitro alternativas han sido aplicadas o aceptadas por los organismos
reguladores.
A. Irritacin Primaria
Un irritante primario es una sustancia que, como resultado de un efecto citotxico
directo, produce cambios inflamatorios en la piel caracterizados por la presencia de
Inflamacin, vesiculacin y necrosis. La metodologa para evaluar el potencial de
una sustancia qumica para causar irritacin, como la medida del edema
(acumulacin excesiva de lquido en el fluido subcutneo) y eritema (enrojecimiento
de la piel causada por la congestin de los capilares), fue descrito por primera vez
por Draize et al . (1944). La prueba de Draize (cabe sealar que hay dos ensayos,
uno sobre la piel y uno que afectan al ojo) se ha modificado y alterado segn sea
necesario para poner a prueba los agentes nuevos y nicos, pero, en esencia, el
protocolo se ha mantenido sin cambios. La prueba de Draize fue diseado como
una prueba de la seguridad del producto.
Los roedores como las ratas se utilizan generalmente en los estudios iniciales de
irritacin drmica, pero, con mayor frecuencia se utilizaran el conejo o el conejillo
de indias, los cuales tienen la piel relativamente sensible. Se pueden usar animales
ms grandes, como el cerdo miniatura o un perro. La piel de los monos Rhesus se
considera mejor para imitar la piel de los seres humanos (Wester y Maibach, 1975).
La eleccin de las especies puede ser dictada por (1) las propiedades de la
sustancia qumica, es decir, lquidos, slidos, baja toxicidad, etc., que requiere la
aplicacin de gran cantidad, (2) la solubilidad de la sustancia qumica en medios
acuosos y/o orgnicos, etc., y (3) las sensibilidades conocidas de la piel animal en
comparacin con las del humano. Los animales son preparados para el experimento
con 24 h de antelacin quitando el pelo en la espalda o en el abdomen con una

maquinilla elctrica, dejando al descubierto un parche desnudo de la piel (de 3,0 a

4,0 cm x 5,0 a 6,0 cm para ratas; 6 cm x 10 cm para los conejos) igual a
aproximadamente 10 a 15% de la superficie total. Los sitios de ensayo ser de
aproximadamente 5,0 cm: (1,0 pulgadas x 1,0 pulgada) En un tiempo, era comn
aplicar una crema depilatoria a la piel expuesta para eliminar cualquier "rastro", pero
fue elevada la preocupacin acerca de la irritacin de la piel y los subsiguientes
cambios en las propiedades fisiolgicas de la zona de prueba. Esto ya no es una
prctica comn. En la mayora de los estudios, algunos sitios de prueba se
abrasionan con un dispositivo adecuado (peine de acero, aguja hipodrmica,
escarificadores plstico, lancetas, etc.) debido a las diferencias conocidas en la tasa
de penetration de productos qumicos a travs de la piel intacta y desgastado. Las
abrasiones son slo incisiones menores a travs de la capa crnea (capa de clulas
muertas) y no suficientemente profundas para molestar a la dermis subyacente o
para producir sangrado. Un nmero adecuado de animales, 10 ratas o 5 a 6 conejos
por grupo de tratamiento, deben estar preparados. Con los animales ms grandes,
ms de una dosis puede aplicarse a un animal mediante el marcado de una rejilla
de cuadrados y el tratamiento de diferentes y/o adyacentes sitios de prueba intactos
y erosionados con la misma dosis. Es importante tener en cuenta que la epidermis
es muy variable, incluso dentro de una regin y un nmero adecuado de control, sin
tratar, o sitios tratados con vehculo deben dejarse a efectos comparativos.
El material de prueba, 0.5 ml de lquido o 0.5g de slido o semislido, se aplican a
un sitio intacto y uno descastado. El material se puede aplicar "solo" si es un lquido
o puede ser disuelto en solucin salina fisiolgica o, si es insoluble, suspendido en
1,0% de carboximetilcelulosa. El vehculo debe ser inerte o no reactivo. Disolventes
orgnicos deben evitarse a menos que se prev que el agente potencialmente
irritante se encontr en un disolvente tal, es decir, en un proceso o en el hogar
producto industrial, etc. Si se van a probar diferentes cantidades del agente, es
importante mantener el volumen aplicado constante (0,5 a 1,0 ml). El lquido debe
extenderse uniformemente sobre el sitio de la prueba con una varilla de vidrio. Los
polvos se pueden aplicar en seco o se transforman en una pasta espesa
Dado que el material debe permanecer en su lugar durante 4 horas despus de la
aplicacin, se utilizan cajas de restriccin para evitar que los animales se acicalen.
El sitio de prueba se ocluye con una gasa adecuada asegurada en su lugar con
cinta adhesiva. El tronco del animal de ensayo ser envuelto con una lmina de
plstico impermeable para mantener los parches en su lugar y para retardar la
evaporacin de lquidos voltiles. Al final del perodo de prueba, se quitan Al final
del perodo de prueba, se eliminan las almohadillas de gasas y hoja de plstico, el
material residual es limpiado con una gasa humedecida con agua tibia y jabn, y las
reas tratadas son evaluadas para edema y eritema a 1, 24, 48 y 72 h despus del

tratamiento. En un intento de hacer una prueba subjetiva ms cuantitativo, un

nmero de sistemas de puntuacin se han desarrollado para medir los grados de
enrojecimiento y la hinchazn, que se muestra en la Tabla 3.5 es el sistema
reportado en el Cdigo de Regulaciones Federales (1980) (McCreesh y Steinberg,
1983) y utilizada por la Organizacin de Cooperacin y Desarrollo Econmicos
(OCDE, 1981). El sistema de puntuacin consiste en la asignacin de nmeros
relativos que van desde la ausencia de eritema o edema hasta reacciones graves.
Las puntuaciones obtenidas por cada efecto en cada sitio de prueba (uno intacto y
uno sitio desgastado) se promedian para cada perodo de tiempo para cada animal
en cada grupo de tratamiento. Un subtotal de eritema se aade al subtotal para el
edema y la media del nmero de animales ensayados se determina para ceder una
puntuacin media de irritacin primaria a cada grupo de tratamiento, permitiendo
as el desarrollo de una relacin de buque efecto en tiempo de la dosis. Los detalles
de la normativa vigente de los distintos pases se encuentran resumidas en Rush et
al. (1995).
Una discusin completa de los graves defectos y peligros de esta prueba est ms
all del alcance de este libro, pero se puede encontrar describe en varios captulos
de la toxicidad drmica texto Marzulli y de Maibach (1987). La variabilidad de las
especies en la sensibilidad para registrar la irritacin es bien conocida, pero, casi
sin excepcin, el conejo albino fue un mejor predictor para la irritacin de la piel
humana (McCreesh y Steinberg, 1983). La aplicacin drmica de algunos 40
ingredientes cosmticos result en un grado de disminucin de la capacidad de
respuesta en el orden de conejo, cobaya, rata albina, humana y porcina (Motoyoshi
et al, 1979). Hay, como era de esperar, muchas excepciones a este orden de
respuesta. De hecho, el conejo con frecuencia parece demostrar efectos irritantes
superiores a los demostrados en los seres humanos, produciendo de este modo
respuestas positivas falsas. Si bien la tcnica Draize es eficaz en la identificacin
de irritantes fuertes, no es tan eficaz en la identificacin de agentes irritantes leves
o moderados, que conduce a la evaluacin errnea de algunos materiales
potencialmente peligrosos. Ha habido cierta controversia sobre la necesidad de
probar en la piel erosionada, y varios investigadores no han demostrado ninguna
correlacin entre la prueba en la piel desgastada de conejo y el potencial de
provocar irritacin primaria de la piel humana y poco o ningn efecto de la abrasin
en las puntuaciones de la irritacin total de valores (McCreesh y Steinberg, 1983;.
Nixon et al, 1975). Las diferencias en la capacidad de respuesta de la piel animal y
humana se han asociado con el uso del modelo animal ocluido, mientras que los
estudios en el ser humano no se llevaron a cabo bajo condiciones idnticas.
B. Sensibilizacin de la piel

Existe una reaccin drmica mediante el cual la exposicin a sustancias qumicas

(frmacos, cosmticos, productos para el hogar, plaguicidas, productos qumicos
industriales, etc.) provocan poca reaccin, pero despus de una exposicin drmica
repetida, se observa un efecto que se produce antes en el tiempo, es ms grave, y
persiste para una mayor duracin. Exposiciones posteriores, a pesar de semanas o
aos de diferencia, se traducen en una "alergia-como," reaccin tarda en toda regla
a la sustancia qumica (s). Con frecuencia, la reaccin puede ser provocada por
concentraciones mucho ms bajas de agente (s) y en reas de la piel distintos de
los implicados en el contacto inicial. El patrn de esta condicin cutnea es
sugerente de una alergia en desarrollo. Tras la penetracin de la piel, se sabe que
tales productos qumicos, llamados haptenos, reaccionan de forma covalente con
ciertas protenas portadoras, formando "antgenos completos" que las aves a las
membranas de las clulas de Langerhans en la epidermis o a los macrfagos,
iniciando as el proceso de formacin de anticuerpos as como el sistema
inmunolgico "memoria".
Las clulas de Langerhans expresar el reconocimiento inmune (antgeno Ia) y tienen
receptores para la IgG y C3 en su superficie celular. Ellos son capaces de absorber
las molculas pequeas y pueden metabolizar estos a metabolitos reactivos y
posiblemente ms haptnico, lo que puede explicar por qu estas clulas aumentan
en nmero en las zonas que muestran reacciones alrgicas (Patrick y Maibach,
1994). La exposicin cutnea posterior a la misma o un producto qumico
estrechamente relacionado, incluso a dosis bajas, se disparar una respuesta
alrgica.
Invariablemente, el animal de ensayo utilizado para estudios de sensibilizacin de
la piel es el conejillo de indias. Un nmero de procedimientos de ensayo han sido
descritos por diversos investigadores, sino que todos son similares en que se realiza
un intento para construir la respuesta inmune mediante la aplicacin repetida
(drmica o la inyeccin intradrmica) a afeitarse regiones de la piel durante un
perodo de 14 d. El tratamiento con concentraciones bajas o moderadas del
producto qumico en un vehculo adecuado puede de da o en un rgimen de 4 o 5
das por semana. Este periodo de tratamiento es seguido por un perodo de
descanso de 10 a 14 das. Un reto de la dosis por lo general una menor
concentracin tan utilizado como un sensibilizador-dosis se aplica a un sitio de
prueba sin tratar fresca y las reacciones a la sustancia qumica se califican en los
fundamentos de la incidencia de animales que responden y la severidad de la base
de la respuesta del don esquema que se presenta en la Tabla 3.5 a los 24, 48 y 72
h despus del tratamiento. A mayor reaccin (edema, eritema) despus de la dosis
difcil, cuando se compara con que despus de la dosis de sensibilizacin, es
indicativo de la sensibilizacin.

Como se ha descrito anteriormente, el estudio de sensibilizacin puede llevarse a

cabo ya sea abierta y descubierta o ocluida. Las cantidades ms pequeas de
lquidos, aplicados por va tpica o inyectados, plantean menos problemas que las
utilizadas en los estudios de irritacin primaria, pero polvos y slidos semi
generalmente se ensayaron mediante la tcnica ocluido. Con el fin de saber que el
sistema de ensayo est funcionando, un grupo control positivo, se trat con tales
alergenos conocidos como 2,4-dinitroclorobenceno (DNCB), p-nitrosodimetilanilina
(NDMA) o p-fenilendiamina (PPDA), siempre ser incluido. Una dosis de exposicin
de la sustancia qumica se administra despus de un perodo de descanso
adecuado. Una variante de la prueba de sensibilizacin estndar es uno que incluye
inyecciones intradrmicas de adyuvante completo de Freund para mejorar la
sensibilidad mediante la estimulacin de la respuesta general de anticuerpos. La
seleccin cuidadosa de las dosis de sustancia de ensayo y de adyuvante de Freund
es esencial para evitar la confusin entre las respuestas de los animales a cada
agente.
Una variante de la prueba de sensibilizacin anterior es la prueba de parche cerrado
desarrollado por Buehler( 1964). La prueba es lo suficientemente sensible para
detectar de una moderada a fuerte sensibilizacin y la probabilidad de un resultado
falso positivo es baja. La metodologa ha sido modificada y adaptada varias veces,
la mejor descripcin del protocolo que se est dada por klecak( 1983). Los flancos
y espaldas de igual nmero de varones y hembras (n= 20 en los grupos
experimentales; n = 10 en el grupo de control; n = 4 en el primer grupo irritante) se
recortan para proporcionar sitios de prueba de 2 x 2 cm. Un volumen de 0,4 ml de
una concentracin apropiada de solucin recin preparada, suspensin, o emulsin
del agente de ensayo o el vehculo se aplica 20x 20 mm
WEBRIL en un vendaje o cinta Blenderm de 37 x 40 mm, lo que se aplica al sitio de
prueba en el animal llev a cabo en un devie especial de restriccin y el parche se
ocluye con un dique de goma dental tensada y fijada a la parte inferior de la
inmovilizacin con clips.

Los parches se dejan en su lugar durante 6 horas despus se retiran y el material

residual se lava antes de devolver a los animales a sus jaulas. En los das 7 y 14
despus de la exposicin inicial, con el parche cerrado (material de prueba o
vehculo) se repite en los animales experimentales y de control. A los 14 despus
de la ltima exposicin (28 das despus de la exposicin inicial); los animales de
experimentacin son desafiados durante 6 h con parches que contienen
concentraciones del material de ensayo como se describe anteriormente. Al final del
perodo de tratamiento, se retiran los parches, los sitios de prueba se lavaron libres

de agente residual, las reas se depilan, y los sitios se evaluaron visualmente a las
24 y 48 h despus del tratamiento. La incidencia y la intensidad de la respuesta
eritematosa se calculan, con cualquier sensibilizacin significando respuesta.
Actualmente, unas siete pruebas, todas son usadas en el conejillo de indias, fueron
aceptadas por la CEE, (cuadro 3.6) todos estas son ligeras variantes de las pruebas
descritas en detalle anteriormente (botham et al., 1991; patrick y malibach, 1994).
Los conejillos de indias se utilizan debido a su susceptibilidad conocimientos a la
amplia variedad de sensibilizadores qumicos. La aceptacin de CEE se basa en la
validez la exigencia de pruebas de ensayo de respuesta esperada a alergenos
estndar (2.4- dinitrocholorobenzene o fenilendiamina p-). Agentes se aplican por
va tpica o por va intradrmica, con o sin adyuvante de Freund, la piel se deja
expuesto. Breves detalles figuran en el cuadro 3.6, con explicaciones completas de
las tcnicas individuales que se encuentran en patrick y Maibach (1994).
Aplicaciones sitios se examinan para eritema y edema a las 24, 48 y 72 horas
despus del tratamiento, el dimetro (mm) del sitio eritematosa y los pliegues
cutneos (mm) sobre el sitio que se est cuantificaron por regla o calibracion. Por
desgracia, todos estos mtodos de ensayo son empricos en su diseo y la subjetiva
en sus medios de evaluacin (botham et al, 1991), es esencial que se desarrollaran
ms objetivos, mtodos de ensayo inmunolgico de predecir la sensibilizacin de
contacto retrasada, particularmente mtodos dbiles, as alrgenos fuertes. Sin
embargo, estos mtodos an requieren el uso de animales, ya que, hasta ahora, no
hay adecuada en sistemas de Vitro que imitan la complejidad de la reaccin
inmunolgica implicada en la dermatitis de contacto.

La prueba de oreja de ratn hinchazn (MEST) fue desarrollado como un anlisis

precisos, sensibles y alternativos para evaluar la sensibilizacin (figura 3.9) (Gad et
al., 1986). La prueba incluye: (1) una fase de induccin, con la aplicacin tpica del
agente de prueba en el lquido en un estrechamente recortado-, sitio abdominal
adecuado, cinta despojado durante 3 das consecutivos, secando el sitio
rpidamente con una secadora elctrica y (2) una etapa de desafo en el da 10, con
la aplicacin tpica de la sustancia de ensayo y vehculo a la otra, y otra vez, secar
el material rpidamente. Los thicknees odo se mide por micrmetros a las 24 y 48
h despus de la exposicin. Durante la validacin, el MEST identific correctamente
71 de las 72 sustancias como potentes sensibilizadoras. La deteccin de haptenos
dbiles se puede mejorar mediante el uso de la piel erosionada (Botham et al., 1991)

Imagen 1: La prueba de odo hinchazn del ratn (MEST) fue desarrollado como un
aasay rpida deteccin de sustancias qumicas drmicos sensibilizacin. la fase
indution requiere que agente de ensayo se aplica tpicamente a l se afeit la piel
abdominal de los ratones, acompaado por inyecciones intradrmicas diarias de
adyuvante completo de Freund (FCA) durante 3 das consecutivos. Siete das ms
tarde, en el periodo de exposicin, los agentes de prueba se aplica a una oreja, con
el vehculo que se aplica a la otra, con los thicknees odo que se miden por
micrmetro a las 24 y 48 h despus de la exposicin.

Imagen 2: Sensibilizaciones cutneas por productos quimios pueden ser probados

por el ensayo del ratn local de los ganglios linfticos (LLNA) el agente de prueba
en un vehculo adecuado, es aplicable a la superficie dorsal de la oreja de ratn 3
das consecutivos. A los 2 das despus de la ltima exposicin, los ratones reciben
una inyeccin intravenosa de timidina tritiada o timidina metil los animales se

sacrificaron 5 das despus, con la escisin de los ganglios linfticos auricular y la

preparacin de lavados suspensiones de clulas individuales de linfocitos.
Ms recientemente, un ensayo de sensibilizacin prometedor, el ensayo de ganglios
linfticos locales de murino (LLNA), se ha desarrollado, basndose en una
respuesta inmunolgica a agentes. El protocolo utiliza 8 a 12 semanas de edad
ratones tratados al da durante 3 das consecutivos por aplicacin tpica (25
microlitros) de la sustancia problema en el dorso de ambos odos. Los vehculos de
eleccin incluyen acetona-aceite de oliva (4: 1), dimetilformamida, metiletil cetona,
propilenglicol, y dimetilsulfxido. Cinco das despus del primer tratamiento, los
ratones recibieron una inyeccin (iv) de 250 microlitros de solucin salina
tamponada con fosfato que contena 20 uCi de timina 3H-metilo o 3H-timidina. Se
sacrificaron los ratones 5 das ms tarde y los ganglios linfticos de drenaje
auriculares se extirparon, se agruparon y se prepararon en suspensiones de clulas
individuales de clulas de ganglios linfticos (LNC) pasando a travs de una malla
de 200-pantalla de acero inoxidable. Las LNC reunidas se centrifugaron, el
sedimento se lav dos veces con solucin salina tamponada y se resuspendi en
3,0 ml de cido tricloroactico (TCA 5%). Despus de la incubacin durante la
noche, el precipitado se recuper en la centrifugacin, se re suspendi en 1,0 ml de
TCA y se transfiri a 10 ml de fluido de centelleo para el recuento de centelleo-beta.
la respuesta proliferativa de la LNC sobre el valor de control (relacin T / C) en LNC.
La respuesta proliferativa de la LNC sobre el valor de control (relacin T / C) en
LNC. Los productos qumicos fueron considerados como sensibilizadores en la
relacin T / C fue 3 o mayor en una o ms de las concentraciones de sustancia de
ensayo. Varios trabajos han examinado la validacin de esta prueba, con productos
qumicos que han sido evaluados en el ensayo de maximizacin humana, los
resultados que identifican correctamente los sensibilizadores humanos, as como
aquellos que no causan sensibilizacin contacto retrasado.
C. Reacciones foto-alrgicas
Una variedad de productos qumicos (halogenado salicilanilidas, sulfonamidas,
tiazidas, fenotiazinas, clordiazepxido, griseofulvina, ciclamatos, hexaclorofeno,
diclorofeno, Ambrette), cuando se aplica por va drmica o ingerida por un individuo
que posteriormente se expone a la luz solar, provoca una reaccin de tipo alrgico,
que se manifiesta en forma de urticaria inmediata (erupcin), un edema persistente
o una erupcin papular retrasada. Con frecuencia, hay una implicacin de las zonas
de la piel ms all del sitio expuesto, reagudizacin de los sitios expuestos
previamente despus de la irradiacin ultravioleta de otro sitio los productos
qumicos que suscitan este tipo de reaccin todas las fuentes de luz solar o artificial
que tiene longitudes de onda inferior a 320 nm. Mientras que la piel impide la
penetracin de longitud de onda corta (<250 nm) luz UV, los que tienen longitudes

de onda en la regin de 275-325 nm pueden ser absorbidos a la profundidad de los

capilares sanguneos que llevan el agente potencialmente txico. La activacin
inducida por la luz, resulta de la unin covalente de este intermedio reactivo con las
protenas celulares y plasma para producir antgenos que estimulan la formacin de
anticuerpos. Las reacciones de urticaria inmediatas despus de la exposicin a la
luz solar se consideran ser mediadas por anticuerpos, mientras que las erupciones
retardadas y edematosas se consideran estar relacionadas con la capacidad de
respuesta inmune mediada por clulas.
En la realizacin de reacciones fotoalrgicas, el conejillo de indias o el conejo son
la especie elegida. En la mayora de los casos, pequeas cantidades del agente de
prueba sern administrados por va sistmica (oral o por inyeccin intravenosa)
durante 10 a 14 das como se requiere en un estudio de sensibilizacin. La
aplicacin drmica de los agentes tambin es posible. Despus de un perodo de
descanso de 14 a 21 das, los animales sern desafiados con una dosis de la
sustancia de ensayo y se exponen a la luz de una longitud de onda apropiada en un
rea de piel estrechamente afeitada. El truco en este tipo de estudios es encontrar
una fuente de luz que va a generar las longitudes de onda deseadas. Los
conocimientos relativos a la absorcin de la luz por la qumica ser crucial para el
experimento. Tambin sera importante realizar un grupo de control positivo de los
animales a travs del procedimiento, usando un foto-alergeno conocido. La
marcacin del eritema se puede hacer usando un esquema similar al que se
muestra en la Tabla 3.5 Los detalles de este tipo de estudio se analizan por Harber
et al 1983.
D. reacciones fototxicas
La fototoxicidad es mucho ms comn de lo que las reacciones foto-alrgicas y
comprende una amplia variedad de agentes qumicos, las caractersticas principales
de los cuales incluyen sistemas de anillos de benceno extensas en la estructura.
Estos productos qumicos incluyen frmacos de uso comn (fenotiacinas,
sulfonamidas, sulfonilureas, tiazidas, tetraciclinas), productos qumicos industriales
(alquitrn de hulla, fenantreno, antraceno, piridina, pireno), colorantes
(antraquinona, derivados del cido aminobenzoico), y otros agentes diversos.
teoras actuales sugieren que, en presencia de luz UV de longitud de onda
adecuada (<320 nm), las molculas qumicas se convierten en intermedios reactivos
que provocan toxicidad drmica local, celular que se manifiesta en la forma de un
eritema retrasado y la hiperpigmentacin, seguido de descamacin
(desprendimiento o escalar) de la piel.
E. alternativa en las pruebas in vitro drmicos

En el espritu de las "3 erres", un considerable esfuerzo se ha dedicado por la

industria en el desarrollo de mtodos de ensayo in vitro para evaluar la toxicidad
drmica potencial de una amplia gama de mezclas qumicas, incluyendo cosmticos
(perfumes, colonias, lociones, polvos), personal ( jabones, bao, geles, champs,
desodorantes) y el hogar (detergentes, limpiadores, ceras, pinturas, disolventes)
agentes de mantenimiento, pesticidas con sus emulsionantes y co-disolventes,
productos qumicos industriales, etc., todos los cuales estarn en contacto con la
piel a travs del uso o una salpicadura accidental. En la ltima dcada y, ms
importante an, en los ltimos 5 aos, ha existido una proliferacin de tcnicas in
vitro diseados para poner a prueba los materiales anteriores. Se remite al lector a
los captulos relevantes en una serie de libros recientes que presentan una visin
general sobre este tema, entre ellas las de Frazier (1992), Barile (1994), Gad (1994),
y Salem (1995), as como las actas publicadas de las reuniones (Rheinhard et al,
1985; Compra y Conning, 1986). como se dijo anteriormente, mayor inters en estos
mtodos alternativos in vitro ha sido impulsado en gran medida por la Directiva CE
relativa a la prohibicin de la venta, en los pases miembros, de todos los cosmticos
que han sido probados en animales despus de 1998 (CEE, 1995). A partir de la
literatura, es bastante evidente que la industria de productos personales y cuidados
en el hogar ha liderado el camino, muy por delante de las respuestas de los
organismos reguladores.
Los ensayos in vivo de la toxicidad drmica estn diseados para evaluar
objetivamente el eritema (enrojecimiento) y edema (hinchazn), tanto indicativa de
la inflamacin, as como escaras (lesiones en profundidad celular) (Tabla 3.5). Los
nuevos sistemas de prueba estn desarrollando a partir de cultivos de clulas
primarias, lneas celulares finitas y continuas, a travs de ms complejos
equivalentes de piel humana, en pedazos explantados y mantenidos de la piel de
mamferos (Barile, 1994). Existe cierta coincidencia entre las pruebas cutneas y
los que se utilizan para evaluar la toxicidad ocular. Qu criterios de valoracin se
debe utilizar para sistemas in vitro, con eritema y edema de ser los nicos aspectos
visuales del complejo proceso de la inflamacin?
Las lneas celulares utilizadas en los ensayos de citotoxicidad in vitro
Origen
Acrnimo
Tipo Celular
Human, cuello uterino
HeLa
Continuo
Humana, epitelial de
A549
Continuo
pulmn adulto
Humana, traquea
HEP2
Continuo
Humana, hgado
Hgado Chang
Continuo
Humana,
tumor
KB
Continuo
epidermoide

Humana, queratinocitos
XB-2, NHEK, HPKII
epidrmicos
Fibroblastos de pulmn
HFL1, WI-38, IMR-90,
embrionario en ratn
MRC-5
suizo
Fibroblastos de embrin
3T3
en ratn suizo
Linfoma en Ratn
L5178
Neuroblastoma en Ratn C1300
Ovario en Hamster Chino CHO
Pulmon de Hmster chino V79
Rin canino
MDCK, LLC-PK
Tabla 3.7: Modificado de Frazier (1992) y Barile (1994).

Continuo
Finito
Continuo
Continuo
Continuo
Continuo
Continuo
Continuo

Los puntos finales de toxicidad abarcan citotoxicidad e incluyen: (1) permeacin de

la membrana por los productos qumicos (2) dao de la membrana plasmtica con
prdidas de protenas citoplasmticas y cambios en la conductividad elctrica y (3)
Efectos sobre orgnulos subcelulares y el metabolismo celular. Todas estas
pruebas han sido diseadas para ser cuantificable, para proporcionar "nmeros"
reproducibles relacionados con las concentraciones de las sustancias de ensayo,
evitar las evaluaciones tanto irregulares, cualitativos y subjetivos asociados con las
pruebas in vivo. Otras pruebas, los que implican el uso de queratinocitos que
comprenden 95% de la masa de clulas epidrmicas, estn diseados para
cuantificar la seal de liberacin de factores quimiotcticos tales como el cido
araquidnico y mediadores de tipo de los eicosanoides
(prostaglandinas,
interleucinas, leucotrienos, etc.) liberado durante la fase inflamatoria. (Muller-Decker
et al., 1994) Adems de la deteccin de seguridad de los productos, muchos de
estos mtodos se pueden utilizar para estudiar mecanismos por los que los agentes
provocan toxicidad drmica. En esto, la seleccin de las tcnicas est determinada
por las preguntas especficas que se le pregunte, la flexibilidad para colaborar de
estos mtodos que permiten algunas de las preguntas que hay que responder con
eficacia.
1. Prueba de citotoxicidad
La citotoxicidad, por lo general incluyendo mediciones ms directas de penetracin
celular o biomarers de fugas celular, ha sido un punto final focal para varias tcnicas
in vitro. Pruebas citotxicos simulan la lesin al epitelio humano durante perodos
de exposicin que sean realistas para la toxicidad aguda. (Barile, 1994) Las clulas
se expusieron a diferentes concentraciones de agente de ensayo durante perodos
de tiempo predeterminados (hasta 24 h), seguido de la evaluacin de la viabilidad y
funcin. Criterios para estas pruebas incluyen: (1) las concentraciones de sustancia
de ensayo relacionadas con las concentraciones sanguneas txicas o letales

humanos; (2) cambios en la viabilidad (el crecimiento celular, la proliferacin,

morfologa); (3) alteraciones en el metabolismo celular; (4) integridad de la
membrana, con fugas de los marcadores de istopos o enzimas citoslicas
constituyentes; (5) alteraciones en la funcin de los orgnulos subcelulares; y (6) la
histologa y tincin inmunoqumica de protenas, enzimas, carbohidratos, protenas,
etc. Una lista de algunas de las lneas celulares utilizadas en tcnicas de cultivo se
muestra en la Tabla 3.7, e incluye tanto las clulas capaces de crecer en cultivo en
suspensin y los que son dependientes de anclaje, lo que requiere la unin a una
matriz de plstico de polietileno.
Una lista de los sistemas de ensayo de cultivo de clulas se muestra en la tabla 3.8,
incluyendo una indicacin del punto final objetivo, y los mecanismos de la prueba.
Si bien muchos de estos ensayos se llevan a cabo con clulas sumergidas en
frascos de cultivo, que se prestan a la multi-pared marcos y anlisis
espectrofotomtrico automatizado de tinte de color tomado (o liberado o excluidos)
o de productos de reaccin de color formadas a partir de sustratos y reactivos tanto
dentro de las clulas y fuera en el medio.
2. Prueba no biolgica
En contraste con los sistemas anteriores, el mtodo de prediccin vitro irritacin en
sabe como el sistema de Skindex utiliza, sustancias inertes no biolgicos. Este
modelo basado bioqumicamente es una cubeta de dos compartimentos dividido
horizontalmente por una membrana de barrera queratina / collagent (una
biomembrana) con un tinte rojo adjunto, la cmara inferior que contiene una matriz
macromolecular ordenado que contiene componentes lipdicos.
Las sustancias de ensayo, aadidos a la capa superior de lquido en forma de
lquidos, emulsiones o slidos, puede provocar alteraciones en la membrana de
barrera, causando la liberacin de colorante en una manera dependiente de la
concentracin en la cmara inferior donde se puede cuantificar. La penetracin de
agentes txicos a travs de la biomembrana tambin puede resultar en la ruptura
de la conformacin de la matriz macromolecular causando opacidad, con una
reduccin en la transmisin de luz para producir "unidades" de irritacin descrito
como el ndice potencial de de irritacin drmica o PDII. Considerado para ser
comparable a alteraciones en vivo en el estrato crneo, los resultados in vitro para
ms de 530 sustancias de prueba estudiados en la piel de conejo han arrojado
reproducibilidad con desviaciones estndar de validacin ans 5 a 8% con el vivo
puntuacin Draize en conejos con correlaciones de 80 a 89%. El sistema SKINTEXT
parece sensible en la capacidad para predecir el potencial irritantt de sustancias
para el ser humano (82% de sensibilidad, 82% y valor predictivo positivo).

Tabla 3.8 Sistemas de prueba alternativos para evaluar la irritacin drmica

utilizando cultivos celulares
Prueba

Valoracin

azul tripn

Viabilidad celular

Captacion de rojo
neutro

Viabilidad celular

Kenacid azul, azul

de Coomassie

Viabilidad celular

mtodo de Lowry

Viabilidad celular

Punto final de la
Mecanismo
prueba
Azul en las clulas El colorante se
muertas o
excluye de clulas
daadas
viables y entra en
las defectuosas
Medida de NR50
Un tinte supravital
la concentracin
que est
que reduce la
secuestrado slo
absorcin de
en las clulas
colorante en un
viables y retenido
50% en
por membranas
comparacin con
lisosomales
los niveles de
control
Cuantifica la
Sobre la base de
concentracin
la relacin entre la
total de protenas
medida de la
intracelulares.
protena total, el
Determinar la
nmero de
reduccin de IC
clulas, y la unin
50 en protenas en de la mancha
comparacin con
los niveles de
control
La concentracin
Mida la protena
de protena, la
celular total, los
determinacin de
residuos de
un IC50 para la
prolina, despus
reduccin de la
de la lisis de
protena en
clulas en buen
comparacin con
estado intactas
los niveles de
despus de la
control
exposicin al
agente de prueba

3. Prueba de sustancias inflamatorias

Irritacin de la piel consiste en algo ms que la citotoxicidad, siendo un proceso
complejo con queratocitos que actan como receptores y transductores de seal
primaria, la conversin de los estmulos exgenos en seales endgenas con la
liberacin de mediadores proinflamatorios como aicosanoids y citoquinas. Los

queratinocitos parecen jugar un papel clave en la induccin y el control de las

respuestas inflamatorias y comunicados de seal por tales clulas deben
proporcionar homlogos in vitro de irritacin, es decir, el cido araquidnico se
transforma en prostaglandinas (PGE2, PGF2, PGD2) sus productos metablicos
(cidos hydroxieicosatetraenoic , 5, 8, y 15-HETE), y las citocinas (interleucina-1 o
IL-1).
(clulas HPK II) queratocitos humanos inmortalizadas se han evaluado en cultivo
sumergido tras la incubacin con 14 sustancias qumicas diferentes que van desde
las sales de metales mediante disolventes, detergentes, alquilamidas y fenol,
midiendo la liberacin del agente estimulada de cido araquidnico, PGE2, PGF2,
5- HETE y la IL-1 mediante cromatografa lquida de alta presin. Aunque se
observ una variabilidad considerable entre los productos qumicos, los resultados
mostraron que los queratinocitos humanos in vitro respondieron a los productos
qumicos de la potencia de irritacin graduada con una liberacin gradual de
mediadores proinflamatorios.
La medicin de mltiples puntos finales mediador dio lugar a una mejor
caracterizacin de una sustancia de ensayo que hizo la evaluacin de un solo
parmetro. Parecera que cualquier ensayo in vitro que contiene queratinocitos o
fibroblastos podra ser engatusado para liberar mediadores qumicos, aadiendo
otros criterios de valoracin para la evaluacin de los posibles irritantes. La
liberacin de (3H) cido araquidnico a partir de una lnea celular de fibroblastos de
murino premarcaron (C3H-10T 1/2 clulas) in vitro, en respuesta al tratamiento con
agentes tensioactivos aninicos, sugiere un enfoque til para las pruebas de
irritacin drmica.
Tabla 3.9 Ensayos equivalentes a tejidos humanos para la irritacin cutnea
Prueba
SKIN ZK1200

Fuente
Advanced Tissue
Science (La jolla, CA)

SKIN ZK1300

TESTSKIN

Organogenesis
(Cambridge, MA)

Descripcin
Dermis neonatales
Humanos (prepucio)
fibroblastos -derivado
cocultured con capas de
queratinocitos
epidrmicos neonatales
en una matriz de nylon
de malla
Comparable a la anterior,
pero que contiene un
estrato crneo
Fibroblastos drmicos
neonatal humano
sembradas en una matriz

de colgeno-gel bovina
cocultured con
estratificadas
queratocitos epidrmicos
humanos neonatales
4. Pruebas equivalentes de piel humana
Por lo menos dos modelos in vitro, conocidos como equivalentes de piel humanos,
estn disponibles en el mercado, ambos casos se acerca a la complejidad de la
tricapa, piel viva de mltiples funciones (Tabla 3.9). Las fotomicrografas
transversales teidas de estos sistemas de cultivo celular muestran un extrao
parecido a la piel real de mamferos, con una capa idntica a una capa crnea que
est por encima capas similares a las clulas de la epidermis y las clulas basales
que forman una dermis (Osborne y Perkins, 1994; Weideman, 1995). Un diagrama
esquemtico de la dos cmaras, plstico, "plato" cultivo utilizadas en el sistema
TESTSKIN se muestra en la Figura 3.11. Las sustancias de ensayo, lquidos o
slidos, se pueden aadir al pocillo en la cmara superior, de este modo entran en
contacto con un "estrato crneo", con penetracin en las capas de clulas y/o a
travs del medio en la cmara baja de la que muestras del medio se puede quitar
para su anlisis. El dao a las capas de clulas organizadas puede ser monitoreado
por la absorcin de colorante/tcnicas de exclusin fluorescente o mediante la
fijacin, tincin y examen microscpico. En un reciente estudio comparativo de los
modelos de la Skin y TESTSKIN, el conjunto de puntos finales medidos
(citotoxicidad -neutro captacin de rojo, la tincin de colorante vital MMT, liberacin
de lactato deshidrogenasa y N-acetil glucosaminidasa, utilizacin de glucosa,
liberacin de mediador inflamatorio-prostaglandina E2) mostr una buena
correlacin entre el comportamiento de las sustancias de ensayo en los modelos in
vitro e irritacin de la piel humana in vivo (Osborne y Perkins, 1994). Los cidos y
las bases, agentes incompatibles con los modelos de cultivo sumergido, tuvieron un
buen desempeo con el modelo TESTSKIN .
Pie de imagen 3.11
Diagrama esquemtico de la ya preparada, dos cmaras, placa de cultivo de
plstico del sistema TESTSKIN (Organognesis Inc., Cambridge, MA) que
contiene el complejo equivalente de piel viva (LSE). Un medio que contiene el
agente(s) de prueba puede ser aplicado a la superficie de la LSE y la penetracin
en o a travs de las capas de dermis puede ser monitoreada por absorcin de
colorante fluorescena o por la remocin de alcuotas de la capa media para anlisis.
El LSE puede fijarse, seccionarse y teirse para el examen microscpico.
5. Isolated Perfused Porcine Skin Flap (IPPSF)
Una nueva tcnica de estudiar la absorcin percutnea se ha desarrollado utilizando
la dermis epigstricos regin de cerdos destetados, adecuados debido a la

presencia de la vasculatura directa, cutnea - la arteria epigstrica superficial caudal

y su emparejado venas concomitantes (Riviere et al, 1986;. Montiero- Riviere et al,
1987;. Carver et al, 1989). Un aislado, de un solo pedculo, se crea axial de patrn
aleta quirrgicamente in situ, produciendo un colgajo tubed que encierra los
recipientes mencionados anteriormente, la preparacin se aisl 2 a 6 ms adelante
D con la canulacin de la arteria y una de las venas concomitantes y la transferencia
de una cmara de perfusin aislada. En la cmara, los colgajos de piel permanecen
viables durante 10 a 16 h de acuerdo con los criterios de vigilancia establecidos
(Montiero- Riviere et al., 1986). El sistema se presta a una farmacocintico enfoque
basado en el fisiolgico, (PBPK) para el modelado de la penetracin drmica y la
toxicidad de los productos qumicos lquidos o agentes en solucin acuosa o no
acuosa, con la cuantificacin en el medio de perfusin y evaluacin de los cambios
relacionados con el agente en la resistencia vascular y la liberacin de enzimas de
las clulas daadas en el medio de perfusin (Williams et al., 1990). Al examen con
una de las capas de tejido permite la deteccin de cambios morfolgicos sutiles
(Rey y Montiero-Riviere, 1991).
Cabe sealar que esta tcnica no es para los dbiles de corazn. Tanto las tcnicas
quirrgicas y la perfusin, pesadilla esta ltima una de plomero, requieren
habilidades y prctica considerables. Aunque no es un procedimiento de prueba de
rutina, los resultados son comparables a los producidos in vivo en la misma especie.