CAPITULO 15

Taxonoma de bacterias cido lcticas.

Evelia Acedo Flix

Introduccin.

La obtencin del primer cultivo puro de bacterias lcticas de que se tiene

conocimiento, fue el de Bacterium lactis en 1873 por J. Lister y posiblemente sea el
que actualmente conocemos como Lactococcus lactis. A finales del siglo pasado, Huepe,
utiliz el trmino "Milchsauerbacillus" para la descripcin de las bacterias que
acidificaban y coagulaban la leche (Ingram, 1975).
El concepto de bacterias cido lcticas como grupo, surgi a principios del siglo
XX. Originalmente a bacetrias lcticas eran aisladas de las plantas verdes, sin embargo,
por un proceso de evolucin y adaptacin biolgica han ido colonizando otros ambientes
y actualmente se localizan en distintos habitats, siempre y cuando sean lo suficientemente
ricos, para satisfacer las necesidades nutricionales y ambientales de ste complejo grupo
de bacterias (Cintas et all., 2001). Las bacterias lcticas estn asociadas a ambientes
nutricionalmente ricos, como son los productos alimenticios como leche, carne,
vegetales, bebidas y algunos son miembros de la microbiota normal de la boca, intestinos
y vagina de mamferos (Ingram, 1975, Axelsen, 1998; Pot et al., 1994). La caracterstica
esencial del metabolismo de las bacterias lcticas, produccin de cido lctico, a partir de
la fermentacin de carbohidratos, ha sido usada durante siglos en la conservacin de
alimentos. Las bacterias lcticas intervienen en la elaboracin de un nmero elevado de
alimentos fermentados de origen animal como queso, yoghurt, leches fermentadas y
salchichones, mientras que de origen vegetal se encuentra el encurtido de aceitunas y
pepinillos, col cida, salsa de soja, vino, cerveza y pan (Cita).
Es difcil dar una definicin vlida y que incluya todas las bacterias lcticas, las
caractersticas generales tpicas; son bacilos, cocos o cocobacilos, Gram-positivos, no
formadores de esporas, carecen de citocromos y crecen en ambientes no aerbicos

aunque son aerotolerantes. Son quimiorganotrficos, de difcil crecimiento, ya que

necesitan medios de cultivo ricos con carbohidratos fermentables para su crecimiento,
son tolerantes al cido y metabolismo estrictamente fermentativo, produciendo cido
lctico como el principal producto final durante la fermentacin de azcares.
Historia.
Los primeros intentos por clasificar las bacterias cido lcticas fueron hechos por
Orla-Jensen en 1919, basndose en la morfologa, disposicin celular, criterios
fisiolgicos como el tipo de metabolismo fermentativo de la glucosa, tipo de ismero del
cido lctico y la capacidad para desarrollarse a 10 y 45C, como Betabacterium,
Thermobacterium, Streptobacterium y Microbacterium, a aquellos que tenan una forma
bacilar, mientras que los de forma cocoide los clasific en Streptococcus, Betacoccus y
Tetracoccus (Pot et all, 1994; Cintas et all., 2001).
En la 8a. edicin del Bergeys Manual of Systemathic Bacteriology (Sneath et
all., 1986), se da una nueva clasificacin de las bacterias cido lcticas, las bacterias
Gram positivas, de morfologa cocoide o bacilar, no esporuladas, anaerobias facultativas
y productoras de cido lcticas, se clasificaron en siete gneros: Lactobacillus,
Erysipelothrix, Streprococcus, Pediococcus Leuconostoc, Aerococcus y Gemella (Pot et
all, 1994; Vandame et all., 1996; Cintas et all., 2001).
La clasificacin de las bacterias cido lcticas estuvo basada durante mucho
tiempo de acuerdo a las caractersticas fenotpicas, sin embargo, con el uso de los
marcadores quimiotaxonmicos, tales como composicin de cidos grasos, constituyentes
de pared celular y las tcnicas moleculares actuales, sabemos ahora que las bacterias
cido lcticas estn constitudas por 12 gneros diferentes: Aerococcus, Atopobium,
Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus,
Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus y Weisella. En los ltimos
aos se han descrito otros nuevos gneros relacionados filogentica y fisiolgicamente
con las especies de bacterias cido lcticas verdaderas, Alloiococcus, Dolosigranulum,
Globicatella, Lactosphaera y Paralactobacillus (Schleifer y Ludwig, 1995; Pot et all,
1994; Euzeby, 2002). En la Figura 1 se muestra un esquema de los cambios que se han
producido en la clasificacin de las bacterias lcticas, mismos que se discrutirn con
mayor detalle mas adelante.

Manual de Bacteriologa Determinativa.

8th edicin.

Streptococcus

Clasificacin actual
Euzby J.P. 2002

Streptococcus
Enterococcus
Lactococcus
Vagococcus
Atopobium

Lactobacillus

Lactobacillus
Carnobacterium
Weisella

Leuconostoc

Leuconostoc
Oenococcus

Pediococcus

Pediococcus
Tetragenococcus
Aerococcus
Alloiococcus
Dolosigranulum
Globicatella
Lactosphaera
Paralactobacillus

Figura 1. Esquema que muestra la clasificacin actual de las bacterias cido

lcticas.

Clasificacin y filogenia actual de las bacterias cido lcticas.

Clasificacin fenotpica.
En la clasificacin de las bacterias lcticas hubo importantes progresos cuando se
reconoci la similitud de las bacterias acidificantes de la leche y las bacterias productoras
de cido lctico, provenientes de otros ambientes. Orla-Jensen se bas en un nmero
limitado de caractersticas para la clasificacin: morfologa, agrupamiento celular, forma
de fermentacin de la glucosa (homo o heterofermentativo), temperaturas de crecimiento
(10 y 45 C) y la utilizacin de varios azcares para su crecimiento (Ingram, 1975; Carr,
1975). Este trabajo tuvo un fuerte impacto en la clasificacin y sistemtica de las
bacterias lcticas y aun cuando ha sido revisada en muchas ocasiones, algunos de sus
criterios aun prevalecen. Las pruebas fenotpicas tradicionales, usando esquemas de
fermentacin constituyen las bases de la identificacin y descripcin formal de los taxas,
desde especies y subespecies hasta gnero y familia. La caracterizacin fenotpica
comprende pruebas morfolgicas, fisiolgicas y bioqumicas y han sido ampliamente
estudiadas a nivel de grupo y para la diferenciacin de especies en particular (Williams,
1975; Kandler y Weiss, 1986; Carr, 1975; Goodfellow y Minniken, 1985; Vandame et al.,
1996). En la Tabla 1, se muestra un resumen de pruebas fenotpicas generales que sirven
para la clasificacin primaria, a nivel de gnero de las bacterias lcticas. Existen algunas
pruebas que se solapan entre gneros, para lo cual es necesario llevar a cabo anlisis
adicionales ms especficos (Collins et al., 1993; Axelsen, 1998). Se ha desarrollado un
medio de cultivo no selectivo para obtener un buen crecimiento de Lactobacillus (de Man
et al., 1960), que se encuentra disponible comercialmente, as como otros sistemas
comerciales que facilitan la clasificacin de Lactobacillus (Galeras de fermentacin), sin
dejar de lado los anlisis enzimticos especficos (Montel et al., 1991; Gancel et al.,
1997; Johanson et al., 1995a; Sanz et al., 1988).

Tabla 11. Caractersticas diferenciales de las bacterias lcticasa

Bacilos
Caracterstica
Formacin de ttradas
CO2 de Glucosac
Crecimiento a 10C
Crecimiento a 45C
Crecimiento en NaCl 6.5%
Crecimiento en NaCl 18%
Crecimiento a pH 4.0
Crecimiento a pH 9.6
Configuracin del cido
lctico producido de glucosad
a

Cocos

Carnobacterium
-e
+
NDf
ND
-

Lactobacillus
+/+/+/+/+/-

Aerococcus
+
+
+
+

Enterococcus
+
+
+
+
+

Lactococcus/
Vagococcus
+
+/-

Leuconostoc
/Oenococcus
+
+
+/+/-

Pediococcus
+
+/+/+/+
-

Streptococcus
+/-

Tetragenococcus
+
+
+
+
+

Weissellab
+
+
+/+/-

D, L. DLg

L, DLg

D, DLg

+, positivo; -, negativo; +/-, la respuesta vara entre las especies; ND No determinado

Las cepas de Weissella tambin pueden ser cocos y bacilos
c
[Prueba para homo y heterofermentacin de la glucosa]. Negativo y positivo denota homofermentativo y heterofermentativo,
respectivamente.
d
Configuracin del cido lctico producido a partir de glucosa.
e
Se pueden producir pequeas cantidades de CO2, dependiendo del medio.
f
Se ha descrito sin crecimiento a 8% de NaCl.
g
Produccin de D-, L- o DL-cido lctico, vara entre las especies.
1
Tomado deAxelsson, 1998.
b

Clasificacin Filogentica

A pesar de la controversia suscitada por algunos investigadores, se considera la

comparacin de la secuencia del cido ribonucleico ribosomal (RNAr) 16S, como la
medida ptima para determinar las relaciones filogenticas bacterianas (Woese, 1987;
Fox et al., 1992). Inicialmente, las comparaciones se hicieron por hibridacin DNARNAr y secuenciacin de productos digeridos del RNAr (oligonucleotide cataloguing).
Los avances en las tcnicas de gentica molecular han dado lugar a mtodos de
secuenciacin de segmentos grandes de RNAr, primero por el mtodo de transcriptasa
reversa (Lane et al., 1985; Mordarski, 1985), que posteriormente se reemplaz por la
secuenciacin directa de genes del RNAr, amplificados por PCR. Los mtodos
computarizados disponibles actualmente para el manejo de grandes cantidades de datos
de secuencias, han hecho posible construir rboles filogenticos significativos del reino
bacteriano completo as como detalles de ciertas partes de l (Woese, 1987; Sneath &
Sokal, 1973; Weir, 1990). Todas las bacterias Gram-positivas se agrupan en uno de los
12 phylas mayores (Woese, 1987). Se han hecho comparaciones con los datos de
secuencias de otras macromolculas conservadas, tales como el RNAr 23S, factor de
elongacin Tu y la subunidad de la ATPasa, producindose rboles filogenticos
similares a los del RNAr 16S (Schleifer y Ludwig, 1989; Schleifer y Ludwig, 1995a).
Basados en las secuencias del RNAr 16S y 23S, las bacterias Gram-positivas pueden ser
divididas en dos grupos. Un filum donde se encuentran las bacterias Gram-positivas con
una composicin en G+C de su DNA menor de 50 mol % y que representa la rama de los
Clostridium. Mientras que en la otra rama se encuentran las bacterias Gram-positivas con
un alto contenido de G+C, mayor de 50 mol%, llamada la rama de los Actinomyces. La
subdivisin con alto contenido en G+C comprende gneros tales como Bifidobacterium,
Arthrobacter, Micrococcus, Propionibacterium, Microbacterium, Corynebacterium,
Actinomyces y Streptomyces. La subdivisin de los Clostridium de bajo contenido de
G+C incluye todas las bacterias lcticas, junto con aerobios y anaerobios facultativos
tales como Bacillus, Staphylococcus, Listeria y anaerobios, como Clostridium,
Peptococcus y Ruminococcus (Stackebrandt y Teuber, 1998; Schleifer y Ludwig,
1995b).

Estado actual de las bacterias lcticas.

Con la aparicin de las tcnicas moleculares, se ha hecho una revisin de la
clasificacin de las bacterias lcticas publicada:
-

Streptococcus sensu lato, se encontr que era un grupo filogenticamente distinto,

por lo que fue dividido en cuatro gneros: Atopobium, Enterococcus,
Lactococcus y Streptococcus sensu stricto (Schleifer y Klipper-Blz, 1984;
Schleifer et al., 1985; Schleifer, 1987: Collins y Wallbanks, 1992).

El grupo de bacterias mviles inicialmente asignadas a Lactococcus formaba un

gnero separado, muy distinto de los lactococos y se les asign el nombre de
Vagococcus (Collins et al, 1989a). Adems, Wallbanks et al. (1990), describieron
una nueva especie, V. salmonarium, como causante de enfermedades en salmn.

Los gneros de Lactobacillus, Leuconostoc y Pediococcus durante algn tiempo

haban permanecido sin cambios, sin embargo, algunos bacilos previamente
incluidos en el gnero Lactobacillus, se encuentran actualmente formando el
gnero Carnobacterium (Collins et al., 1987) y algunos el de Atopobium,
mientras que la especie de Pediococcus halophilus ha alcanzado el nivel de
gnero: Tetragenococcus (Collins et al., 1990). Mientras que otras especies
anteriormente clasificadas dentro de los Pediococcus, han sido agrupadas dentro
de los Aerococcus (Collins et al. 1990 Aguirre y Collins, 1992; Schleifer y
Ludwig, 1995).

Un pequeo grupo de especies de bacterias lcticas heterofermentativas, que

incluye especies previamente asignadas a Lactobacillus y Leuconostoc, han sido
reasignadas en el gnero de Weissella (Collins et al., 1993).

Leuconostoc oenos ha sido separado en un gnero donde se encuentra l slo,

como Oenococcus (Dicks et al., 1995).

Se han descrito nuevos gneros: Alliococcus, Atopobium, Dolosigranulum,

Globicatella, Lactosphaera y Paralactobacillus que estn relacionados con las
bacterias lcticas, tanto fisiolgica como filogenticamente (Collins et al., 1992;
Aguirre et al., 1993; Janssen et al., 1995). En las tablas 2a y 2b se muestran la
especies que pertenecen a cada uno de los gneros de las bacterias lcticas y la
Tabla 3, las especies de los gneros relacionados con las bacterias lcticas.

Tabla 2a. Lista de especies aprobadas de bacterias lcticas verdaderas.

Gnero
Especies
Aerococcus
A. christensenii, A. sanguinicola, A. urinae, A. urinaehominis, A. viridans
A. fossor, A. minutum, A. parvulum, A. rimae, A. vaginae.
Atopobium
Carnobacterium
C. alterfunditum, C. divergens, C. funditum, C. gallinarum, C. inhibens, C. mobile, C. arnobacterium, C.
piscicola.
Enterococcus
E. asini, E. avium, E. casseliflavus, E. cecorum, E. columbae, E. dispar, E. durans, E. faecalis, E.
faecium, E. flavescens, E. gallinarum, E. haemoperoxidus, E. hirae, E. malodoratus, E. moraviensis,
E.mundtii, E. porcinus, E. pseudoavium, E. raffinosus, E. ratti, E. saccharolyticus, E. seriolicida, E.
solitarius, E. sulfureus, E. villorum.
Lactobacillus
L. acetotolerans, L. acidipiscis, L. acidophilus, L,acidophilus, L. agilis, L. algidus, L. alimentarius, L.
amylolyticus, L. amylophilus, L. amylovorus, L. animalis, L. arizonensis, L. aviarius, L. aviarius subsp.
araffinosus, L. aviarius subsp. aviarius, L. bavaricus, L. bifermentans, L. brevis, L. buchneri, L.
bulgaricus, L. carnis, L. casei, L. casei subsp. alactosus, L. casei subsp. casei, L. casei subsp.
pseudoplantarum, L. casei subsp. rhamnosus, L. casei subsp. tolerans, L. catenaformis, L. cellobiosus, L.
coleohominis, L. collinoides, L.confusus, L. coryniformis, L. coryniformis subsp. coryniformis, L.
coryniformis subsp. torquens, L. crispatus, L. curvatus, L. curvatus subsp. curvatus, L. curvatus subsp.
melibiosus, L. cypricasei, L. delbrueckii, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. delbrueckii subsp.
delbrueckii, L. delbrueckii subsp. lactis, L. diolivorans, L. divergens, L. durianis, L. equi, L. farciminis, L.
fermentum, L. fornicalis, L. fructivorans, L. fructosus, L. frumenti, L. gallinarum, L. gasseri, L. graminis,
L. halotolerans, L. hamsteri, L. helveticus, L. heterohiochii, L. hilgardii, L. homohiochii, L. iners, L.
intestinalis, L. jensenii, L. johnsonii, L. kandleri, L. kefiranofaciens, L. kefirgranum, L. kefiri, L. kimchii,
L. kunkeei, L. lactis, L. leichmannii, L. lindneri, L. malefermentans, L. mali, L. maltaromicus, L.
manihotivorans, L. minor, L. minutus, L. mucosae, L. murinus, L. nagelii, L. oris, L. panis, L.
parabuchneri, L. paracasei, L. paracasei subsp. paracasei, L. paracasei subsp. tolerans, L. parakefiri, L.
paralimentarius, L. paraplantarum, L. pentosus, L. perolens, L. piscicola, L. plantarum, L. pontis, L.
psittaci, L. reuteri, L. rhamnosus, L. rimae, L. rogosae, L. ruminis, L. sakei, L.sakei subsp. carnosus, L.
sakei subsp. sakei, L. salivarius, L. salivarius subsp. salicinius, L. salivarius subsp. salivarius, L.
sanfranciscensis, L. sharpeae, L. suebicus, L. trichodes, L. uli, L. vaccinostercus, L. vaginalis, L.
viridescens, L. vitulinus, L. xylosus, L. yamanashiensis, L. yamanashiensis subsp. mali, L. yamanashiensis
subsp. yamanashiensis, L. zeae.

Tabla 2b. Lista de especies aprobadas de bacterias lcticas verdaderas.

Gnero
Especies
Lc. garvieae, Lc. lactis, Lc. lactis subsp. cremoris, Lc. lactis subsp. hordniae, Lc. lactis subsp. lactis, Lc.
Lactococcus
piscium, Lc. plantarum, Lc. raffinolactis.
Leuconostoc
Leu. amelibiosum, Leu. argentinum, Leu. carnosum, Leu, citreum, Leu. cremoris, Leu. dextranicum, Leu.
fallax, Leu. ficulneum, Leu. fructosum, Leu. gasicomitatum, Leu. gelidum, Leu. kimchii, Leu. lactis, Leu.
mesenteroides, Leu. mesenteroides subsp. cremoris, Leu. mesenteroides subsp. dextranicum, Leu.
mesenteroides subsp. mesenteroides, Leu. oeni, Leu. paramesenteroides, Leu. pseudomesenteroides.
Oenococcus
Oenococcus oeni
Pediococcus
P. acidilactici, P. damnosus, P. dextrinicus, P. halophilus, P. inopinatus, P. parvulus, P. pentosaceus,
P. urinaeequi.
Streptococcus
S. acidominimus, S. adjacens, S. agalactiae, S. alactolyticus, S. anginosus, S. australis, S. bovis, S. canis,
S. caprinus, S. cecorum, S. constellatus, S. constellatus subsp. constellatus, S. constellatus subsp.
pharyngis, S. cremoris, S. criceti, S. cristatus, S. defectivus, S. didelphis, S. difficilis, S. downei, S. durans,
S. dysgalactiae, S. dysgalactiae subsp. dysgalactiae, S. dysgalactiae subsp. equisimilis, S. entericus, S.
equi, S. equi subsp. equi, S. equi subsp. zooepidemicus, S. equinus, S. faecalis, S. faecium, S. ferus, S.
gallinarum, S. gallolyticus, S. garvieae, S. gordonii, S. hansenii, S. hyointestinalis, S. hyovaginalis, S.
infantarius, S. infantarius subsp. coli, S. infantarius subsp. infantarius, S. infantis, S. iniae, S. intermedius,
S. intestinalis, S. lactis, S. lactis subsp. cremoris, S. lactis subsp. diacetilactis, S. lactis subsp. lactis, S.
macacae, S. macedonicus, S. mitis, S. morbillorum, S. mutans, S. oralis, S. orisratti, S. ovis, S.
parasanguinis, S. parauberis, S. parvulus, S. peroris, S. phocae, S. plantarum, S. pleomorphus, S.
pluranimalium, S. pneumoniae, S. porcinus, S. pyogenes, S. raffinolactis, S. ratti, S. saccharolyticus, S.
salivarius, S. salivarius subsp. salivarius, S. salivarius subsp. thermophilus, S. sanguinis, S. shiloi, S.
sobrinus, S. suis, S. thermophilus, S. thoraltensis, S. uberis, S. urinalis, S. vestibularis, S. waius.
Tetragenococcus
T. halophilus, T. muriaticus.
Vagococcus
V. fessus, V. fluvialis, V. lutrae, V. salmoninarum
Weissella
W. cibaria, W. confusa, W. halotolerans, W. hellenica, W. kandleri, W. kimchii, W. minor, W.
paramesenteroides, W. soli, W. thailandensis, W. viridescens.

Tabla 3. Lista de gneros y especies relacionadas con las bacterias cido lcticas.
Gnero
Especies
Alloiococcus
Alloiococcus. Otitis
Atopobium fossor, A. minutum, A. parvulum, A. rimae, A. vaginae.
Atopobium
Dolosigranulum
Dolosigranulum pigrum
Globicatella
Globicatella sanguinis G. Sulfidifaciens
Lactosphaera
Lactosphaera pasteurii
Paralactobacillus Paralactobacillus selangorensis
Bifidobacterium
B. adolescentis, B. angulatum, B. animalis, B. asteroides, B. bifidum, B. boum, B. breve, B. catenulatum,
B. choerinum, B. coryneforme, B. cuniculi, B. denticolens, B. dentium, B. gallicum, B. gallinarum, B.
globosum, B. indicum, B. infantis, B. inopinatum, B. lactis, B. longum, B. magnum, B. merycicum, B.
minimum, B. pseudocatenulatum, B. pseudolongum, B. pseudolongum subsp. Globosum, B. pseudolongum
subsp. Pseudolongum, B. pullorum, B. ruminantium, B. saeculare, B. scardovii, B. subtile, B. suis, B.
thermacidophilum, B. thermophilum.

La aplicacin de los mtodos de clasificacin genticos y filogenticos han sido

de ayuda para obtener un esquema de clasificacin ms coherente. As pues, despus de
las revisiones taxonmicas citadas y la descripcin de nuevos gneros, las bacterias
lcticas cuentan con los siguientes gneros: Aerococcus, Alliococcus, Carnobacterium,
Dolosigranulum, Enterococcus, Globicatella, Lactobacillus, Lactococcus, Lactosphaera,
Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus y
Weissella (Figura 1). El gnero Bifidobacterium se haba considerado como una bacteria
lctica genuina ya que comparte algunas de las caractersticas tpicas del grupo, sin
embargo filogenticamente no est relacionada y tiene slo una forma nica de
fermentacin de azcares (degrada las hexosas nica y exclusivamente por la va de la
fructosa-6-fosfato, descrita por Scardovi y Trovatelli en 1965) (Ballongue, 1998).

Tcnicas empleadas en la caracterizacin y taxonoma de bacterias lcticas.

La sistemtica es una de las ramas ms antiguas de las Ciencias Biolgicas. Es la

parte de la biologa que se encarga del estudio cientfico de la diversidad de los
organismos y las relaciones existentes entre ellos, es una disciplina fundamental dentro
dela Biologa, que abarca la clasificacin, nomenclatura e identificacin. La clasificacin
es el arreglo de organismos en grupos o taxas y la taxonoma que es la ciencia de la
clasificacin, donde se incluyen los principios, procedimientos y propsitos. La
nomenclatura facilita la comunicacin, ya que le asigna nombres cientficos
internacionales a los organismos o grupos definidos en la clasificacin. Finalmente, la
identificacin se encarga de colocar las cepas (estirpes o clones) de organismos
desconocidos dentro de los grupos derivados de la clasificacin (Goodfellow y Minnikin,
1985; Stackebrandt y Goodfellow, 1991; Vandame, et al., 1996).
La clasificacin puede ser fentica y/o filogentica. En la clasificacin fentica,
no existe ninguna implicacin evolutiva, slo muestra el producto final de la evolucin.
Mientras la clasificacin filogentica trata de expresar de las relaciones evolutivas entre
los organismos, es el reflejo del grado de cambios en la escala evolutiva a nivel
genmico. En el Cuadro 4, se enlistan las tcnicas empleadas en la caracterizacin
bacteriana y el nivel de informacin que proporciona, tanto fenotpica, como genotpica.

Cuadro 4. Lista de tcnicas usadas en la caracterizacin bacteriana polifsica.

INFORMACION A NIVEL GENMICO
Acido desoxirribonuclico (ADN)
Acido Ribonuclico (ARN)
ADN Total:
%G+C
Patrones de restriccin (RFLP, PFGE).
Tamao genmico.
Hibridacin ADN:ADN.

Secuenciacin
Perfiles de ARN ribosmico de bajo peso
molecular.
Sondas de ARN.
Hibridacin ADN:ARN.

Segmentos de ADN:
Perfil electroforrico, basados en PCR:
Ribotipado, ARDRA, RAPD, AFLP, MSPCR, PCR-RFLP (ITS y otros genes), repPCR.
Sondas de ADN.
Secuenciacin del ADN.
INFORMACIN A NIVEL FENOTPICO
Protenas
Patrones electroforticos de protenas celulares totales o
Protenas de pared celular (1 2 dimensiones).
Patrones Enzimticos (Electroforesis de multilocus enzimtico).
Marcadores Quimiotaxonmicos

Expresin de Caractersticas

Acidos grasos celulaes.

Acidos miclicos.
Lpidos polares.
Quinonas.
Poliaminas.
Composicin de la pared celular.
Exopolisacridos.

Morfologa.
Fisiologa (fermentacin/oxidacin de
sustratos).
Enzimologa.
Serologa (anticuerpos monoclonales o
policlonales).

RFLP (Fragmentos de restriccin de tamao polimrfico)

PFGE (Electroforesis de campo pulsado)
ARDRA PCR-RFLP (Anlisis de Restriccin de DNA Amplificado por PCR: ITS u
otros genes)
RAPD (Amplificacin de fragmentos polimrficos de DNA al azar).
AFLP (Fragmentos amplificados de tamao polimrfico)
MS-PCR (Micro/minisatlites).

La unidad bsica en la sistemtica es la especie y est considerada como un grupo

de cepas ms o menos definidas subjetivamente basndose en criterios seleccionados por
el taxnomo, lo que repercute en el nmero de especies en un gnero, ya que estarn de
acuerdo a sus objetivos y los criterios adoptados para definir la especie. Cowan (1968)
sugiri que "existen tal cantidad de ideas sobre el concepto de especie, como bilogos
hay en el mundo y muchos han cambiado de idea durante el curso de su vida
profesional". En bacteriologa, no existe un trmino oficial para la definicin de una
especie, pero puede ser til distinguir una taxoespecie, que es un grupo de especies con
alta similitud, de una genoespecie que son un grupo de organismos capaces de producir
intercambios genticos, entre los dos forman una especie genmica que es un grupo que
muestra altos valores de homologa DNA-DNA. Fox et al. (1992), propusieron que las
cepas con secuencias idnticas a nivel del RNAr 16S debern ser consideradas como
pertenecientes a especies complejas de RNAr o superespecies ribosmicas. Estas
definiciones paralelas son el reflejo de la dificultad a la que se enfrenta el taxnomo para
integrar subjetivamente los criterios escogidos para el anlisis (Vandame et al., 1996;
Goodfellow and Minnikin, 1985; Stackebrandt and Goodfellow, 1991).
Stackebrandt y Goebel (1994) presentaron una nota taxonmica sobre el papel que
desempean los anlisis de reasociacin DNA-DNA y la secuenciacin del RNAr 16S en
la definicin actual de especie en bacteriologa, concluyen que de acuerdo a la
compilacin de datos, los organismos que comparten mas del 97% de similitud de la
estructura primaria del RNAr y que tienen un valor de reasociacin DNA-DNA > 70%,
independientemente del mtodo usado, pertenecen a una misma especie.
La taxonoma numrica clasificacin con ayuda de sistemas estadsticos, implica la
generacin de grandes bases de datos de muchos organismos, agrupadas en "clusters" de
acuerdo a los caracteres genotpicos o fenotpicos compartidos, tambin llamados
unidades taxonmicas operacionales (OTU's). La aplicacin de los mtodos de taxonoma
numrica ha dado lugar al mejoramiento de la clasificacin bacteriana.
Los estudios de taxonoma numrica, basados en las caractersticas genticas de las
bacterias, se consideran una herramienta poderosa para determinar relaciones
filogenticas entre los organismos y para establecer relaciones por debajo de gnero. En
aos recientes, se han desarrollado una gran variedad de herramientas moleculares que

permiten una clasificacin taxonmica ms precisa y se ha demostrado la utilidad de

algunas de las metodologas en la caracterizacin de aislados bacterianos a nivel de cepas
(Swaminathan y Matar, 1993; Harris y Griffiths, 1992; Farber, 1996; Wolcott, 1991;
Moreira et al., 1995; Zhong et al., 1998; Schleifer et al., 1995b; Goodfellow y Minniken,
1985). En el Cuadro 5, se muestra una lista de tcnicas basadas en el anlisis de
caractersticas celulares, genotpicos y fenotpicos, con valor potencial en estudios
taxonmicos y en el tipado de bacterias, se muestra adems el nivel de resolucin, en los
casos en que se conoce.

Tipado de plsmidos.

Los plsmidos son elementos extracromosmicos de DNA generalmente circular,

de doble cadena, superenrollado, autoreplicantes y de muy diversos tamaos. Pueden
conferirle a la clula propiedades esenciales para la supervivencia en determinadas
condiciones ambientales, de forma que la inestabilidad metablica de las bacterias
lcticas puede ser debida a ellos entre otras causas. En la aplicacin ms bsica de la
tcnica de tipado de plsmidos, stos debern ser aislados y separados por electroforesis
en agarosa para determinar su nmero y tamao. La principal desventaja de la tcnica se
debe a la inestabilidad de los plsmidos y est sujeta a que la especie los posea (Farber,
1996; Pot et al., 1994; Moreira et al., 1995; Swaminathan y Matar; 1993; OSullivan y
Klaenhammer, 1993; Vescovo et al., 1992; Lee-Wickner y Chassy, 1985).

Mtodos de restriccin enzimtica.

El mtodo de restriccin enzimtica fue uno de los primeros esquemas de tipado

basados en el anlisis del DNA cromosmico, normalmente es conocido con el nombre
de anlisis de restriccin enzimtica (REA); anlisis de microrestriccin, si se usa una
enzima de corte frecuente para la digestin del DNA y electroforesis convencional para
separar los fragmentos de DNA. Se conoce como macrorestriccin, cuando se usa una
endonucleasa con poca frecuencia de reconocimiento y corte en el DNA y electroforesis
de campo pulsado para visualizar las bandas de DNA.

Cepa

Especie

Gnero

Tcnica

Familia

Cuadro 5. Nivel de resolucin de las tcnicas moleculares comnmente usadas en el

anlisis taxonmico de bacterias.

Polimorfismo de los fragmentos de restriccin (RFLP)

Anlisis de Macrorestriccin (PFGE)
Ribotipado
Amplificacin del DNA (AFLP, AP-PCR, rep-PCR, DAF,
RAPD, ARDRA)
Tipado de fagos y bacteriocinas
Tcnicas serolgicas (anticuerpos monoclonales)
Zimogramas
Patrn de protenas celulares totales
Hibridacin DNA-DNA
%G+C
tDNA-PCR
Marcadores quimiotaxonmicos (poliaminas, quinonas)
Acidos grasos celulares
Estructura de la pared celular
Fenotipado (clsico, API, Biolog, etc.)
Secuenciacin del RNAr (oligonucleotide cataloguing)
Sondas de DNA
Secuenciacin del DNA
PFGE Electroforesis de campo pulsado, PCR Reaccin en cadena de la polimerasa, AFLP Fragmentos
amplificados de tamao polimrfico, ARDRA Anlisis de restriccin del DNA ribosmico amplificado por
PCR. Tomada de Vandame et al.., 1996.

En ambos casos, la visualizacin de las bandas se lleva a cabo bajo luz UV, con el
uso del colorante fluorescente Bromuro de Etidio, que se intercala entre las bases del
cido nucleico y fluoresce. Los patrones de bandas que aparecen despus de la digestin
con una enzima y separacin de las bandas de DNA, se conoce como perfil de restriccin.
Las diferencias en el bandeo de dos aislamientos se conoce con el nombre de RFLP
(Restriction Fragment Length Polimorphism), las cuales son consecuencia de las
diferencias en la composicin de bases en el DNA de los organismos examinados y
pueden deberse a sustituciones de pares de bases, inserciones o deleciones del DNA, o
bien a rearreglos de fragmentos del DNA (Farber, 1996; Swaminathan y Matar, 1993;
Harris y Griffiths, 1992; Wolcott, 1991; Moreira et al., 1995; Zhong et al., 1998;
Schleifer et al.., 1995; Goodfellow y Minniken, 1985).

Anlisis de Macrorestriccin.

Tambin conocida como PFGE (Pulse Field Gel Electrophoresis), es un mtodo

de tipado muy discriminatorio y reproducible. PFGE implica el que las clulas de los
organismos a analizar sean embebidos en agarosa y la lisis se lleva a cabo in situ.
Posteriormente se procede a la digestin del DNA con enzimas de restriccin de corte
poco frecuente, que reconocen 6, 8 o ms bases en su sitio de corte, dando lugar a
patrones de restriccin cromosmica ms fiables, ya que se trabaja con DNA intacto.
La caracterizacin y comparacin de las especies bacterianas es altamente
discriminatoria, sin embargo, la utilidad de la tcnica es dependiente de la seleccin de
las enzimas de restriccin. Al inicio del desarrollo de la tcnica, la seleccin se haca
empricamente a base de prueba y error, sin embargo, Owen (1989) sugiri llevar a cabo
la seleccin de las enzimas de restriccin en base al % mol de G+C del DNA
cromosmico. McClelland et al. (1987) utilizaron un anlisis estadstico de prediccin,
basndose en las frecuencias de mono, di y trinucletidos en las secuencias publicadas en
las bases de datos. Las frecuencias esperadas se calcularon como cadenas de Markov
(Romero y Znica, 1993) y concluyeron que la mejor seleccin de enzimas de corte poco
frecuente podra llevarse a cabo usando los siguientes criterios:

Genomas con un contenido <40% de G+C se debern digerir con enzimas

hexamricas con sitios de reconocimiento ricos en G+C, como SacII (CCGCGG),
SmaI (CCCGGG), RsrII (CGGWCGG), NaeI (GCCGGC) NarI (GGCGCC) y
EagI (CGGCCG).

Genomas con un contenido de 40-50 mol% de G+C, con enzimas hexamricas

con sitios de reconocimiento con alto contenido de G+C y que preferentemente
tengan la secuencia CTAG AvrII (CCTAGG), NheI (GCTAGC), o bien con
enzimas octamricas ricas en G+C NotI (GCGGCCGC), SfiI (GGCCN5GGCC).

Genomas con un contenido de 50 a 65 mol% de G+C, se usan preferentemente

enzimas que reconocen secuencias ricas en A+T y que tengan la secuencia
CTAG, como XbaI (TCTAGA), SpeI (ACTAGT), en genomas que estn por
debajo del 55 mol% de G+C puede usarse NotI y SfiI.

Para genomas con un contenido >65 mol% de G+C se utilizan enzimas

hexamricas con afinidad por secuencias ricas en A+T, en particular DraI
(TTTAAA) y SspI (AATATT).

En los ltimos aos se han utilizado nuevas endonucleasas para la construccin de

mapas genmicos, ya que se requieren enzimas que digieran el genoma en un nmero de
fragmentos fcilmente analizables. La enzima I-CeuI, es un miembro de una familia de
endonucleasas que catalizan la movilidad de intrones del grupo I y est codificada por un
intrn mvil (CeLSU.5) en el RNAr 23S del cloroplasto de Chlamydomonas eugametos.
Producen un corte en la doble cadena en el sitio al que se movern (homing
endonucleasas), necesita una secuencia de reconocimiento de 26 pb
(TAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGA) para hacer el corte del DNA donde se
alojar (entre las bases subrayadas AG de la secuencia anterior). Debido a que los genes
del RNAr estn altamente conservados y a los resultados con anlisis hechos con un
grupo de bacterias Gram positivas y Gram negativas, se ha llegado a la conclusin de que
sta enzima slo corta dentro de los genes ribosmicos. El punto de corte es ligeramente
variable de acuerdo al gnero bacteriano, en E. coli se encuentra en el nucletido 1927; B.
subtilis en el 1864; L. monocytogenes, en el 1962 y S. aureus en el 1956, del gen rrn 23S.
El anlisis con la enzima I-CeuI, tambin es til para determinar el nmero y localizacin

de los genes ribosmicos dentro del genoma bacteriano (Marshal y Lemieux, 1992; Liu et
al., 1993) En la prctica, la seleccin de enzimas ser ms difcil para especies que tienen
alrededor de 50 mol% de G+C.
La movilidad electrofortica de los fragmentos de restriccin depende del tiempo
de pulso, es decir, el tiempo que dura la aplicacin de un campo elctrico en una
direccin antes de que cambie a la siguiente, a mayor tiempo de pulso, mayor es la
resolucin de los fragmentos de alto peso molecular. Los tiempos tpicos varan de 0.1s
para molculas mayores de 10 kpb a 1000s para molculas cercanas a los 10 Mpb. Otros
parmetros importantes adems del tamao molecular de los fragmentos, son la fuerza
del campo aplicado, concentracin del gel (por su efecto en el tamao del poro),
temperatura y ngulo de reorientacin de la energa. Todos stos parmetros debern ser
tomados en cuenta de acuerdo al sistema electrofortico usado: OFAGE (Ortogonal Field
Alternating Gel Electrophoresis), CHEF (Contour-clamped Homogeneous Electric Field),
FIGE (Field Inversin Gel Electrophoresis), TAFE (Transverse Alternating Field
Electrophoresis) y Electroforesis en Gel Giratorio (Rotating gel) (Bustamante et al.,
1993; Chu, 1990; Schwartz y Cantor, 1984).
Esta tcnica ha demostrado su utilidad en taxonoma y epidemiologa, as mismo
para la caracterizacin de genomas y en la determinacin del tamao y mapeo
cromosmico (Ze-Ze, 1998; Farber, 1996; Moreira, et al., 1995; Tanskanen, et al, 1990;
Tenover, et al., 1995; Mndez-Alvarez, et al, 1995; Daniel, 1995; Johansson et al., 1995;
Sthl et al., 1990, Harsono et al., 1993).

Ribotipado.

El RFLP es un mtodo til en la caracterizacin de microorganismos, sin

embargo, dependiendo de la enzima de restriccin usada, la interpretacin de los RFLP
puede ser muy difcil debido a la multitud de fragmentos y no se pueden observar
cambios sutiles. Transfiriendo esos fragmentos de DNA a membranas e hibridando con
una sonda especfica reduce grandemente el nmero de fragmentos a analizar, ya que slo
se observan aquellos que tienen secuencias complementarias a las sondas. Sin embargo,
la hibridacin con sondas de genes especficos implicados en ciertas caractersticas

biolgicas es probable que no tenga poder discriminatorio, ya que mayora de los genes
bacterianos estn presentes en una sola copia, mientras que los operones del RNAr (rrn)
son estructuras altamente conservadas durante la evolucin y pueden estar presentes en
varias copias en el cromosoma bacteriano (2-11), por lo que la hibridacin con sondas
que contienen secuencias de los genes ribosmicos son de gran utilidad. El nmero de
bandas hibridadas coincidir con el nmero de operones rrn, dependiendo de las enzimas
empleadas en la digestin. El agrupamiento de bacterias de acuerdo a sta tcnica se le
llama Ribotipado y se ha encontrado que es altamente discriminatorio a nivel de cepa y
especie en varios grupos bacterianos. La sonda puede ser de DNAr 16S o bien de 16+23S
y marcada por quimioluminiscencia o radiactividad (Popovic et al., 1993; Gustaferro,
1993; Rodtong y Tannock, 1993; Grimont y Grimont, 1986; Hltke et al., 1992;
Gustaferro y Persing, et al., 1992; Williams y Collins, 1992, Weisburg, et al., 1991).

Sistemas de Tipado Basados en la Tcnica de PCR.

La tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es un mtodo de sntesis

enzimtica de ADN in vitro. La reaccin usa cebadores oligonucleotdicos o iniciadores,
que hibridan en extremos opuestos, en las cadenas complementarias del DNA,
flanqueando el fragmento que va a ser amplificado. La elongacin de los cebadores es
catalizada por la Taq DNA polimerasa, que es una enzima termoestable, aislada de
Thermus aquaticus. Una serie de ciclos repetidos que implican la desnaturalizacin del
DNA molde, reconocimiento del cebador (anillado) y la extensin del cebador por la Taq
DNA polimerasa, dan como resultado la acumulacin exponencial de un fragmento
especifico del DNA. Debido a que los productos de extensin sintetizados en un ciclo,
puede servir como molde en el siguiente, el numero de copias del DNA se aumenta con
cada ciclo, por lo que, una reaccin de PCR de 20 ciclos produce alrededor de 106-1011
copias del fragmento de DNA deseado (Giovannoni, 1991; Swaminathan and Matar,
1993; Persing, 1993).
En la mayora de las aplicaciones de la tcnica de PCR, son la secuencia y la
concentracin del cebador los que determinan el xito del anlisis. La concentracin
ptima del cebador generalmente es de 0.1-0.5 M. Debido a que es una tcnica muy

poderosa para la bsqueda y amplificacin de DNA, en los ltimos aos se han hecho
modificaciones a la tcnica para aplicarlas a varias reas de la Biologa: como la
medicina forense, deteccin de patgenos, caracterizacin de especmenes de museo, etc.
La amplificacin por PCR de secuencias de ADN ha probado ser de gran utilidad en
muchos campos de la investigacin evolutiva y ecolgica. La facilidad para obtener
marcadores de DNA amplificados al azar a partir de cualquier genoma de inters es una
de las causas por las que se han diseado varias tcnicas de caracterizacin genmica, las
cuales difieres principalmente en nombre, detalles tcnicos y el nmero de marcadores
amplificados y visualizados: AP-PCR (Welsh y McClelland, 1990). RAPD (Williams et
all., 1990), DAF (Caetano-Anolls et all., 1991), AFLP (Zabeau y Vos 1993), MSP-PCR
(Vogel y Scolink, 1997), REP-PCR (Rademaker y DeBrujin, 1997). A continuacin se
mencionan slo algunas de ellas, ya que el fundamento de PCR es el mismo (Vandame et
al., 1996; Taylor, 1991; Hoelzel y Green, 1996; Giovannoni, 1991; Swaminathan and
Matar, 1993; Persing, 1993).

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). El uso de cebadores pequeos

aumenta la probabilidad de reconocimiento al DNA molde y por tanto, la amplificacin
de un mayor nmero de segmentos que pueden resolverse por medio de electroforesis
convencional. Esta es la base del anlisis de RAPD o amplificacin de fragmentos de
DNA al azar. La tcnica de RAPD es un mtodo de genotipado sencillo y rpido. Difiere
ligeramente de la reaccin normal de PCR en dos aspectos esenciales: a) los cebadores
pueden ser cortos y las secuencias se escogen al azar, por lo que no se necesita conocer
previamente la secuencia del DNA estudiado y debido al tamao del cebador (pueden
usarse oligonucletidos tan pequeos como 5 pb), tericamente habr muchos sitios que
puede reconocer a lo largo del genoma; y b) la temperatura de anillado para RAPD es
menor que el usado en un PCR normal, lo que da a un solo cebador una mayor
oportunidad de anillarse a varios sitios del genoma, amplificando as las secuencias del
DNA (Welsh y McClelland, 1990; Williams et al., 1990; Cocconcelli et al., 1995;
Mazurier y Wernars, 1992; Welsh y McClelland, 1991; Du Plessis y Dicks, 1995;
Tilsala-Timisjrvi y Alatossava, 1998; Venugopal et al., 1993; Welsh y McClelland,
1994; Drake et al., 1996; Veyrat et al., 1999).

AFLP. El anlisis de amplificacin polimrfica de fragmentos de restriccin. Es

una tcnica desarrollada por Zabeau y Vos (1993) para el anlisis del genoma de plantas,
sin embargo, ha mostrado ser de gran utilidad en la caracterizacin genmica de
animales, bacterias, hongos y levaduras. La tcnica consiste bsicamente de tres pasos: i)
Digestin con dos enzimas de restriccin del ADN genmico. Se digiere con dos
enzimas de restriccin, una con 6 pb de secuencia de reconocimiento (ej., EcoRI) y otra
con 4 pb (MesI) y la ligacin de adaptadores especficos en los sitios de reconocimiento
para todos los fragmentos de restriccin; (ii) Amplificacin selectiva por PCR de los
fragmentos con un par de oligonucletidos que tienen como sitios blanco las secuencias
correspondientes al adaptador-sitio de restriccin y (iii) Separacin electrofortica de los
productos de PCR en gel de pliacrilamida. La reaccin de PCR es diseada bajo fuertes
condiciones de astringencia, de tal forma que slo se amplifiquen los fragmentos cuya
distribucin de bases permitan un reconocimiento perfecto (1 de cada 4 fragmentos de
restriccin, aproximadamente 40 a 200 bandas), entre el oligonucletido y el fragmento
de ADN (van Steenbergen et all., 1995; Vos et all., 1995).
Adems de separar los frgmentos por electroforesis en gel de poliacrilamida,
puede hacerse igualmente por autoradiografa, lo que implica utilizar marcacin
radiactiva de uno de los oligonucletidos utilizados en la amplificacin, se recomienda
marcar el que corresponda al reconocimiento de la enzima de corte poco frecuente (6pb).
Otras alternativas son el uso de sondas no radiactivas, marcando los oligonucletidos con
digoxigenina, coloracin directa con nitrato de plata. El mtodo mas eficiente es el uso de
un cebador marcado con un fluorocromo y la deteccin de los fragmentos se realizan en
un secuenciador automtico (Jansen et all., 1996; Karp y Edwards, 1997).

MSP-PCR (Micro/minosatllite-Primed PCR). Con el reconocimiento de adems

de los genes repetidos en tandem (ARNr, ARNt e histonas), las clulas eucariotas cuentan
con otro tipo de secuencias repetidas (SSR secuencias simples repetidas). Estas
secuencias estan formadas po unidasdes de mono, di, tri, tetra o pentanucletidos
dispersos en el genoma de animales, plantas microorganismos. Originalmente se les dio
el nombre de secuencias satlite, debido a que algunas variedades de SSR se separan del
restante ADN durante la centrifugacin en CsCl, formando una banda satlite. Se

reconocen actualmente dos tipos de secuencias repetidas en tandem, aquellas llamadas

microsatlite, por estar formadas de 2 a 10 nucletidos o minisatlite, por estar formadas
por 15 a 30 nucletidos. Estas son estructuras son estables en cuanto a su secuencia, pero
variables en el nmero de repeticiones y distribuidas de forma aleatoria en el cromosoma.
La aplicacin de oligonucletidos dirigidos para la amplificacin de estas secuencias por
PCR, se ha llamado MSP-PCR y permite la amplificacin de perfiles electroforticos que
muestran los polimorfismos que caracteriza a los diferentes genomas. Al igual que
RAPD, se utiliza solo un oligonucletido de tamao pequeo [(GAC)5, (GTG)5,
(GACA)4, csM13], quq puede reconocer cualquier regin microsatlite. Sin embargo,
presenta una ventaja respecto al RAPD y es que muestra una alta reproducibilidad
producida por la astringencia a la que se lleva a cabo la reaccin de PCR y es til para
caracterizacin a nivel de especies y en el anlisis de variabilidad intraespecfica (a nivel
de cepa). La separacin de las bandas amplificadas puede realizarse ya sea en un gel de
poliacrilamida, o bien, en agarosa de alta resolucin (Karp y Edwards, 1997; Vogel y
Scolnik, 1997).

Mtodos que utilizan las diferencias estructurales y de secuencia en los genes que
codifican los RNAr (rrn).

En las bacterias, los operones rrn estn compuestos de tres tipos de RNAr: 5S, de
aproximadamente 120 nucletidos (nt), 16S con aproximadamente 1600 nt y el 23S de
aproximadamente 2800 nt. El RNAr 5S no se considera de utilidad para la caracterizacin
filogentica, por ser una molcula pequea, la informacin que proporciona es muy
limitada con respecto a las molculas del RNAr 16S y 23S. Los primeros anlisis
filogenticos llevados a cabo con procariotas se hicieron sobre secuenciacin parcial del
RNAr 16S (~25%), por Woese et al. (1987) y con el tiempo se ha establecido como un
mtodo estndar para la identificacin de especies, gneros y familias de bacterias. El
RNAr 23S tiene aproximadamente el doble de tamao que el RNAr 16S, por lo que
puede darnos el doble de informacin y puede ser til para confirmar los rboles
filogenticos o resolver los errores o discrepancias existentes en la filogenia de grupos
taxonmicos. La estructura secundaria del RNAr 23S exhibe seis dominios, mientras que

la del RNAr 16S cuenta con tres; el RNAr 23S tiene 100 hlices, mientras el RNAr 16S
slo 50 (Gutell et al., 1994; Ludwig y Schleifer, 1994; Neefs et al., 1990; Olsen et al.,
1986; Vandame et al., 1996). El hecho de que muchas de las especies bacterianas tengan
mltiples copias de los genes que codifican el RNAr, da lugar a la posibilidad de que se
produzcan variaciones en las regiones intergnicas o ITS entre cepas, especies y gneros
y que por tanto sean usadas con propsitos de identificacin y tipado (Grtler y Stanisich,
1996; Jensen et al., 1993; McClelland et al., 1992; Welsh y McClelland, 1992;
Daffonchio et al., 1998).
Existen varias razones para utilizar el RNAr como cronmetros moleculares en
estudios filogenticos:
El RNAr es el elemento clave en la sntesis de protenas, por lo que siempre estar
presente en todos los organismos. La estructura general es extremadamente conservada y
fcilmente identificable por su tamao. La mayora de sus secuencias nucleotdicas estn
conservadas y junto a los elementos de estructura secundaria, permite el alineamiento de
las regiones variables, para inferir filogenias. Los RNAr constituyen un componente
significativo de la masa celular y normalmente estn presentes en ms de 1 copia en el
cromosoma, por lo que son fcilmente recuperados a partir de cualquier organismo. Los
RNAr proveen suficiente informacin en sus secuencias para hacer comparaciones
estadsticamente significativas.
La comparacin de las estructuras con valor filogentico de las secuencias del
DNAr 16S y 23S, son indispensables en la taxonoma polifsica (Vandame et al., 1996).
Tambin se ha demostrado que el anlisis de las secuencias parciales tiene valor en la
caracterizacin bacteriana, aunque diversos autores no recomiendan que sea usado para
extraer conclusiones taxonmicas a menos que se demuestre que dan un grado de
similitud igual o muy parecido a cuando se usa la secuencia completa (Olsen et al., 1986).
Como ejemplo del uso de secuencias parciales del DNAr 16S podemos citar los trabajos
hechos por Lane et al. (1985) que usaron diferentes secuencias parciales del RNAr 16S
para estudios filogenticos. De igual manera, McCarroll et al. (1983) trabajaron con
secuencias parciales del RNAr 16S de eubacteria (E. coli), arqueobacterias
(Halobacterium volcanii) y eucariotas (Dictyostelum discoideum), encontraron que los
rboles inferidos de dichas secuencias tenan topologas similares a las obtenidas con

secuencias completas. Recientemente, Sohier et al. (1999) usaron un fragmento de 500 pb

del inicio del DNAr 16S para la diferenciacin de cepas que haban sido identificadas
anteriormente como L. brevis y que usando el fragmento mencionado, concluyen que las
cepas pertenecen a L. hilgardii. Apoyndose en otros criterios genotpicos y fenotpicos,
propones la reclasificacin de las cepas mencionadas. Everett et al. (1999) utilizaron
secuencias de 600 pb del dominio I de los DNAr 16S y 23S para revisitar la taxonoma de
la familia Chlamydaceae, concluyeron que usando ste fragmento para el anlisis, se
pueden distinguir diferentes cepas a nivel de familia, gnero y especie.
Las relaciones filogenticas y evolutivas pueden ser determinadas por varios
mtodos una vez que se han hecho los alineamientos de las secuencias. Los rboles
filogenticos reflejan de forma fiable las relaciones inferidas. Una alternativa para inferir
relaciones filogenticas son las "secuencias signatura" u oligonucletidos signatura. Por
definicin, la secuencia o nucletidos signatura son estructuras que varan muy poco
dentro de cada grupo principal, pero varan aleatoriamente entre grupos. Pueden ser
considerados una clave en la clasificacin, para la divisin filogentica de secuencias del
RNAr afines, por lo que determinando la identidad de los nucletidos al usar un nmero
limitado de secuencias, podremos llegar a conocer el grupo filogentico al que pertenece
la secuencia desconocida (Olsen et al., 1986; Mori et al., 1997; Vandame et al., 1996).

Secuenciacin del DNAr 16S y 23S. Para llevar a cabo el anlisis del RNAr, se
han empleado varios mtodos, como es la catalogacin de oligonucletidos del RNAr
16S, que consiste en la obtencin de oligonucletidos resistentes a la digestin con la
ribonucleasa T1, es una tcnica tardada y tediosa, por lo que ha sido poco utilizada
(Stackebradt et al., 1983). Posteriormente se utilizaron las tcnicas de secuenciacin de
RNAr clonado, secuenciacin directa del RNA usando transcriptasa reversa y
secuenciacin del DNAr amplificado por PCR. Esta ltima tcnica es de gran aplicacin,
ya que los fragmentos generados pueden ser secuenciados directamente (Vandame et al.,
1996; Collins et al., 1991; Collins et al., 1989a; Ludwig y Schleifer, 1994; Fox et al.,
1992).
Anlisis de Restriccin de DNAr Amplificado por PCR (ARDRA). En la
taxonoma bacteriana moderna, el anlisis de las secuencias del DNAr 16S se ha

convertido en un mtodo habitual para la investigacin de relaciones filogenticas. Sin

embargo, como mtodo rutinario para muestras mltiples es poco prctico, por lo que se
ha desarrollado el mtodo conocido como ARDRA (Amplified Ribosomal DNA
Restriction Analysis), o PCR/RFLP, para el tipado. El DNAr 16S se amplifica por PCR y
se digiere con enzimas de restriccin, la tcnica ha mostrado ser de utilidad para
identificacin a nivel de especies y es aplicada en bacterias de importancia clnica e
industrial (Vaneechoutte, et al., 1995; Ulrich y Mller, 1998; Urakawa, et al., 1997;
Grtler, et al., 1991; Villani, et al., 1997).
Polimorfismo de la regin espaciadora intergenrica del RNAr por PCR (ITS). En
los procariotas, los tres genes que codifican el RNAr (16S, 23S y 5S), estn separadas
por regiones espaciadoras, las cuales pueden mostrar variaciones en tamao y secuencia a
nivel de gnero y de especie. La mayora de los gneros bacterianos contienen mltiples
copias del operon ribosmico, por lo que se pueden obtener mltiples bandas despus de
la amplificacin del DNA. La amplificacin se lleva a cabo con cebadores obtenidos de
secuencias conservadas del RNAr (Jensen et al., 1993; McClelland et al., 1992; Van
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