"ANALISIS ELECTROFORTICO DEL ADN

I.

INTRODUCCION:
La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del
anlisis de los cidos nucleicos y protenas. Y as como el microscopio permite
visualizar microorganismos y estructuras similares, la electroforesis nos ayuda
a observar los cidos nucleicos y protenas al final del procedimiento.
El principio bsico de la electroforesis consiste en la migracin de las molculas
a travs de un gel u otro tipo de matriz de naturaleza porosa, en el cual, por
accin de un campo elctrico, sern separadas de acuerdo a su tamao (peso
molecular), forma y carga neta (a mayor carga neta, la molcula migrar ms
rpido; a mayor friccin, la movilidad ser menor). La movilidad de las
partculas est determinada de forma proporcional al voltaje aplicado y la carga
neta de la molcula y de forma inversamente proporcional a la friccin de la
molcula; esta ltima depende de la forma y el tamao de la misma.
Generalmente, se usan dos tipos: de agarosa y acrilamida. La agarosa se
emplea para separar fragmentos de ADN con tamaos de 100 pares de bases
hasta 20 kilobases. Los geles de acrilamida se usan en el rango de >200 pares
de bases.
Para controlar el avance de la separacin de las molculas en la matriz y
establecer un patrn de fragmentos, las molculas debern ser teidas con
diferentes colorantes. Estos pasos facilitan la visualizacin de las molculas a
manera de simples bandas las cuales sern posteriormente analizadas e
interpretadas. Las bandas del ADN o fragmentos de un determinado tamao
pueden observarse en estos geles al intercalar molculas de bromuro de etidio.
El bromuro de etidio se une al ADN y emite una coloracin naranja cuando se
coloca en un transiluminador con luz ultravioleta.
Es importante sealar que la electroforesis en asociacin con otras tcnicas
tales como PCR, e hibridacin, brinda una gran ayuda en el campo de la salud.
Gracias a esta tcnica es posible visualizar las bandas de ARN o ADN de
patgenos, detectar cambios o mutaciones a nivel gentico, visualizar una
nueva protena, entre otros.

II.

OBJETIVOS:

Establecer los procedimientos bsicos de la tcnica de electroforesis.

Realizar la electroforesis del ADN en cmara horizontal.
Separar las molculas de ADN de acuerdo a su peso molecular a travs de geles
de agarosa.
III.

FUNDAMENTO TEORICO:

La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del

anlisis de los cidos nucleicos y protenas. Y as como el microscopio permite
visualizar microorganismos y estructuras similares, la electroforesis nos ayuda
a observar los cidos nucleicos y protenas al final del procedimiento.
El principio bsico de la electroforesis consiste en la migracin de las molculas
a travs de un gel u otro tipo de matriz de naturaleza porosa, en el cual, por
accin de un campo elctrico, sern separadas de acuerdo a su tamao (peso
molecular), forma y carga neta (a mayor carga neta, la molcula migrar ms
rpido; a mayor friccin, la movilidad ser menor). La movilidad de las
partculas est determinada de forma proporcional al voltaje aplicado y la carga
neta de la molcula y de forma inversamente proporcional a la friccin de la
molcula; esta ltima depende de la forma y el tamao de la misma.
Generalmente, se usan dos tipos: de agarosa y acrilamida. La agarosa se
emplea para separar fragmentos de ADN con tamaos de 100 pares de bases
hasta 20 kilobases. Los geles de acrilamida se usan en el rango de >200 pares
de bases.

Fig.1.- Preparacin del gel de acrilamida.

Para controlar el avance de la separacin de las molculas en la matriz y
establecer un patrn de fragmentos, las molculas debern ser teidas con
diferentes colorantes. Estos pasos facilitan la visualizacin de las molculas a
manera de simples bandas las cuales sern posteriormente analizadas e
interpretadas. Las bandas del ADN o fragmentos de un determinado tamao
pueden observarse en estos geles al intercalar molculas de bromuro de etidio.
El bromuro de etidio se une al ADN y emite una coloracin naranja cuando se
coloca en un transiluminador con luz ultravioleta.
Es importante sealar que la electroforesis en asociacin con otras tcnicas
tales como PCR, e hibridacin, brinda una gran ayuda en el campo de la salud.
Gracias a esta tcnica es posible visualizar las bandas de ARN o ADN de
patgenos, detectar cambios o mutaciones a nivel gentico, visualizar una
nueva protena, entre otros.
Electroforesis de cidos nucleicos:
No slo las protenas presentan carga y son solubles, tambin los cidos
nucleicos tienen la capacidad de migrar en un campo elctrico y, por tanto, son
susceptibles de ser separados por electroforesis, aunque con algunas
variaciones con respecto de las protenas:
Son molculas de mayor tamao: Lo que implica que el tamao de poro que
nos da la acrilamida puede ser demasiado pequeo.

Presenta gran cantidad de conformaciones y de tamaos: Lo que supone una

gran variabilidad a la hora de disear los experimentos, ya que no es lo mismo
separar cromosomas que simples nucletidos.
En principio, es anloga a la electroforesis de protenas en condiciones
desnaturalizantes, salvo que aqu no hace falta el SDS para conferir la misma
relacin carga/masa es todas las molculas (aunque se utiliza en el tampn de
carga), ya que en los cidos nucleicos la parte que confiere la carga es el
grupo fosfato, y est presente de forma regular en la estructura.
En estas condiciones, y al contrario que las protenas, si realizramos una
electroforesis libre, observaramos como todas las molculas migraran hacia el
polo positivo con la misma velocidad al tener igual. Esta propiedad no nos
sirve de mucho, pero hay que decir que en un soporte en gel, como los que
vamos a utilizar, las molculas de cido nucleico se separan en funcin de su
tamao.

Soportes
Como ya he avanzado, la acrilamida se queda pequea en la mayora de las
electroforesis de cido nucleico, y es por lo que se utiliza otro tipo de soporte.

Agarosa:
polmero que funde a 80 - 90 C (aunque hay agarosas de muy diverso tipo,
entre las que se encuentran las de bajo punto de fusin), y forman gel a unos
30 C. El rango de concentracin oscila entre el 0,3 %, que puede separar
molculas del orden de 5 a 60 Kb, y el 2% que puede separar cidos nucleicos
de 0,1 a 0,2 Kb.

Poliacrilamida:
de la que ya hemos hablado y que para cidos nucleicos ronda unas
concentraciones del orden del 3,5%, con una capacidad separadora de 1.000 a
2.000 bases y del 20%, que puede diferenciar molculas de 6 a 50 bases.
Permite separar molculas que slo difieren en un solo nucletido, que implica
la utilizacin de geles de poliacrilamida en secuenciacin.
La agarosa es, por tanto, el soporte ms utilizado, y supone la aparicin de
nuevos aparatos, al ser ms frgil que la acrilamida y no poder intercambiarse
los moldes. sta fragilidad hace que, adems de tener que ser geles ms
gruesos, se hagan y se utilicen de forma horizontal, ya que si no se
resquebrajaran.

Fig.2.- Preparacin de el gel de acrilamida.

Para los geles de agarosa hay moldes rectangulares que estn abiertos por los
dos extremos, de modo que antes de echar la agarosa fundida en el molde hay
que sellar esos dos extremos, funcin que realiza una cinta adhesiva que se
coloca segn la figura. Una vez sellado el molde por los cuatro costados se

deposita la agarosa fundida con cuidado de no formar burbujas. Una vez lleno a
una altura prudencial, y con la agarosa todava lquida se procede a colocar el
peine, normalmente a cualquiera de los extremos del molde, teniendo siempre
cuidado de que el peine no toque el fondo del molde. Las formas de sujetar el
peine una vez colocado son muy diversas y suelen depender de la pasta que
tenga el laboratorio, desde peines dobles con tuercas reguladoras (como el que
nos ense el profesor en clase), hasta sujetar el peine con dos pinzas para
papel pasando por soportes de metacrilato al que se adhiere el peine. En
general es conveniente que se haga el ajuste de altura antes de echar la
agarosa en el molde.
Como se observa tambin en la figura, una vez polimerizado el gel (proceso
que requiere enfriamiento de la agarosa, no reacciones qumicas como en la
acrilamida), se le retiran las cintas adhesivas, de modo, que la agarosa queda
libre en los dos extremos del gel, lo que se aprovecha para colocarlo en una
cubeta en forma de puente con los pocillos en la cubeta con el electrodo
negativo. El gel se encuentra sumergido en un electrolito tamponado con TrisBorato (no glicina), para garantizar que los cido nucleico estn cargados
negativamente; por esto a la tcnica se le denomina electroforesis de
inmersin. Las molculas migrarn hacia el polo positivo, de modo que
viajarn en esa direccin por el gel, separndose por tamao (n de
nuletidos).
Al igual que con las protenas, en estas condiciones se debe aadir un
compuesto que aumente la densidad de la muestra y no difunda, o pase a
otros pocillos a la hora de cargar la muestra, y unos marcadores de frente que
nos permitan detener la electroforesis en el momento que lo creamos
oportuno.
Para visualizar las bandas, hay que teir el gel o marcar radiactivamente las
molculas. El mtodo ms utilizado en geles de agarosa es el
del BrEt (bromuro de etidio), del que ya hemos hablado. Se comporta como un
agente intercalante, de modo que, adems de disminuir la densidad de la
molcula, tiene la capacidad de emitir luz cuando se le excita con luz
ultravioleta. Hay que tener cuidado con este compuesto ya que es altamente
cancergeno. En un principio, una vez corrido el gel se retiraba y se pona a
incubar durante un tiempo (30 minutos), a continuacin se miraba la posicin
de las bandas con la lmpara de U.V. Ahora, y para evitar la difusin que se
produca durante la incubacin, se aade el BrEt tanto en la agarosa como en
el electrolito, de modo que, puedes parar la electroforesis y visualizar las
bandas en la lmpara, y si es necesario continuar corriendo el gel sin ningn
problema.

Fig.3.- Mapa conceptual de los componentes.

Hay varios tipos de visores para este tipo de geles, uno que proyecta la luz U.V
por arriba, que implica que tienes que ponerte unas gafas o una careta,
adems de los guantes para protegerte del BrEt, y que lleva incorporado una
cmara, que saca las fotos en negativo. La foto es muy importante ya que
permite trabajar con algo imperecedero, no como el gel, que poco a poco va
difundiendo y perdiendo el BrEt. El otro tipo, sin embargo, presenta la fuente

de luz abajo, y con una pantalla enzima del gel que nos protege de la
radiacin.

Fig.4.- Grficas referidas a las bandas electroforeticas.

Siguiendo con el soporte de agarosa, nos interesa saber como vara con
respecto del tamao del poro, o lo que es lo mismo de la concentracin de
agarosa. Si digerimos una muestra de DNA con una enzima de restriccin y
representamos
los
valores
de de
cada
fragmento
en
diferentes
concentraciones de agarosa, obtendramos una grfica como la de la figura,
donde se observa como aparecen lneas de la misma pendiente, que indican
cmo vara la movilidad con respecto de la concentracin, haciendo que
aumente al aumentar la concentracin.
Fenmenos que alteran :
Uno de los fenmenos que ms se producen es el denominado de inversin
de banda, debido a la tendencia de los fragmentos de tamao medio de DNA
a formar horquillas, lo que hace que queden retenidos en los poros el gel ms
tiempo del necesario, siendo por tanto, adelantados por fragmentos de
mayor tamao. Los de mayor y menor tamao no presentan esta tendencia,
con lo que migran sin problemas.

Fig.5.- Grficas referidas a las bandas electroforeticas.

Esta variacin de del DNA debida a la estructura nos permite separar
fragmentos de igual tamao y con diferente conformacin, como en el caso del
superenrollamiento. Un fragmento circular de DNA se puede encontrar en
formas relajadas o superenrolladas (supercoiled). Si introducimos molculas de
igual tamao y con estructura ms o menos enrolladas veremos como se nos
separan, quedando las ms enrolladas con una movilidad mayor que las
relajadas. De este modo, tambin podemos diferenciar formas O.C. de C.C; de
DNAs s.s. y d.s.; de formas enrolladas y relajadas. Todas, aunque de igual
tamao presentan diferentes movilidades electroforticas. Esta propiedad es
muy til a la hora de identificar elementos extracromosomales (plsmidos).
IV.

MATERIALES Y METODOS:

Cmara de electroforesis horizontal y accesorios.

Fuente de poder
Guantes de latex
Gradillas para tubos eppendorf
Micropipetas y puntas de 20uL
Transluminador

Soluciones y reactivos
Agarosa de grado molecular al 1%

V.

Buffer TBE 10X (Tris base, cido brico, 0.5M EDTA pH 8.0)
Buffer TBE 1X
Buffer de carga 10X (0,25% w/v Azul de bromofenol, 0,25% w/v Xilene cianol,
40% w/v Sucrosa)
Bromuro de etidio
Marcador de peso Molecular
Nota: Para la preparacin del gel es importante tener completamente
ensamblada la cmara de electroforesis ubicndola sobre una superficie
totalmente plana asegurando que no presente algn tipo de declive.
RESULTADOS:

Aplicacin de la muestra
La aplicacion de la muestra para la corrida electroforetica despues de la
preparacion de la agarosa,cada muestra se debe colocar teniendo en cuenta
cual es su contenido,plasmido el DNA extraido de la sangre.

Corrida de la electroforesis
Los fragmentos de DNA corren en cuanto a su peso y a la afinidad de cada
colorante como el xilenxianol y el azul de bromofenol.

Visualizacin del gel

La visualizacion en el caso de utilizar el bromuro de etidio es necesario hacerla
en la oscuridad con una lampara de UV.
En el caso de haber utilizado un marcador se observan las bandas y se
comparan con las del marcador,ademas con esto tambien se pueden observer
si el dna esta puro,en el caso de formacion de smirs podemos decir que existen
dna asas o en otros caso tambien se puede decir que el DNA esta contaminado.

VI.

DISCUSIONES:

Es importante realizar un analisis electroforetico de las muestras ya que con

este se puede saber si existen RNA asas o si nuestra extraccion de and se ha
realizado con existe y no hay presencia de contaminantes.
Tambien es importante para saber cual es el peso de los fragmentos,en el caso
de que se haya utilizado un marcador.
Las tecnicas del analisis electroforetico
cuantificacion segun el peso de las bandas

VII.

del

DNA,son

utilizadas

en

la

CONCLUSIONES:

El analisis elctroforetico del DNA,es muy importante en la biologia molecular y

biotecnologia medica, para la produccion de vacunas recombinantes y la
realizacion de diagnostico, reconociendo las bandas de dna o segmentos los
cuales son insertados en el plasmido y luego realizar las experimentaciones y
pasos subsiguientes de mejoramiento de las tecnicas.
TBE:
Disolucin tampn formada por Tris, borato y EDTA, de uso frecuente en electroforesis, en
especial en gel de agarosa para separar cidos nucleicos.

El Tris es la molcula responsable del tamponamiento (regulacin del pH).

El borato contribuye a ajustar el pH deseado e igualmente a mantenerlo.

El EDTA es un quelante de cationes divalentes cuya funcin es secuestrar el Mg2+, con

lo que se evita que las posibles nucleasas presentes degraden los cidos nucleicos de la
muestra (la mayora de las nucleasas requieren Mg2+ como coenzima).
Tampn TBE ( Tris - Borato - EDTA) proporciona una solucin inica que permite
que la corriente
pase a travs del agua.

El Tris ( y el hecho de que el tampn es bsico ) parte es til para mantener el

ADN en solucin y desprotonado .
TBE ( Tris borato EDTA) acta como un electrolito para llevar corriente a
travs del gel , proporcionando la fuerza motriz . Tris y borato son sales
tampn, para la estabilizacin del pH. EDTA a proteger el ADN contra

DNasas , es un quelante de cationes divalentes ( Mg2 + ... ) que son

cofateurs de DNasas .

Tampn de restriccin mantiene el pH en un rango adecuado para la actividad

enzimtica , as como el suministro de sal cofactores requeridos para la catlisis
. Desde diferentes enzimas de restriccin requieren condiciones de sal y pH
variable, una sola memoria intermedia de compromiso puede ser utilizada que
establece un equilibrio entre las condiciones preferidas por las diversas enzimas
de restriccin . ( Spec . Tampn de restriccin de compromiso)

En la biologa molecular , TBE y TAE tampones se utilizan a menudo en

procedimientos que implican cidos nucleicos, la electroforesis ser ms comn .
Soluciones de Tris - cido son tampones efectivos para condiciones ligeramente
bsicas , que mantienen ADN desprotonado y soluble en agua. EDTA es un
quelante de cationes divalentes , en particular de magnesio ( Mg2 +) . Como
estos iones son co- factores necesarios para muchas enzimas , incluidas las
nucleasas contaminantes , el papel del EDTA es proteger los cidos nucleicos
contra la degradacin enzimtica. Pero como Mg2 + es tambin un co-factor
para muchas enzimas de ADN modificadores tiles tales como enzimas de
restriccin y ADN polimerasas , su concentracin en TBE o TAE tampones
generalmente se mantiene baja ( tpicamente a alrededor de 1 mM).

AMs recientemente descubrieron sustitutos de TBE y TAE tampones para

electroforesis estn disponibles . [ 1 ]
Receta (1 litro de solucin madre 5X ) [ editar]
54 g de base Tris ( CAS # 77-86-1 )
27,5 g de cido brico ( CAS # 10043-35-3 )
20 ml de 0,5 M EDTA ( CAS # 60-00-4 ) (pH 8,0 )
TBE puede ser diluido a 1X antes del uso en electroforesis, 0.5x es aceptable
tambin.