EXTRACCIN DE ADN

1. INTRODUCCIN
El cido desoxirribonucleico (ADN) contiene las instrucciones genticas usadas en el
desarrollo y el funcionamiento de todos los organismos vivos conocidos y tambin de los
virus, excepto algunos cuyo material gentico es ARN (retrovirus). La funcin principal de
las molculas de ADN es el de ser portador y transmisor entre generaciones de informacin
gentica.
Para realizar cualquier anlisis molecular: gentica forense, clonacin, secuenciacin,
diagnstico de enfermedades, produccin y/o deteccin de organismos transgnicos,
estudios de ecogenotoxicologa; entre otros, el primer paso es extraer el ADN de las
clulas que lo contienen.
Existen diferentes procedimientos para extraer ADN; esta requiere de una serie de etapas
bsicas: En primer lugar tiene que inducirse una digestin o lisis celular, que consiste en
romper la pared celular y la membrana plasmtica para poder acceder al ncleo de la clula.
A continuacin se debe romper tambin la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Para
minimizar la actividad de nucleasas (enzimas que degradan ADN) es muy importante tomar
bien la muestra a partir de la cual se desea hacer la extraccin y almacenarla de manera
adecuada (refrigeracin). Seguido a la lisis celular est la purificacin o
desproteinizacin, que consiste en eliminar las protenas que puedan contaminar el ADN y
por ltimo la recuperacin del ADN precipitndolo con alcohol.
El objetivo final de todos los protocolos de extraccin es obtener un ADN genmico en
buena cantidad y de buena calidad (intacto). Esto ltimo, se puede visualizar mediante la
tcnica de electroforesis que sirve para separar molculas de acuerdo a su carga, tamao y
conformacin.
2. OBJETIVOS

Aprender a usar adecuadamente materiales y reactivos de biologa molecular.

Realizar extraccin de ADN de clulas bacterianas, vegetales y animales utilizando

tres mtodos diferentes.

3. REACTIVOS, MATERIALES Y EQUIPOS

Reactivos:
Banano
Alcohol 95% fro
Sal de cocina
Champ

Agua destilada estril

Cultivo bacterias Gram Sangre entera con EDTA almacenada a 4C
Solucin de lisis kit Fermentas
Cloroformo
Solucin de precipitacin kit Fermentas
NaCl 1.2 M
Etanol 70% fro

Materiales:
Mortero
Cuchara
Filtro de caf
Tubo de ensayo
Pipetas plsticas
Gradilla de madera
Tubos eppendorf
Marcador
Gradilla para tubos eppendorf
Puntas azules para micropipeta
Mechero
Asa de aro
Beaker

Equipos:
Bao mara
Microcentrfuga
Vortex
Micropipeta

4. PROCEDIMIENTO
4.1 Extraccin de ADN a partir de material vegetal - Mtodo Casero
1. Utilice el mortero para macerar el banano
2. Adicione 20 ml de agua destilada y mezcle para homogenizar
3. Aparte en un beaker, ponga media cucharada de champ y dos pizcas de sal y mezcle sin
producir espuma; luego adicione 4 cucharaditas de agua destilada

4. Adicionar el macerado del banano a la mezcla anterior.

5. En un beaker ponga el filtro de caf y adicione la mezcla, deje reposar durante 10
minutos hasta que obtenga 5 ml, para transferirlos a un tubo de ensayo.
6. Adicione alcohol dentro del tubo de ensayo y deje reposar durante 10 minutos.
7. Con una pipeta, extraiga la parte superior (ADN) y depostela en un tubo ependorf con
agua destilada y desionizada.
4.2 Extraccin de ADN de bacterias - Mtodo Boiling Prep
1. Tome colonias bien aisladas a partir de agar nutritivo con el asa de aro.
2. Adicionelas en 200 l de agua destilada estril, en un tubo eppendorf
3. Vorterice por aproximadamente 20 segundos.
4. Someta a ebullicin por 10 minutos
5. Centrifugue a 11.000 rpm por 5 minutos
6. Tome el sobrenadante y depostelo en un tubo nuevo.
7. Visualice en gel de electroforesis y conserve a -20C hasta la realizacin de la PCR.
4.3 Extraccin de ADN a partir de sangre - Mtodo Kit Fermentas
1. En un tubo eppendorf previamente marcado, mezcle 200 l de muestra con 400 l de
solucin de lisis, lleve a bao mara a 65C durante 5 minutos.
2. Adicione 600 l de cloroformo y mezcle por inversin del tubo (3 a 5 veces).
3. Centrifugue a 10.000 rpm por 2 minutos.
4. Prepare la solucin de precipitacin as: 720 l de agua desionizada estril con 80 l de
solucin concentrada 10X
5. Transfiera sobrenadante a un tubo nuevo y adicione 800 l de solucin de precipitacin
recin preparada, mezcle por inversin a temperatura ambiente por 1 a 2 minutos y
centrifugue a 10.000 rpm por 2 minutos.
6. Invierta el tubo para eliminar el sobrenadante; disuelva el precipitado en 100 l de NaCl
1.2 y mezcle con vrtex.

7. Adicione 300 l de etanol fro y deje reposar a -20C durante 10 minutos.

8. Centrifugue a 14.000 rpm por 4 minutos.
9. Invertir el tubo para eliminar el etanol y lave el precipitado o pellet con etanol 70% fro y
disuelva el ADN en 100 l de agua destilada estril mezclando muy bien.
10. Visualice en gel de electroforesis y conserve a -20C hasta la realizacin de la PCR.
5. CUESTIONARIO DE CONSULTA

De las siguientes muestras cules son buena fuente de ADN: pelo, sangre, orina,
tejido muscular, saliva, huesos, dientes, espermatozoides y consulta como se deben
tomar dichas muestras.

Qu sucede si se toma una muestra de sangre con heparina como anticoagulante

para utilizarla en biologa molecular.
6. BIBLIOGRAFIA
Juan S. Bonifacino, Mary Dasso, Joe B. Harford, Jennifer Lippincott-Schwartz,
Kenneth M. Yamada (eds.). Current Protocols in Cell Biology, 2003 John Wiley &
Sons, Inc.
Manual de Genomic DNA Purification Kit #k0519. Fermentas, 2002.

ELECTROFORESIS
1. INTRODUCCIN
La electroforesis es una tcnica para la separacin de molculas segn la movilidad de
estas en un campo elctrico. La separacin puede realizarse sobre la superficie hidratada de
un soporte slido (p. ej., electroforesis en papel o en acetato de celulosa), o bien a travs de
una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolucin (electroforesis libre).
Dependiendo de la tcnica que se use, la separacin obedece en distinta medida a la carga
elctrica de las molculas y a su masa.
La variante de uso ms comn para el anlisis de mezclas de protenas o de cidos
nucleicos utiliza como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Los
cidos nucleicos ya disponen de una carga elctrica negativa, que los dirigir al polo
positivo. Al poner la mezcla de molculas y aplicar un campo elctrico, stas se movern y
debern ir pasando por la malla del gel (una red tridimensional de fibras cruzadas), por lo
que las pequeas se movern mejor, ms rpidamente. As, las ms pequeas avanzarn
ms y las ms grandes quedarn cerca del lugar de partida.
2. OBJETIVOS

Entender el principio de la tcnica

Interpretar los resultados de una electroforesis

3. REACTIVOS, MATERIALES Y EQUIPOS

Reactivos:
ADN
Agarosa
Buffer TBE 10X
GeneRuler 100 bp
Buffer de carga
Solucin de bromuro de etidio

Materiales:
Papel aluminio
Marcador
Gradilla para tubos eppendorf
Puntas blancas, amarillas y azules para micropipeta
Erlenmeyer
Probeta
Papel parafinado

Equipos:
Balanza analtica
Horno microondas
Micropipeta
Cmara de electroforesis
Fuente de poder
Transiluminador

4. PROCEDIMIENTO
1.Se pesan 0.24 g de agarosa y se ponen en un erlenmeyer, se aaden 3ml de TBE 10X y se
completa el volumen a 30 ml con agua desionizada.
2. Se calienta la mezcla al microondas durante 1 minuto y se sirve en el molde del gel, no
olvide colocar el peine.
3. Deje enfriar y sumerja dentro de la cmara de electroforesis que ha sido previamente
llenada con buffer TBE hasta que cubra el gel.
4. Prepare las muestras de ADN de la siguiente manera: en un pedazo de papel parafinada
deposite 5 l de ADN y sobre esta, 2 l de buffer de carga.
5. Sirva la muestra en cada pozo, deje el primer pozo del gel para el GeneRuler o marcador
de peso molecular.
6. Tape la cmara de electroforesis y conctela a la fuente de poder , ajuste el voltaje a 80V
y deje correr o migrar las muestras durante 30 minutos.
7. Apague la cmara, desconecte y saque el gel en el molde, llvelo al transiluminador,
depostelo con cuidado y una vez se tenga la proteccin adecuada para la radiacin UV,
visualice el ADN.
5. BIBLIOGRAFIA
TAGU, D. y MOUSSARD, C. Fundamentos de las tcnicas de biologa molecular.
Espaa: Acribia. 2003