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La partie optique d'un microscope fond clair comprend :Une optique d'clairage
compose principalement d'une source lumineuse intensit d'clairage rglable et surmonte
d'un collecteur et d'un condenseur. Une optique de formation de l'image comprise entre la
lentille frontale de l'objectif et le verre d'il de l'oculaire
13. oculaire
14. objectif
15. condenseur avec diaphragme d'ouverture (1)
16. potentiomtre de rglage de l'intensit lumineuse
17. diaphragme de champ (1)
18. collecteur
(1) Le rglage correct de l'ouverture de ces diaphragmes est essentiel en microscopie
photonique fond clair ; cela permet de raliser, "l'clairage de KOHLER"
Cet "clairage" assure que l'objet soit clair de faon trs uniforme car chaque point de la
source lumineuse claire tout le champ objet. En consquence, un point de l'objet est clair
par l'ensemble des points lumineux de la source
(N.B. : Chaque point lumineux de la source claire aussi l'ensemble de la rtine de
l'observateur).
Le diaphragme de champ (situ la sortie du collecteur) permet de rgler le diamtre du
faisceau lumineux qui arrive sur la prparation. Ainsi seul le champ objet est clair. On
limite alors, l'entre de faisceaux lumineux parasites provenant aprs diffraction de zones
externes celle directement observe.
Le diaphragme d'ouverture plac sous le condenseur permet de rgler le cne de lumire qui
claire chaque point de l'objet Cela a pour incidence sur l'image observe d'en modifier le
contraste.
5. Les yeux sur les oculaires, on ajuste l'intensit lumineuse (potentiomtre sur le socle) et on
recherche la mise au point (vis macromtrique puis micromtrique) en loignant lentement la
platine porte objet de la lentille de l'objectif.
5 bis. Si la mise au point n'est pas trouve, il est prfrable de remonter la platine porte objet
en regardant sur le cot du microscope et reprendre l'tape 4.
6. Rgler l'cartement inter pupillaire des oculaires pour obtenir une parfaite superposition des
deux images vues par chaque il. On observe alors une seule image circulaire. (pr-rglage
conserver)
7. Affiner la mise au point en ne regardant qu'avec l'il ne disposant pas d'oculaire rglable
(l'autre il tant ferm).
7 bis. Sans toucher la mise au point (vis macro et micromtrique) jouer sur l'oculaire
rglage dioptrique pour obtenir une image nette avec l'il prcdemment ferm (l'il ayant
initialement servi affiner la mise au point tant alors ferm).
8. Reprer le champ le plus intressant en utilisant le chariot guide objet puis positionner
l'objectif souhait pour l'observation. Ajuster ventuellement la mise au point (vis
micromtrique).
9 bis. Si, en fermant un peu le diaphragme de champ, le faisceau d'clairage n'est pas centr
par rapport au champ d'observation, il faut recentrer l'iris du diaphragme en jouant sur les vis
situes sur les cots du systme d'clairement (collecteur + diaphragme de champ).
L'axe du faisceau d'clairage qui traverse l'objet et l'axe de l'objectif doivent tre
aligns. Chaque point de la source claire l'ensemble de la prparation : on a un
fond clair !!!
10. Rgler la hauteur du condenseur pour obtenir un bord net de la zone de champ claire
lorsque le diaphragme de champ est partiellement ferm. Puis rouvrir le diaphragme de
champ pour clairer de nouveau tout le champ d'observation.
diminue les contrastes. Si le D.O. est trop ferm l'image s'assombri et des franges de
diffraction apparaissent. Dans les deux cas l'image est de mauvaise qualit.
Pour les objets trs contrasts (= colors) le meilleur pouvoir sparateur est obtenu lorsque
l'ouverture d'clairage est gale l'ouverture numrique de l'objectif. On parle de " pleine
ouverture d'clairage ".
Le diaphragme d'ouverture est " plutt " ouvert.Pour les objets peu contrasts, il faut fermer le
diaphragme d'ouverture jusqu' environ 2/3 de la " pleine ouverture d'clairage ".Cela permet
d'augmenter le contraste et la profondeur de champ (le pouvoir sparateur est alors moins
bon).
Lorsque l'on change d'objectif il est ncessaire d'ajuster l'ouverture du D.O.
13. Pour passer en immersion, on conserve la mise au point. L'objectif x40 est dgag de l'axe
optique en tournant doucement le revolver porte objectif. Lorsque les objectifs x40 et x100
sont de part et d'autre de la prparation, on dpose une fine goutte d'huile immersion puis
l'objectif x100 est positionn au-dessus de la prparation.
Aprs cette opration on ne peu plus retourner vers les objectifs de plus petits
grandissement. Ces derniers ne doivent pas entrer en contact avec l'huile
immersion.
Introduction
Nombre de prlvements
Prparation du patient
Recueil des selles et dlai dexamen
Techniques de conservation
Examen direct
Techniques denrichissement
Numration
Intrts et limites
Introduction
- Chaque parasite nest bien mis en vidence que par la technique
qui lui est adapt
origine gographique
signes cliniques
rsultats des autres examens
thrapeutique parallle
Nombre de prlvements
- Une seule analyse ne permet de dceler la prsence
dlments parasitaires que dans 30 % des cas (voire moins)
- Raret des lments parasitaires
- Efficacit des techniques utilises
- Une priode muette de rejet dlments caractristiques
giardiase
amibiase
pauciparasitisme par des nmatodes ou des trmatodes
Dlai dexamen
- Selles dures et moules
dlai jusqu 12 heures (pas de trophozotes de protozoaires)
observation en gnral difficile car toute dilution et/ou
remise en suspension sont difficiles
- Autres selles :
examen dans lheure (mise en vidence des trophozotes)
sinon : fixateur
- Selles trop dilues (diarrhe importante)
laugmentation du transit donne de nombreux dbris
volumineux
Dlai dexamen
- Consquences dun retard lexamen
aucune sur la plupart des ufs et des kystes
perte des trophozotes (et surtout de leur mobilit)
embryonnement, voire closion des ufs dAnkylostomids
mtamorphoses :
les larves rhabditodes de certains helminthes se
transforment en larves strongylodes en moins
de 24 h si les conditions sont optimales
- En rsum :
Observation dans lheure suivant lmission,
sinon, fixation (mais perte de mobilit des trophozotes)
Coprologie : conservation
Techniques de conservation
Coprologie : conservation
Techniques de conservation
- Conservation des ufs dhelminthe et kystes de protozoaires
- mthode leau formole
aldhyde formique (formol) de 5 20 %(v/v)
glycrine (facultatif)
1%
eau distill ou physiologique qsp 100ml
- technique
triturer la selle dans leau formole
ajuster 1vol de selle pour 3 volume de solution
tamiser (passe-th)
laisser sdimenter 1 mn
stocker aprs remplissage du flacon et tiquetage
- rsultats
bonne conservation tant que le prlvement reste liquide
Possibilit de conserver des selles parasites intressantes
Coprologie : conservation
Techniques de conservation
Conservation des formes vgtatives damibes (eau formole :qq sem)
Fixation au MIF
Solution (1) de mercurothiolate-iode-formol : MIF (Blagg et al.)
Teinture de mercurothiolate RAL
glycrol bidistill
formol 40 %
eau distille
50 ml
10 ml
40 ml
850 ml
0.5 g
0.1 g
10 ml
Coprologie : conservation
Techniques de conservation
Fixation au MIF
Technique :
Mlanger extemporanment : 11.75 ml de (1) et 0.75 ml de (2)
Ajouter une noisette de selles (3 5 g)
Triturer, stocker
Pour lexamen
Agiter, transvaser dans un tube,
mulsionner avec un gal volume dther
Repos 2 min
Homogne :
centrifugation 1 mn
observation du culot
Diphasique :
rajouter 1 ml deau
homogniser
repos 2 mn
si homogne, sinon
Techniques de conservation
Fixation au MIF
Coprologie : conservation
Coprologie : ED
Examen direct
- Il est obligatoire
- Il seffectue pendant la ralisation dau moins
deux techniques de routine de concentration
- Il dbute par un examen macroscopique des selles
consistance (teneur en eau)
couleur (fonction biliaire)
prsence de mucus, glaires, sang
- Il renseigne
Coprologie : ED
Examen direct
- Au moins 2 prparations entre lames et lamelles
- talement de selles non dilues
selles fluides ou glairo-sanguinolentes
- talement de selles dilues dans du srum physiologique
selles plus consistantes
srum 37 C plus quelques fragments de selles
observation aprs homognisation sur la lame
- talement de selles dilues dans leau du robinet (hypotonique + HClO3)
lyse rapide des Blastocystis / kystes damibes
altration rapide des trophozotes
de Dientamoeba fragilis
de Pseudolimax butschlii
et donc diagnose diffrentielle davec ceux
d Entamoeba histolytica/dispar
Examen direct
Coprologie : ED
Trophozote d E. histolytica
Coprologie : enrichissement
Techniques denrichissement
- Pas de mthode idale
On distingue - les mthodes physiques
Sdimentation, flottation
- les mthodes diphasiques
1 sparation des lments volumineux
1 concentration des lments parasitaires
- Classification des mthodes denrichissement
- mthodes simples lther : usage gnral
flottation : recherche des ufs
sdimentation : recherches particulires
- mthodes combines
technique de Roman
technique de Junod : ther flottation
: sdimentation flottation
- mthodes
Coprologie : enrichissement
- Protocole :
Coprologie : enrichissement
ZnSO4,7H2O
Eau
- 15 g de selles dans 20 ml
- verser dans un cylindre de verre
- obtention dun mnisque
- poser une lamelle sur le mnisque
- aprs 20 30 min enlever la lamelle
- observer
Coprologie : enrichissement
Techniques spciales :
mthode de Baermann
recherche des larves danguillules
Au moins 3 h
Centifugation
Observation du culot
Coprologie : enrichissement
Techniques spciales :
mthode de Baermann
recherche des larves danguillules
Spore de truffe
Cellules vgtales
Amidon
Cristaux
Diagnostic
Parasitologique
Dfinitions
Dfinitions
Modes de parasitisme:
Accidentel ex: larves de mouches sur une plaie
Facultatif
ex: champignons
Obligatoire:
temporaire ex : moustiques
priodique ex : helminthes adultes: Ascaris
permanent ex : taenias
Dfinitions
Dfinitions
Cycle volutif
"Ensemble des transformations obligatoires,
se succdant dans un ordre prcis, avec ou
sans passage dans le milieu extrieur (ME)
subies par un parasite pour passer d'une
gnration la suivante"
Dfinitions
Cycle direct (parasite monoxne)
- un seul hte (espce ou groupe d'espces animales)
+ passage dans le Milieu Extrieur (ME) ex : Trichuris trichiura
ex : Fasciola hepatica
Dfinitions
Maladie Parasitaire : nom de genre du parasite + "ose"
1 - Historique
2 - Le parasite, biologie, rpartition gographique
3 - Description clinique:
2 - Pathognie:
3 - Dfenses de l'organisme
4- Diagnostic Biologique d'une parasitose
Diagnostic d'orientation, Diagnostic clinique
Diagnostic direct ou Parasitologique
Diagnostic indirect ou immunologique
5- Thrapeutique
6- Prophylaxie
"Ensemble des moyens visant radiquer la maladie parasitaire"
La prophylaxie dcoule du cycle volutif
Cycle biologique
( dans google : nom du parasite en latin, CDC puis aller dans images)
Amibiase
Amibiase
Diagnostic
Coproscopie sur selles frachement mises :
glaires : trophozotes
selles moules : forme non pathogne et kystes
Enrichissement et colorations ventuelles (MIF, lugol)
8-15 m
noyau
Chromatine priphrique
Caryosome central
20m
Diagnostic
Amibiase
Trophozote
Amibiase
Macrophage
Cellule pithliale
Entamoeba coli
Autres amibes
15-20 m
25-35 m
Entamoeba hartmanni
Autres amibes
Similaire E . hystolytica
Plus petit, caryosome excentr
4-10 m
6-10 m
4 noyaux
Inclusions et vacuoles
Entamoeba polecki
Autres amibes
10-25 m
Similaire E . hystolytica
Plus petit, caryosome central
5-15 m
1 noyau
Inclusions et vacuole
prenant peu le Lugol
Endolimax nana
Autres amibes
Similaire E . hystolytica
Plus petit, caryosome de
grande taille,excentr
8-10 m
8-10 m
2-4 noyaux
Souvent sub-rectangulaire
Autres amibes
10 m
8-10 m
1 noyau
Polymorphes
Coccidies - Cryptosporidioses
Diagnostic
Coccidies - Cryptosporidioses
Mise en vidence des oocystes dans les selles, les biopsies intestinales,
le LBA ou la bile
Coloration de Zhiel-Nielsen aprs concentration au formol ther
Coloration lauramine
Ookystes
Auramine
DD : Cyclospora
cayetanensis
4 Sporozotes
dans lookyste
Isospora belli
Coccidies - Isospora
Biologie
Cycle direct chez lHomme (HD), dans les cellules pithliales du TD
Une reproduction asexue suivie dune reproduction sexue conduit
lmission dun oocyste qui est expuls de la cellule hte et libr dans
le milieu extrieur.
L'oocyste mrit l'extrieur : individualisation successive dans
l'oocyste de 2 sporocystes contenant chacun 4 sporozotes.
20 m
Coccidies - Sarcocystis
- Parasite des carnivores (HD) et des herbivores (HI) dans les muscles
desquels ils senkystent
- Contamination orale par ingestion de viande
- Diagnostic direct : limination souvent discontinue et retarde
Cycle biologique
Flagells - Giardiase
Morphologie
Trophozote (18-20 m)
Flagells - Giardiase
noyaux
corps parabasal
axostyle
flagelles (4 paires)
Kyste (12-14 m)
Rsidus
paroi
axostyle
corps parabasal
noyaux (2X2)
flagelles
Flagells - Giardiase
Chilomastix mesnili
Flagells - Autres - 1
Dientamoeba fragilis
Flagells - Autres - 2
Trichrome
Etat frais, 7 20 m
1- Nmatodes
Ascaris lumbricoides
uf fertile
40 60 m
uf infertile
Environ 40m
Strongyloides stercoralis
(Anguillule)
Cycle externe long
Cycle externe
court
Cycle
endogne
Adultes dans le TD
Diagnostic spcifique:
ufs pondus et vacus
avec les matires fcales
Diagnostic spcifique:
ufs pondus et vacus
avec les matires fcales
Environ 50 m
Nmathelminthes - Trichine
2 - Trmatodes
Fasciola hepatica
Cycle biologique
Emission dufs
dans les selles
Ingestion des
mtacercaires
Miracidium
Fasciola hepatica
LOeuf
130-150m
opercule
6090
m
A- Morphologie:
1- Adulte
longueur: 15-20 mm,
largeur: 2-5 mm, paisseur: 1 mm
2- Oeuf
ovode, opercul avec opercule
paul, petite pine au ple
postrieur : environ 28 m
A- Morphologie:
1- Adulte
longueur: 10 mm,
largeur: 5 mm, paisseur: 3 mm
2- Oeuf
ovode, opercul
environ 80-100 m
Douves pulmonaires
Douves pulmonaires
HD : mammifres
carnassiers
Migration du TD vers
les bronches :
6 8 semaines
Miracidium en 2 3 semaines
Schistosomes
Schistosomes
Cycle biologique
Migration sanguine, mues
Recto-colique
S. mansoni,
S. i et S. j
Vessie
S. haematobium
Adultes
plexus veineux
Eclosion
miracidium
HI
Planorbe : S. mansoni
Bulin : S. haematobium et S. intercalatum
Oncomelania : S. Japonicum
Sortie de HI
furcocercaire
Pntration
dans lHI
Multiplication
(sporocyste I et II)
Dignes Schistosomes
Oeufs
S.mansoni
140 m x 60 m
S.haematobium
S. intercalatum
140 m x 60 m
S. japonicum
70 m x 40 m
3 - Cestodes
Taenia saginata
40 m
Taenia solium
Hymenolepis nana
uf : fine membrane
- Environ 60 m
Diphyllobothrium latum
Diphyllobothrium latum
uf : fine membrane
-Environ 90-120 m
-Pas dopercule
20 30
Pseudopodes
Mobilit
Cytoplasme
Noyaux
Endoplasme grossirement
granuleux. Grosses vacuoles
bourres dinclusions.
Ectoplasme distinct de
lendoplasme.
Longs, hyalins,
12 15
rapides
jusqu 40
Un seul la fois
+++++
12 15
Effils, hyalins,
jusqu 25 rapide
+++
4 10
10 25
Allongs, hyalins
++
Arrondis
8 10
Arrondis, en boule,
jusqu 15 clairs
Ectoplasme et endoplasme
distincts.
Grosses vacuoles alimentaires
remplies dinclusions.
Ectoplasme et endoplasme peu
distincts.
Petites vacuoles
8 15
Longs, en doigt de
gant, rfringents.
7 20
et plus
Courts, nets
Fines granulations
Vacuoles peu visibles
Inclusions +++
ATLAS DE PARASITOLOGIE
images
15 20
Forme
Contour
Cytoplasme
Cristallodes
Arrondie
Ovalaire
Net
Epais
Clair, hyalin,
rfringent
Vacuole +
difficile voir
en forme daiguille
Granuleux
Vacuoles ++
Prsence irrgulire
En forme de saucisse
Entamoeba
histolytica
minuta
12 14
Arrondie
Entamoeba
hartmanni
3 10
Arrondie
Net
Rfringent
Vacuoles +++
Prsence irrgulire
Trapus, en forme de
saucisse
Entamoeba
polecki
9 17
Arrondie
Ovalaire
Net
Rfringent
Petites vacuoles ++
+++
Endolimax nana
8 10
Ovode
Rectangulaire
Net
Peu rfringent
Hyalin
Nant
Pseudolimax
butschlii
8 15
Epais
Rfringent +++
1 vacuole
iodophile +++
Nant
Dientamoeba
fragilis
Remarques :
Noyaux
images
18
Caryosome pais et
excentr
14
chromatine irrgulire
Caryosome central et
punctiforme
14
chromatine paisse
Caryosome de grande
taille
1
chromatine fine et
rgulire
Caryosome petit et
excentrique
14
Membrane nuclaire fine
Caryosome en tche
1
Caryosome de grande
taille entour dun halo
clair, ltat frais
Kyste inconnu
Il convient de rappeler que la mise en vidence des formes kystiques prsente le mme intrt diagnostique que celle des formes vgtatives
Le diagnostic des kystes damibes est dautant plus important quils constituent la forme de rsistance et de dissmination de lespce
Llimination des kystes dans les selles est intermittente, car leur formation est irrgulire. Ceci se traduit donc par lexistence de priodes ngatives qui
justifient la prescription de plusieurs examens de selles conscutifs pour un mme patient ou nde ractivation qui permettra ventuellement la mise en
vidence des formes vgtatives.
Les kystes, trs rsistants, peuvent conserver leur pouvoir infectieux dans les selles pendant plusieurs jours : cinq jours pour Entamoeba Histolytica minuta.
Ils sont dtruits par la chaleur 70C environ
Rappelons enfin que Dientamoeba fragilis ne possde pas de forme kystique connue.
ATLAS DE PARASITOLOGIE