BIOLOGIA MOLECULAR

ESTUDO DIRIGIDO REA 1

1. A replicao do DNA dita semiconservativa, pois cada nova molcula de DNA
contm uma fita de DNA parental e uma fita de DNA recm-sintetizada.
2. As DNA polimerases (DNAp) so enzimas necessrias em todos os organismos,
tanto para a replicao do DNA quanto para os processos de reparao do
DNA. Diferentes processos metablicos so realizados por DNAp especficas.
DNA-replicase a que realiza a sntese das duas novas fitas de DNA.
As DNAp de todos os organismos realizam a mesma reao enzimtica:
incorporao de nucleotdeos trifosfatados na extremidade 3-OH livre,
sintetizando a fita nova no sentido 5->3. Antes desta enzima comear a
incorporao de bases, necessrio incialmente a sntese dos primers pela
primase. A seleo do nucleotdeo a ser adicionado depende somente da
complementariedade de bases da fita molde.
As DNAp bacterianas, alm da atividade de sntese tambm possuem
atividade de exonuclease (remoo no sentido 3->5 de nucleotdeos
adicionados incorretamente na nova fita), mecanismo tambm chamado de
correo de erro, j que permite que a prpria DNAp remova o nucleotdeo
com pareamento incorreto. Alm disso, existe a atividade de exonuclease 5>3, que remove blocos de nucleotdeos ocorre em caso de quebra da ligao
fosfodister.
DNAp em E. coli: I, II, III, IV, V.
DNAp em eucariotos: , , ; maior n envolvidas na replicao.
3. A sntese da fita descontnua realizada de forma interrupta a partir de
vrios iniciadores, sendo polimerizada em diversos fragmentos fragmentos
de Okazaki. A sntese de cada um destes fragmentos realizada pela primase,
e sua polimerizao pela DNAp III continua at que encontre a regio 5fosfato do fragmento anterior, quando a DNAp III se dissocia da fita
descontnua. Ento, a DNAp I remove o iniciador e a DNA-ligase une os
fragmentos de Okazaki para formar a fita descontnua.
4. a)
Pois a DNAp III s realiza a adio de nucleotdeos para a sntese do
DNA no sentido 5->3. Assim, as duas regies recm-sintetizadas de cadeias
nucleotdicas devem crescer em sentidos opostos, uma na direo 5-3 rumo
forquilha de replicao (fita contnua) e outra tambm na direo 5-3,
mas em direo oposta forquilha (fita descontnua). A nova fita cresce na
direo 5-3, antiparalela a fita parental.
b)
extremamente importante para um organismo que a seqncia de
DNA seja replicada com o menor numero possvel de erros. Para garantir a
fidelidade na replicao, a DNAp III possui a atividade de exonuclease 3-5.
medida que cada nucleotdeo adicionado cadeia, a DNAp III faz uma
checagem parra assegurar-se de que o nucleotdeo adicionado o correto,
caso contrrio, a atividade exonuclease 3->5 edita o erro. A atividade de
reviso necessita de uma exonuclease que se mova no sentido 3-5 e remova
hidroliticamente o nucleotdeo no-pareado, pois a exciso deve ser realizada
no sentido inverso ao da sntese.
5. Estrutura de um nucleotdeo: Pentose (Desoxirribose ou ribose) + base
nitrogenada (A, T, C, G, U) + um, dois ou trs grupos fosfatos.

Como esto organizados no DNA? O cido desoxirribonuclico (DNA) um

polmero composto por unidades de desoxirribonucleotdeos. H ligaes
fosfodister em direes opostas nas duas fitas (anti-paralelismo) e pareamento
das pontes de H entre as bases (A=T, CG) o que leva a complementariedade
propriedade do DNA no qual uma base prica (A/G) sempre se liga a uma
pirimdica (T/C/G).
6. Desnatura e renatura...
7. Conceito de gene: seqncia de nucleotdeos necessria para a sntese de um
RNAm (a ser traduzido) ou RNA estvel (RNAr, RNAt...)
Estrutura bsica:
Regio codificadora: seqncia nucleotdica que codifica o
produto
Seqncias reguladoras: flanqueiam a regio codificadora
controlando a sua expresso
Em um gene procaritico tpico, as seqncias reguladoras que
controlam a sua transcrio encontram-se em posies adjacentes
regio codificadora. As sequencias reguladoras da transcrio
mais fundamentais so o promotor, a 5 da regio codificadora, e o
terminador, a 3. O promotor o sitio no DNA onde a RNAp se liga.
O terminador a sequencia nucleotdica que determina a
dissociao da RNAp da fita molde e o final do processo de
transcrio. Alm disso, tambm podem estar presentes outros
elementos reguladores, que so stios de ligao de protenas
ativadoras ou repressoras da transcrio. (ver desenho do livro)
8. Um peron uma unidade fundamental do genoma procaritico, na qual duas
ou mais regies codificadoras de um produto gnico (de RNA ou proteico)
ocupam posies adjacentes, esto coorientadas e tem sua transcrio
controlada por um mesmo conjunto de sequencias reguladoras. As diferentes
regies codificadoras presentes em um peron so cotranscritas em um nico
produto de RNA, chamado assim de policistrnico. A organizao em perons
proporciona uma economia em espao no DNA, que relevante para os
genomas relativamente pequenos e compactos de procariotos.
Em procariotos, a regulao da expresso genica ocorre principalmente
no nvel transcricional. Em geral, mediada pela ligao de protenas de ao
trans a elementos reguladores de ao cis na molcula nica de DNA
(cromossomo). Nas bactrias, os genes estruturais que codificam as protenas
envolvidas numa determinada via metablica encontram-se com freqncia
agrupados seqencialmente no cromossomo, junto a elementos reguladores
de ao cis que determinam a transcrio destes genes. A transcrio produz
um nico RNAm policistrnico. Dessa forma os genes so controlados
coordenadamente, ou seja, acionados ou desligados como uma unidade. Esse
pacote inteiro referido como um peron.
Seus produtos so regulados pela presena de substrato.
Obs.: Bactrias no tm organelas.
Definio da prof: peron uma unidade de agrupamento de genes
que codificam produtos com funes relacionadas, estando sobre o controle
de uma nica regio reguladora.

9. Colineariedade a correspondncia entre a seqncia de nucleotdeos do

DNA e do RNA com a seqncia de aminocidos de uma protena. O n de
nucleotdeos no gene proporcional ao n de aminocidos na protena.
Em bactrias, a seqncia de aminocidos de um polipeptdio corresponde
exatamente seqncia de bases do segmento de DNA que foi transcrito para
o RNA.
Cientistas costumam dizer, por isso, que em bactrias h colinearidade entre
as cadeias polipeptdicas e os segmentos de DNA que as codificam (pela falta de
ntrons)
Outra definio: Equivalncia entre a seqncia nucleotdica do gene e a
seqncia de aminocidos da protena. Eucariotos possuem interrupes em
suas seqncias nucleotdicas.
Colinearidade: Gene Protena 3n nucleotdeos n aminocidos
10. Ortlogos: so genes e produtos gnicos (incluindo protenas) de espcies
diferentes que possuem homologia identificvel com genes e produtos gnicos
correspondentes de outras espcies. A ortologia decorre do fato destas
espcies compartilharem uma espcie ancestral comum em suas histrias
evolutivas.
Parlogos: so diferentes genes e produtos gnicos de uma mesma espcie
que possuem homologia identificvel, em virtude de terem se originado a um
ou mais eventos de duplicao gnica (seguida de divergncia)
A partir de dois genes homlogos, tem-se que: os dois genes sero parlogos
se eles foram originados a partir de um evento de duplicao; sero ortlogos
quando foram originados como resultado de um processo de especiao.
11. O DNA eucaritico est associado a protenas bsicas fortemente ligadas,
chamadas de histonas. Elas servem para ordenar o DNA em unidades
estruturais bsicas, os nucleossomos, que se assemelham a contas em um
colar. Os nucleossomos por sua vez, esto arranjados em estruturas de
complexidade cada vez maior, que organizam e condensam as longas
molculas de DNA nos cromossomos, que podem ser separados durante a
diviso celular. (o complexo de DNA e protenas encontrado dentro dos
ncleos das clulas eucariticas chamado de cromatina).
Genes procariticos e eucariticos compartilham a mesma estrutura
bsica, sendo formados por uma regio codificadora e pelas regies
reguladoras associadas a ela. Entretanto as sequencias reguladoras ou
codificadoras de genes de eucariotos so mais co0mplexas que as de genes
procariticos.
Em genes eucariticos tpicos, a regio reguladora a montante da
regio codificadora, incluindo o promotor (sitio de ligao da RNAp) em
geral bem mais extensa e contm um n de elementos reguladores muito
maior do que o observado em procariotos. Outra caracterstica marcante a
presena de ntrons, que interrompem a regio transcrita do gene e a dividem
em vrios seguimentos, denominados xons. Os ntrons esto presentes no
DNA genmico, so transcritas em um RNA precursores (pr-rna) porm
removidas durante o processamento do RNA, dando origem ao RNA maduro. Os
ntrons dos genes eucariticos diferem quanto ao dos procariticos tambm
em estrutura. ntrons eucariticos em geral no adotam estruturas
secundarias por pareamento intracadeia no contexto de transcritos de RNA.
Os ntrons procariticos, por sua vez, formam estruturas secundrias
relativamente complexas e isso determinante na maneira como eles sero
removidos durante o processamento de RNA. Por isso, os ntrons procariticos

dependem do spliceossomo para a sua remoo, ao passo que os ntrons

procariticos so removidos por meio de processos autocatalticos.
A ocorrncia de ntrons em eucariotos bem comum, mas rara em
procariotos. A mitocndria possui um genoma prprio.
*Os genomas nucleares eucariticos so constitudos por vrios cromossomos,
cada um deles formado por uma nica molcula de DNA linear. Genomas
eucariticos so em geral muito maiores que os procariticos e seus genes so
tipicamente interrompidos por ntrons.
12. O promotor o sitio de ligao da RNAp. uma seqncia definida no genoma
onde ocorre o inicio da transcrio. Os promotores devem ser reconhecidos
pelo complexo de transcrio, formando o complexo do inicio da transcrio.
O primeiro nucleotdeo da seqncia do DNA. A RNAp holoenzima reconhece
seqncias de DNA especficas e liga-se para o inicio da transcrio. Duas
seqncias so conservadas na maioria dos genes comparados, regio -35 e
-10 (Tat Box) e estas duas regies so separadas por 15 a 17 nucleotdeos, o
que corresponde a uma volta na hlice de DNA.
Elementos de um promotor genrico de E. coli: elemento up- -35 seqncia -10 discriminador - +1 (incio da transcrio). Primeiro nucleotdeo transcrito:
purina
->Verso resumida: Promotor o stio de ligao da RNA Polimerase, onde se
forma o complexo de incio da transcrio e corresponde a seqncias especficas da
molcula de DNA. Em um promotor de gene de E. coli existem 2 seqncias
conservadas importantes no reconhecimento do promotor pela RNAP: a regio -35 e
a regio -10 (TATA Box). Alm destas duas regies, existe outra, chamada de
elemento up, a montante da regio -35, onde a subunidade alfa da RNAP pode se
ligar, auxiliando no reconhecimento da regio promotora.
Existem diferenas bsicas e fundamentais na definio de promotor em
procariotos e eucariotos. Nos procariotos o promotor o conjunto de seqncias
do DNA conde o complexo RNAp se liga para iniciar a transcrio ao passo que em
eucariotos o promotor o conjunto de seqncias do DNA onde os fatores de
transcrio gerais (TF) se ligam para posicionar a RNAp para o incio da
transcrio. Em eucariotos a RNAp no se liga diretamente as seqncias de DNA
do promotor, isso s ocorre aps a ligao de alguns TF no promotor.
13. Subunidades da RNAp de E. coli:
Contm mltiplas subunidades. (formam o core - complexo central, formato
de pina de caranguejo)
Alfa: reconhecimento do promotor, montagem do complexo protico, liga
protenas regulatrias e apresentam os domnios carbxi-terminal e
amino-terminal.
Beta: possui a funo de ligar-se ao DNA molde.
Beta: contem a principal atividade cataltica da bacRNAp, sendo
responsvel pela reao de sntese do RNA. Beta e beta formam as
pinas
Sigma: reconhecimento da regio promotora (sem ele a transcrio no
inicia)
mega: estabiliza o complexo.
14. O fator sigma importante, pois o complexo central da RNAp composto por
alfa2betabeta mega no apresenta uma caracterstica fundamental que a
capacidade de reconhecer o promotor e iniciar a transcrio. Para o inicio da
sntese de RNA em bactrias, ento, necessrio o fator sigma seja

adicionado ao complexo, que passa a ser uma holoenzima. Sim, existem

diferentes fatores sigma, o mais comum o 70 mas tem tambm o 32,
relacionado aos genes envolvidos na resposta ao choque trmico. Em E. coli
existem sete fatores sigma diferentes, e cada um deles especfico pra um
tipo de promotor.
15.
~~Terminao intrnseca (grampo): o termino da transcrio da maioria dos
genes em bactrias. Uma seqncia definida, localizada na regio 3 do gene,
sinaliza o final da sntese de RNA. Um terminador intrnseco reconhecido na
seqncia do DNA na poro 3 terminal dos genes por conter dois componentes
essenciais, uma seqncia invertida repetida rica em cg e uma seqncia de
adeninas no DNA-molde. A seqncia invertida repetida permite que o RNA
nascente forme um pareamento interno a partir das bases complementares na
seqncia, denominado grampo de terminao. Este estabilizado pela regio da
ala e pelo pareamento CG. Quando a RNAp transcreve essa seqncia ocorre
formao do grampo na molcula d e RNA nascente e esta estrutura impede
espacialmente o movimento da RNAp sobre o molde do DNA, provocando uma
longa pausa no alongamento da cadeira, pois a reao de adio de nucleotdeos
cessa. Esta pausa, junto com uma regio de pareamento AU desestabiliza o
hibrido RNA-dna no centro ativo da RNAp, liberando estes. Logo aps as fita do
DNA so renaturadas.
~~Terminao Rho-dependente: a protena rho um complexo hexamrico que
tem atividade de translocase/helicase. Ela se associa ao RNA em stios de ligao
especficos e migra em 5->3 at alcanar o complexo de transcrio, onde
contribui para liberar o transcrito de RNA. A energia necessria para este
deslocamento fornecida pela hidrolise de ATP e pela atividade ATPase de Rho.
16. Pois cada um destes processos ocorre num compartimento diferente, ao
contrrio do que acontece em procariotos.
17.
~~Adio de 5-cap em RNAm (add molcula de 7-metilguanosina pela enzima
guanilil transferase na extremidade 5, ligao 5-5, proteo contra ao de
exonucleases, ocorre durante a transcrio.)
~~Adio da cauda poli A na extremidade 3 dos RNAm: realizada pela enzima PoliA polimerase, proteo contra exonucleases, antes da poliadenilao tem uma
clivagem, seqncias consenso recrutam o processo.
~~Retirada dos ntrons pelo sliceossomo (ver mais sobre o splicing na questo 18)
~~ Processamento de RNAt em eucariotos: remoo de ntrons, remoo de
seqncias adjacentes s extremidades 5 e 3, adio da seqncia CCA a
extremidade 3, modificao de bases.
18. O slipicing o mecanismo no qual os ntrons so removidos. O splicing
realizado pelo spliceossomo, este tendo como componentes centrais os
snRNPs. No splicing alternativo, gera-se variabilidade dos RNA maduros,
gerando protenas diferentes dependendo da forma como o splicing foi feito.
Elementos estimuladores/inibidores do splicing regulam o mesmo. O cissplicing a formao de um RNA maduro unindo xons do mesmo RNA, j o
trans-splicing a formao de um RNA maduro unindo xons que provm de
RNAs precursores diferentes.
Obs.: Auto-splicing o que ocorre sem auxlio de nenhuma protena.
19.

Promotores:

Incio:

Procariotos
~~RNAp: Complexo central
(2) + protena fator
para reconhecer o promotor e
iniciar a transcrio
=holoenzima
~~Nos procariotos o promotor
o conjunto de seqncia do
DNA onde o complexo RNAp se
liga para iniciar a transcrio.
A RNAp holoenzima reconhece
seqncia de DNA especficas e
liga-se para o incio da
transcrio.

~~Reconhecimento e a ligao
do complexo RNAp holoenzima
ao promotor. A energia
necessria para esse processo
provm dos rearranjos e
interaes entre as protenas
da RNAp e as seqncias de
DNA do promotor que geram
energia livre. O complexo
formado entre a RNAp e o
promotor no momento da
ligao denominado
complexo binrio fechado
(CBF) pois composto por
RNAp e DNA hlice dupla.
~~ O complexo se alonga e
passa por interaes
conformacionais importantes.
As fitas do DNA so separadas e
forma-se o complexo binrio
aberto (CBA). Esses arranjos
sucessivos que resultam na
abertura da fita de DNA
posicionam o centro cataltico

Eucariotos
~~RNAp: euRNAPI (genes para
precursor de dos RNAr, localizada no
nuclolo), euRNApII (+ importante,
possui domnio carbxi-terminal
CTD- fundamental para a
funcionalidade), eu RNApIII
(transcreve genes dos RNAt e RNAs
pequenos) -> sintetizam diferentes
classes de RNA.
~~Nos eucariotos o promotor o
conjunto de seqncia do DNA onde
os fatores de transcrio gerais (TF)
se ligam para posicionar a RNAp para
o incio da transcrio. Aqui, a RNAp
no se liga diretamente seqncia
do promotor, que primeiro
reconhecida pelos fatores de
transcrio (TF), que dirigem a
ligao das euRNAp para o incio da
transcrio. Em geral, os promotores
de eucariotos tm uma seqncia
principal capaz de produzir a
transcrio em nvel basal, que
denominada promotor principal (core
promoter). Estes dirigem o incio
da transcrio.
~~O promotor principal contm a
seqncia mnima necessria pra
permitir a transcrio por RNApII.
Para efeito da formao dos PIC
devem-se considerar as duas
categorias de promotores principais,
a TATA Box e a TATA Less.
-> Inr (+1), TATA BOX, BRE
(elementos ligao TF)
~~O incio da transcrio ocorre pela
ligao dos fatores de transcrio
(TF) as seqncias do DNA na regio
do promotor. O conjunto de TF +
euRNA nuclear = PIC, que o
complexo mnimo capaz de iniciar a
transcrio. Essa transcrio basal
mnima e no regulada, pois para
isso outros TFs devem ser recrutados
ao PIC.
~~As TF reconhecem e se ligam aos
promotores numa ordem especfica
~~GENES CLASSE II:
-TFAII+TFB estabilizam DNA +TFIID
(na ausncia de TATA BOX ele
reconhece e se liga ao elemento Inr),
recrutam a RNApII e outros TF
-TFB auxilia no posicionamento da
RNApII
-No complexo formado liga-se TFII
(atividade de hlice, desnatura
dupla hlice da regio promotora pra
formar a bolha de transcrio)
+RNAp

Alongamento:

da RNAp no local de incio da

transcrio (+1), quando a
sntese do RNA iniciada o
complexo formado chama-se
tercirio aberto (CTA), pois
agora uma terceira molcula, o
RNA, est presente.
~~No complexo RNAp
holoenzima (2) ocorre
formao de 2 canais
moleculares: no maior, o DNA a
jusante do promotor alojado,
sendo tambm o local onde
ser aberta a bolha de
transcrio e o outro canal, o
local onde os ribonucleosdeos
trifostafados (NTP) que sero
adicionados ao RNA nascente
entram no complexo
~~A reao de adio de cada
NTP envolve as seguintes
etapas: entrada do NTP e sua
ligao ao complexo,
incorporao deste na cadeia
nascente na extremidade 3 do
RNA, translocao do complexo
de transcrio para liberao
do sitio de insero para o
prximo nucleotdeo a ser
incorporado.
~~Na etapa de formao do
complexo de iniciao, a RNAp
inicia um ciclo abortivo de
transcrio em que ocorre a
sntese e liberao de
pequenos RNA. O complexo
depois escapa da regio do
promotor, formando o
complexo de alongamento e
dando incio ao alongamento.
~~RNAp exerce as seguintes
funes: desnatura hlice
dupla, mantm as fitas
separadas na bolha de
transcrio, incorpora
ribonucleotdeos na cadeira
nascente, mantm estvel o
hbrido DNA-RNA, renatura DNA
na regio a montante da bolha,
responde a alteraes
conformacionais geradas pela
ligao de protenas
reguladoras.
~~Entrada dos NTP pelo canal
secundrio, incorporao deles
a cadeia nascente (ligao
fosfodister), translocao do
complexo libera stio de
insero para a entrada do
prximo nucleotdeo.

-Ligao de TFIIE (afinidade por DNA

fita simples) e TFIIH (ATPase,
Helicase e Quinase) = montagem do
PIC finalizada
-complexo mediador multiprotico
transmite sinais de fatores
regulatrios
-h a liberao de alguns fatores de
iniciao antes do alongamento

-Aps formao do PIC, TFIIE e TFIIH

exercem atividades de helicase e
hidrlise de ATP
- Abertura das fitas e deslocamento
do complexo RNApII, iniciao
abortiva, liberao do promotor:
incio do alongamento
- TFIIB: estabiliza complexo RNApII
at que o hbrido RNA-DNA tenha
tamanho suficiente para iniciar o
alongamento
-Alteraes conformacionais
determinam o escape da RNApII do
promotor e o inicio do alongamento
-fosforilao da cauda CTD da RNApII
durante toda a transcrio

Trmino:

~~Processividade elevada:
mesmo nas pausas o complexo
no dissociado
~~Acoplamento de transcrio
e traduo pode provocar
pausas
~~Reconhecimento do
terminador, dissociao do
complexo RNAp e liberao do
RNA, formao de um grampo
de terminao: pausa
~~Terminao intrnseca
~~Terminao Rho-dependente

-Presena de modificaes pstranscricionais: clivagem da

extremidade 3 do RNAm pelo
complexo de poliadelinao precede
o trmino
-alteraes conformacionais em
decorrncia da clivagem
desestabilizam o complexo RNApII,
que sa e est pronta para reiniciar o
ciclo