Aislamiento de una levadura secretora de lipasas para la produccin

de la enzima en escala planta piloto de una fermentacin por lotes

Resumen
Se evalu la produccin de lipasa de veintinueve levaduras aisladas del
filoplano de Hibiscus rosa-sinensis. Los productores ms altos de lipasa fueron
Pseudozyma hubeiensis HB85A, Debaryomyces occidentalis como HB83 y
Cryptococcus sp. HB80. Los lotes de Fermentacin de P. hubeiensis HB85A se
llevaron a cabo en un biorreactor y la produccin de lipasa mejor 3,2 veces en
comparacin con cultivos en matraz sumergido. El proceso de produccin se
redujo significativamente de 48 h (en frascos) a 18 h (en el biorreactor). La
mejor actividad hidroltica se logr con ster de p-nitrofenil C16. La actividad
mxima se observ a pH 7, la temperatura ptima fue de 50 C a pH 7 y la
enzima era estable a 30 y 40 C. La actividad lipoltica fue estimulada mediante
sales de Mg2 +, K + y Ba2 + y AEDT y ligeramente inhibida por sales de Ca2 +.
Detergentes no inicos tales como Triton X-100, Tween 80 y Tween 20
estimularon fuertemente la actividad de la lipasa, mientras que SDS la inhibi.
La lipasa fue estable en iso-octano y hexano a 80%.
Introduccin
Las lipasas (acilhidrolasa triacilglicerol, EC 3.1.1.3) se han definido como
carboxilesterasas que catalizan la hidrlisis de glicridos de acilo con cadenas
de acilo con ms de diez tomos de carbono. Bajo ciertas condiciones, tambin
catalizan la reaccin inversa, produciendo glicridos a partir de glicerol y
cidos grasos. El papel fisiolgico de las lipasas es hidrolizar los triglicridos en
diglicridos, monoglicridos, cidos grasos y glicerol. Ellos actan en la
interfase entre una fase de sustrato y una fase acuosa, en la que se disuelve la
enzima. Las lipasas son tambin capaces de catalizar la interesterificacin,
transesterificacin y reacciones enantioselectivas en medios no acuosos
(Saxena et al., 2003; Schmid y Verger, 1998;. Sharma et al, 2001). Constituyen
el grupo ms importante de biocatalizadores para aplicaciones biotecnolgicas
y son enzimas muy importantes tanto desde el punto de vista fisiolgico y
biotecnolgico.
Las enzimas lipolticas actualmente llaman considerablemente la atencin
debido a sus caractersticas nicas: especificidad de sustrato, regioespecificidad y selectividad quiral. (Castro Ochoa et al, 2005). Debido a estas
caractersticas, nuevas aplicaciones biotecnolgicas se han establecido con
xito utilizando lipasas en la sntesis de biopolmeros y la produccin de
biodiesel, productos farmacuticos, agroqumicos enantiopuros, biosensores y
compuestos de sabor (Bornscheuer et al., 2002; Castro-Ochoa et al., 2005;
Jaeger y Eggert, 2002; Kim et al., 2004; Linko et al., 1998; Sharma et al, 2001).
Las Lipasas tiles industrialmente producidas por levaduras se obtienen
principalmente de Candida rugosa (CRL) y Candida antarctica (CAL). Las
preparaciones comerciales se componen de una mezcla de isoenzimas con
diferentes caractersticas y preferencias de sustrato (Akoh et al., 2004; Chang
et al, 2006;. De Maria et al, 2006;. Ferrer et al, 2001;.. Kose et al, 2002; Qian y

Lutz, 2005; Xin et al., 2002). Aunque la mayora de los estudios de levadura
lipasas se ocupan de las especies antes mencionadas, hay algunas levaduras
productoras de lipasa emergentes que representan una esperanza para la
innovacin biotecnolgica en esta rea (Ciafardini et al, 2006;. Fernndez et al,
2006;. Kim y Hou, 2006).
Un enfoque til para la obtencin de nuevos biocatalizadores es el aislamiento
de microorganismos a partir de fuentes naturales, seguido por ensayos de
cribado funcionales en la bsqueda de la capacidad enzimtica deseada y la
seleccin de los mejores productores (Schfer et al., 2007). Hasta la dcada de
1980, slo el 2% de los microorganismos del mundo haba sido probado como
fuentes de enzimas. Ms recientemente, varios miles de muestras microbianas
aisladas de suelo se ensayaron para la produccin de lipasas, revelando que el
20% eran productores de lipasas, incluyendo hongos y levaduras filamentosos
(Cardenas et al., 2001; Schfer et al., 2007). El objetivo del presente estudio
fue la bioprospeccin de las levaduras productoras de lipasa de un sustrato
natural inexplorado con miras a la consecucin de una lipasa para aplicaciones
industriales. El hbitat filoplano fue elegida para el aislamiento de
microorganismos debido a que la cutcula de la hoja se compone
principalmente de los componentes lipdicos; Por lo tanto, es un sustrato
apropiado para la deteccin de microorganismos productores de lipasa en la
bsqueda de novedades en este mbito.
Metodologa
Seleccin de las levaduras productoras de lipasa utilizando Tween 20
como el sustrato de crecimiento
Levaduras y levaduras como cepas fueron aisladas de la filoplano de Hibiscus
rosa-sinensis (Parque Farroupilha, Porto Alegre, RS, Brasil) mediante hoja de
impresin en placas de agar YEPG con la siguiente composicin (g / l): extracto
de levadura 5,0, peptona 10.0, glucosa 20,0 y 20,0 agar. Despus de la
incubacin a 22-25 C durante 3-5 das, se aislaron colonias representativas de
cada tipo morfolgico y purificado en un medio de agar YEPG. Las cepas se
mantuvieron en medio GYMP (g / l): glucosa 20,0, extracto de levadura 5,0,
extracto de malta 20.0, fosfato de sodio monobsico 2,0 y 20,0 agar, cubierto
con una capa de aceite mineral estril, y se mantiene a 4 C. Las levaduras
fueron fenotpicamente caracterizadas por pruebas morfolgicas y fisiolgicas
estndar (Yarrow, 1998), y la identificacin se realiz segn Barnett et al.
(2000) y al programa informtico YEASTCOMPARE (Ciriello C y Lachance MA,
derechos de autor? 1999-2001). La Identificacin de la cepa Pseudozyma
hubeiensis HB85A fue confirmada por secuenciacin de la regin D1 / D2 del
26S rDNA, de acuerdo con Kurtzman y Robnett (1998). La Seleccin de
productores de lipasa se realiz en tubos que contienen levadura y 0,5% de
Tween 20 (Von Tigerstrom y Stelmaschuk, 1989). Los microorganismos aislados
previamente haban sido cultivadas en placas de agar YEPG a 22-25 C por 2
das, y se inocula en agua destilada durante 24 horas con el fin de agotar sus
recursos endgenos nutricionales. El crecimiento en los tubos de ensayo de
Tween 20 durante un mximo de 7 das indic la presencia de la actividad

enzimtica. Las cepas seleccionadas fueron adicionalmente evaluadas con

materias primas de bajo costo (aceite de soja o de grasa bovina) para la
produccin de enzimas.
La induccin de la secrecin de lipasa con grasa bovina y / o aceite de
soja en cultivos lquidos
El medio basal que contiene glucosa (2,0 g / l), peptona (5,0 g / l), MgSO4 (0,1
g / l) y K2HPO4 (1,0 g / l) se complement con aceite de soja (20,0 g / l) o grasa
bovina (20,0 g / l) para la induccin de la lipasa. El medio se esteriliz durante
30 min a 120 C, excepto para el aceite de soja y la grasa bovina, que se
esterilizaron por separado por calor seco (180 C durante 60 min) y
aspticamente se agregaron al medio antes de la inoculacin.
Para la preparacin del inculo, los cultivos se hicieron crecer a 28 C durante
16 h en matraces Erlenmeyer de 250 ml que contienen 50 ml de caldo de
GYMP. Matraces Erlenmeyer que contienen 20 ml de medio basal aadidos a
20,0 g / l de aceite de soja o grasa bovina se inocularon con 2 ml del inculo de
levadura y se incubaron a 28 C durante 48 h en un agitador orbital (200 rpm).
Slo los 10 mejores productores de lipasa con grasa bovina fueron evaluados
con aceite de soja. Las clulas se retiraron por centrifugacin a 14.000 rpm
durante 10 min, y los sobrenadantes de cultivo se evaluaron para la actividad
enzimtica.
Fermentaciones por lotes a escala planta piloto
Para la preparacin del inculo, los cultivos se hicieron crecer a 28 C durante
16 h en matraces de 1000 ml Erlenmeyer que contienen 250 ml de caldo de
GYMP. Las fermentaciones discontinuas se llevaron a cabo en un fermentador
14 l Nueva Brunswick MF 14 que contiene un eje con palas para la agitacin.
Como se describi anteriormente, se prepar 10 l de medio basal con 20,0 g / l
de aceite de soja. El medio se esteriliz en el fermentador durante 30 minutos
a 120 C, y el aceite de soja esterilizado mediante calor seco se aadi
aspticamente al medio antes de la inoculacin. El reactor se inocul con 250
ml de inculo. Las Condiciones de operacin estndar fueron: velocidad de
agitacin 200 rpm, temperatura 28 C, la tasa de flujo de aire 1 vvm y tiempo
de fermentacin 24 h, sin control de pH. Las muestras (20 ml) se tomaron a
intervalos regulares, las clulas se eliminaron por centrifugacin a 14.000 rpm
durante 10 min, y los sobrenadantes de cultivo se evaluaron para la actividad
enzimtica. La fermentacin por lotes se repiti para comprobar la
reproducibilidad, con cada muestra analizada por triplicado. Los valores
reportados en las figuras representan el promedio de las mediciones. La
Concentracin de biomasa se midi por turbidimetra a 600 nm en un
espectrofotmetro visible (Ultrospec 2000).
Mtodos analticos
El ensayo de lipasa se realiz midiendo el aumento en la absorbancia a 410 nm
en un espectrofotmetro visible (Ultrospec 2000) causada por la liberacin de
p-nitrofenol despus de la hidrlisis de palmitato de p-nitrofenilo (pNPP) a 37C

durante 30 min a pH 8,0 , con respecto a un control sin enzima. Para inicializar
la reaccin, se aadi a 0,9 ml de la solucin de sustrato que contiene 3 mg de
pNPP disuelto en 1 ml de isopropanol y 9 ml de la siguiente solucin 0,1 ml del
cultivo sobrenadante libre de clulas: 50 mM Tris-HCl pH 8,0, ms 40 mg de
Triton X-100 y 10 mg de goma rabe (Silva et al., 2005). Una unidad de lipasa
(U) se defini como la cantidad de enzima que libera 1 lmol p-nitrofenol por
minuto, en las condiciones de ensayo descritas anteriormente. La curva de
calibracin se prepar usando p-nitrofenol como estndar. Los valores se
expresan como la media la desviacin estndar por triplicado para cada
punto. La actividad de proteasa se determin midiendo el aumento en la
absorbancia a 400 nm en un espectrofotmetro visible (Ultrospec 2000)
causada por la hidrlisis de la azocasena a 50C durante 1 h. Las alcuotas de
0,1 ml de la solucin de azocasena (20 g / l) y 0,2 ml de tampn de fosfato de
sodio mM 50 (pH 7,9) se mezclaron con 0,1 ml de los sobrenadantes de cultivo
libre de clulas (Silva et al., 2005). Despus de la incubacin durante 15 min a
50 C, se aadieron 0,8 ml de cido tricloroactico al 20% con el fin de detener
la reaccin. Despus de la centrifugacin (5 min / 10.000 rpm), la absorbancia
del sobrenadante se ley a 400 nm en un espectrofotmetro visible. Una
unidad de proteasa (U) se define como la variacin de la absorbancia en las
condiciones de ensayo descritas anteriormente. Los valores se expresan como
la media la desviacin estndar por triplicado para cada punto. La
determinacin de protenas se realiz segn Bradford (1976) utilizando
albmina de suero bovino como estndar. Los valores se expresan como la
media la desviacin estndar por triplicado para cada punto.
Caracterizacin de la lipasa
La caracterizacin de Lipasa se realiz utilizando como fuente de enzima los
sobrenadantes de cultivo a partir del cultivo del biorreactor. Las Condiciones
para la evaluacin de la actividad de la lipasa fueron los mismos como se
describi anteriormente, a menos que se indique lo contrario. El sustrato
palmitato de p-nitrofenilo (pNPP) se utiliz para la mayora de determinaciones
de la actividad lipasa en este trabajo. Los Ensayos de actividad se realizaron
tambin con otros steres de p-nitrofenol (PNP), a saber, acetato de pnitrofenilo (ya pirimifos metil), butirato de p-nitrofenilo (PNPB) y miristato de pnitrofenilo (PNPM).
Una unidad de lipasa (U) se defini como la cantidad de enzima que libera 1
lmol pnitrophenol por min a 37C y pH 8,0. El pH ptimo se determin usando
pNPP como sustrato en soluciones tampn de valores de pH que oscila desde
3,0 hasta 9,0 (50 mM de citrato-fosfato de pH 3,0, 4,0, 5,0, 6,0 y 7,0; Tris-HCl
50 mM pH 8,0 y 9,0). La temperatura ptima para la actividad de la lipasa se
determin usando pNPP como sustrato a diferentes temperaturas (30-70 C) con
tampn de citrato-fosfato 50 mM a pH 7,0. La estabilidad de la temperatura de
la lipasa se determin mediante la incubacin de 0,1 ml de los sobrenadantes
de cultivo de 20, 40 min y 1 h a los 30, 40, 50 y 60 C en ausencia de un
sustrato.
La
actividad
residual
se
midi
mediante
el
ensayo
espectrofotomtrico a 50 C y pH 7,0. Los valores se expresan como la media

la desviacin estndar por triplicado para cada punto. Para probar el efecto de
los detergentes y otros productos qumicos sobre la actividad de la lipasa, los
sobrenadantes de cultivo (0,1 ml) se incubaron durante 1 h a 40 C en presencia
de 1% (v / v) de los detergentes (Triton X-100, Tween 80, Tween 20 y SDS) y 20
mM de BaCl2, CaCl2, MgCl2, KCl y EDTA. La actividad residual se midi
mediante el ensayo espectrofotomtrico a 50 C y pH 7,0. Los valores se
expresan como la media la desviacin estndar por triplicado para cada
punto. Para probar la estabilidad de la lipasa en presencia de disolventes
orgnicos, los sobrenadantes de cultivo (0,1 ml) se incubaron en 0,1 ml de
acetona, metanol, etanol, 2-propanol, n-butanol, iso-octano y hexano a
diferentes concentraciones (20%, 50% y 80%) durante 1 hora a 40 C. para el
control, 0,1 ml de sobrenadante de cultivo se incub con agua destilada
durante 1 hora a 40 C. la actividad residual se midi mediante el ensayo
espectrofotomtrico usando 0,1 ml de la mezcla de incubacin a 50 C y pH 7,0.
Los valores se expresan como la media la desviacin estndar por triplicado
para cada punto.
Anlisis estadstico
Todos los experimentos se realizaron por triplicado y el anlisis estadstico se
realiz mediante el programa SPSS 13.0. El anlisis de varianza se llev a cabo
utilizando el procedimiento ANOVA por el procedimiento de comparacin
mltiple de Tukey para determinar las diferencias significativas entre las
medias.
Resultados y discusin
Un total de 84 de la levadura y levadura como colonias aisladas del filoplano de
H. rosa-sinensis fueron elegidos y purificados al azar. Las cepas identificadas
con el nombre de la especie y el sufijo '' -como "significan que difieren
ligeramente de la descripcin estndar de la especie. Algunos linajes se
identificaron slo en el nivel de gnero. La Proyeccin sobre Tween 20 de
cultivo lquido nos permiti seleccionar 29 aislamientos que tuvieron un buen
crecimiento en este sustrato (Tabla 1). Estos 29 aislamientos fueron
adicionamente seleccionados para la produccin de lipasa con grasa bovina; y,
entre ellos, los diez mejores secretores de lipasa se rastrearon adicionalmente
utilizando aceite de soja como fuente de carbono (Tabla 2). Estos sustratos
fueron elegidos porque son materias primas de bajo costo para la produccin
de enzimas. Los mejores productores de lipasa en grasa y aceite de soja bovina
fueron P. HB85A cepa hubeiensis (610 U / l en grasa bovina y 386 U / l en el
aceite de soja), cepa Debaryomyces occidentalis similar HB83 (306 U / l en
grasa bovina y 352 U / l en el aceite de soja) y Cryptococcus sp. La cepa HB80
(293 U / l en grasa bovina y 350 U / l en el aceite de soja). S. cepa salmonicolor
como HB75, Cryptococcus sp. 2 HB87 y el fermentador de levadura negro HB49
no present actividad lipoltica en el aceite de soja, aunque su actividad en la
grasa bovina era bueno.
Las lipasas son en su mayora enzimas inducibles y sus inductores, tales como
aceites, son necesarios para la produccin de enzimas (Sharma et al., 2001).

Para la fermentacin por lotes a escala planta piloto, el aceite de soja fue
elegido como la fuente de carbono. La levadura seleccionada para la
fermentacin a escala de planta piloto fue la cepa P. hubeiensis HB85A porque
tena la mejor actividad de la lipasa tanto en la grasa bovina como el aceite de
soja. la Identificacin de la cepa P. hubeiensis HB85A fue confirmada por
secuenciacin de la regin D1 / D2 del 26S rDNA (nmero de acceso de
GenBank DQ123912). Se observ crecimiento de la levadura durante todos los
perodos de fermentacin con un pH constante (Fig. 1A). Hubo un pico en la
actividad de la lipasa (1.232 U / l) a 18 h de tiempo de fermentacin, seguido
de una breve descenso que se mantuvo constante hasta 22 h, mientras que el
pico en la actividad especfica estaba en 16-18 h, con 4.8 102 U de lipasa / lg
de protena total (Fig. 1B). Esto corresponde a la fase de crecimiento
exponencial media. Por lo tanto, como varios otros microorganismos, como C.
rugosa (Valero et al., 1991) y Aspergillus terreus (Gulati et al., 2000), la
produccin de lipasa por la cepa de P. hubeiensis HB85A era un fenmeno de
crecimiento asociada. En contraste con esto, la produccin de lipasa por las
bacterias Pseudomonas aeruginosa (CHARTRAIN et al., 1993) no fue un
crecimiento asociado, ya que la lipasa se indujo slo en la fase exponencial
tarda y alcanz un pico en la fase estacionaria tarda.
Comparando el proceso de fermentacin por lotes en el biorreactor 14 l (aceite
de soja, 28 C y la agitacin tasa de 200 rpm) a los estudios anteriores en
matraces Erlenmeyer en las mismas condiciones, la produccin de lipasa se
mejor 386 a 1.232 U / l en el reactor y, ms importante, la duracin del
proceso de produccin se redujo significativamente 48 a 18 h. Tambin se
observ Este comportamiento durante la produccin de lipasa por A. terreus en
un 10 l de fermentacin por lotes (Gulati et al., 2000) con una actividad de la
lipasa 10% mayor en el reactor que en matraces de agitacin, y una
disminucin significativa en la duracin de la fermentacin, 96-54 h. Gulati et
al. (2000) sugirieron que tanto el aumento de la produccin de lipasa, as como
la reduccin en el tiempo de fermentacin se debieron a mayores tasas de
transferencia de oxgeno causada por el aumento de la agitacin. Por lo tanto,
la mejora en la tasa de produccin de lipasa por P. HB85A hubeiensis en el
reactor fue probablemente debido a la cantidad de oxgeno inyectado
continuamente a travs del sistema, mientras que slo el oxgeno difunde en el
matraz Erlenmeyer. Este argumento est de acuerdo con las investigaciones
realizadas por Domnguez et al. (2005) y Li et al. (2005), quien inform que la
produccin de la enzima lipoltica por Thermus thermophilus HB27 y
Acinetobacter radioresistens slo se produjo cuando el aire se suministr
continuamente al biorreactor. Otras consecuencias del sistema de agitacin
que podra explicar el aumento en la produccin de lipasa fueron el mayor
contacto de los componentes del medio con microorganismos y la mejor
dispersin de aceite en el medio. Estos parmetros hacen posible una
produccin de mayor y ms rpido de lipasa.
Es posible que otras protenas pueden influir en la actividad de la lipasa
durante la fermentacin, especialmente proteasas. Los lotes se evaluaron
tambin por el contenido de proteasa en el medio (Fig. 1B). Las proteasas

aparecieron en el caldo despus de 19 h de fermentacin (2,33 U / ml h) y su

concentracin se mantuvo constante hasta las 21 h. A las 22 y 23 h de
fermentacin, hubo una disminucin en la actividad de la proteasa (1,8 y 1,2
U / ml h, respectivamente). Como la actividad de la lipasa se redujo en 19 h, es
posible que la proteasa fue uno de los factores responsables de la reduccin de
la actividad de la lipasa durante la fermentacin. Tambin se observ una
reduccin en la actividad de la lipasa, debido probablemente a la actividad de
la proteasa en la produccin de lipasa de C. rugosa en 2,0 l de fermentacin
por lotes (Puthli et al., 2006). La enzima producida se estudi con steres de pnitrofenilo de diferentes longitudes de cadena alquilo (Tabla 3). La mayor
actividad hidroltica se obtuvo con ster de p-nitrofenil C16, lo que indica una
preferencia clara de lipasa para cadenas largas de alquilo. Trabajos recientes
han sugerido el uso de sustratos de cadena larga sintticas, tales como pNPP
para caracterizar la actividad de '' verdaderas " lipasas (Lima et al., 2004).
Bajo esta definicin, el extracto crudo de P. hubeiensis (HB85A cepa) podra
decirse que contienen lipasas '' verdaderas "ya que esta lipasa mostr una
preferencia notable por pNPP (C16). Como pNPP fue el mejor sustrato, fue
elegido para todas las otras pruebas destinadas a la caracterizacin de la
enzima.
La lipasa de P. hubeiensis (cepa HB85A) mostr una alta actividad en un
intervalo de pH de 3,0-7,0 (Fig. 2A). La actividad mxima se observ a pH 7,0
(60 U / ml), decayendo rpidamente a valores de pH por encima de 7,0,
permaneciendo aproximadamente 3,8% de la actividad residual a pH 8,0 (2,3 U
/ ml), y a pH 9,0 no se observ actividad de la lipasa. Por lo tanto, pH 7,0 se
us en todas las otras pruebas destinadas a la caracterizacin de la enzima.
Las Determinaciones de actividad ms all de pH 9,0 no se han realizado a
causa de las dificultades en la estimacin de la tasa causadas por la hidrlisis
espontnea de pNPP a valores de pH por encima de 9,0. La mayora de las
lipasas en la literatura tienen una actividad ptima a valores de pH neutros o
ligeramente bsicos (Aryee et al., 2007;. Castro-Ochoa et al., 2005; Lima et al.,
2004; Segura et al, 2006). La lipasa de P. hubeiensis (cepa HB85A) present
una buena actividad en pH neutro (pH 7,0) y tambin en pH cido (pH 3,0 y
4,0). Preferencia por condiciones cidas tambin se destac por la lipasa de
Kurtzmanomyces sp. (Kakugawa et al., 2002). Una lipasa cida puede abrir una
nueva gama de aplicaciones a desarrollar el uso de esta enzima como
catalizador. La actividad de la lipasa aument con la temperatura de 30 C
hasta 50 C. La mayor actividad se observ a 50 C (45,3 U / ml) y a los 60 y 70
C hubo una disminucin en la actividad de lipasa (38,7 actividad residual y 10,6
actividad residual, respectivamente) (Fig. 2B). La alta actividad obtenida a 50 C
para la lipasa de P. hubeiensis HB85A es tambin similar a las lipasas a partir
de otros microorganismos, tales como P. aurantiogriseum (Lima et al., 2004) y
termoleovorans Bacillus (Castro-Ochoa et al., 2005). Como la mayor actividad
de la lipasa P. hubeiensis estaba en 50? C, se utiliz esta temperatura en los
ensayos espectrofotomtricos lipolticas de este experimento en adelante. Los
resultados observados para la lipasa de P. hubeiensis HB85A sugieren que esta
enzima puede utilizarse en aplicaciones con sustancias lbiles y compuestos de
bajo punto de ebullicin a una temperatura baja.

La estabilidad trmica de la lipasa de P. hubeiensis HB85A se ensay despus

de la incubacin a diferentes temperaturas durante 20, 40 y 60 min a pH 7,0
(Fig. 2C). Aunque no hubo una prdida significativa en la actividad residual
durante la incubacin para un mximo de 60 min a 30 y 40? C, despus de
incubacin a 50? C durante 20 min haba slo 15% de actividad residual, y la
enzima pierde su actividad completamente despus de la incubacin a 60? C
durante 20 min, lo que demuestra que esta enzima no es particularmente
estable a altas temperaturas (Fig. 2C). En vista de ello, si bien la actividad
ptima de la lipasa de P. hubeiensis HB85A fue a los 50? C, sugerimos la mejor
temperatura para ser considerado para la utilizacin de esta lipasa cruda en los
procesos industriales es de 40? C. La Baja estabilidad en altas temperaturas
tambin se observ para las lipasas de P. aurantiogriseum, que presentan
actividad residual 32% despus de 30 min de incubacin a 50? C (Lima et al.,
2004). La lipasa de Kurtzmanomyces sp., Por el contrario, presenta buena
estabilidad a 70? C (Kakugawa et al., 2002). Los tensioactivos se utilizan con
frecuencia en la preparacin de la emulsin en ensayos lipolticas y tambin en
la purificacin y caracterizacin de las lipasas. Ellos pueden potencialmente
causar la desnaturalizacin de la enzima mediante la interrupcin de su
estructura terciaria. Por otro lado, pueden prevenir la agregacin de la enzima
y, en consecuencia, su adicin puede aumentar la actividad de la lipasa, por lo
tanto Por lo tanto, la eleccin del agente tensioactivo, ya sea en la preparacin
de la emulsin o en las etapas de purificacin es crucial. La lipasa de P.
hubeiensis HB85A se incub durante 1 h a 40? C, su temperatura alta ms
estable, en presencia de 1% (v / v) de Triton X-100, Tween 80, Tween 20 y SDS.
Los detergentes no inicos Triton X-100, Tween 80 y Tween 20 estimularon
fuertemente la actividad de la lipasa (185,5%, 150,8% y 183,2% de actividad
residual, respectivamente) (Tabla 4). Sin embargo, la actividad de la lipasa se
inhibi completamente en presencia de SDS al 1%. Es posible sugerir que,
adems de prevenir la agregacin de la lipasa, los detergentes no inicos, tales
como sustancias tensioactivas, estabilizan el rea interfacial facilitando el
acceso del sustrato a la enzima, ya que la reaccin cataltica de lipasas tiene
lugar en una interfase aceite-agua (Karadzic et al., 2006). La respuesta a la
presencia de detergentes por las lipasas es variable en cierta medida. La
actividad de la lipasa de B. thermoleovorans CCR11 aument ligeramente con
la adicin de 1% de Triton X-100 despus de 30 min a 60? C, pero la lipasa se
inhibi completamente en presencia de SDS al 1%, Tween 80 y Tween 20
(Castro-Ochoa et al., 2005). Un efecto inhibitorio sobre la actividad de la lipasa
se detect en P. aurantiogriseum despus de la adicin de 0,01% de Triton X100, mientras la enzima fue estable en 0,01% de Tween 80% y el 0,01% de
SDS despus de ser incubadas durante 1 hora a 28? C (Lima et al., 2004).
El efecto de diferentes iones metlicos sobre la actividad de la lipasa se
muestra en la Tabla 4. Un ligero aumento en la actividad de la lipasa, debido a
20 mM de sales de Mg2 +, K + y Ba2 + (114%, 115% y 114,9% de actividad
residual, respectivamente) fue observado despus de 1 h de incubacin a 40?
C. A diferencia de nuestros resultados, la lipasa de Kurtzmanomyces sp. no se
vio afectada por 1 mM de sales de Ba2 +, Mg2 + y Ca2 + despus de 1 h de
incubacin a 37? C (Kakugawa et al., 2002). Por otra parte, una mejora en la

actividad de la lipasa de P. aurantiogriseum por la presencia de 1 mM de sales

de Mg2 + (actividad residual 113%) y Se observ una reduccin en la actividad
lipoltica por la presencia de 1 mM de sales de Ba2 + (actividad residual 70%)
(Lima et al., 2004). En general, concentraciones de sal superiores a 1 mM
inhiben la actividad de la enzima, como se ha observado para la lipasa de las
vsceras de mjol, que present una reduccin de la actividad lipasa por la
presencia de 10 mM de sales de Mg2 + y Ca2 + en comparacin con 1 mM de
las mismas sales (Aryee et al., 2007).
Adems, Con el fin de caracterizar la lipasa, se observ el efecto de EDTA, un
agente quelante de metal. Esto provoc un aumento de la actividad de la
lipasa (actividad residual 123,4%), lo que sugiere que la lipasa de P. hubeiensis
no es un metalloprotein (Tabla 4). El efecto potenciador de EDTA era bastante
diferente de la observada con la lipasa de Y. lipolytica, que no se ve afectado
por este reactivo (Yu et al., 2007). Podemos explicar tentativamente este
efecto potenciador en asociacin con el efecto de las sales (Tabla 4). La sal de
Ca2 + mostraron un ligero efecto inhibidor sobre el P. hubeiensis (cepa HB85A)
lipasa, lo cual es coherente con la activacin observada con EDTA, ya que EDTA
puede unir iones de Ca en la reaccin, explicando la activacin obtenido con
este quelante. Aunque la mayora de las lipasas estn fuertemente activados
por la sal de Ca2 + (Castro-Ochoa et al, 2005;.. Yu et al, 2007), posiblemente
debido a la estabilizacin de la estructura terciaria de la enzima, otros son no
influenciado por calcio (Lima et al,. 2004).
Desde un punto de vista biotecnolgico, hay muchas ventajas en el uso de
lipasas para las conversiones enzimticas en disolventes orgnicos, como la
mejor solubilidad de los sustratos en disolventes orgnicos, la capacidad de
actuar en un medio no acuoso, la especificidad en la reaccin de sntesis, y
suministro de un producto con alta pureza y menos problemas ambientales.
Sin embargo, generalmente, las enzimas pierden su actividad a
concentraciones de disolventes orgnicos por encima del 10-20% (Karadzic et
al., 2006). Se cree que los disolventes orgnicos miscibles en agua toman agua
de las enzimas, lo que lleva al despliegue de la molcula y, en consecuencia, a
la ocurrencia de desnaturalizacin a una tasa mucho ms rpida que en un
sistema acuoso puro (. Lima et al, 2004; Yu et al., 2007). Por a esta razn, los
efectos de diversos disolventes orgnicos en las concentraciones de 20%, 50%
y 80% (v / v) fueron examinados (Tabla 5). La alta temperatura ms estable
(40? C) fue elegida para el tratamiento del sobrenadante con los diferentes
disolventes. Se observ un grado significativo de la estabilizacin de la lipasa
en etanol y 2-propanol a una concentracin de 20%. (40% y 43% de actividad
residual respectivamente). Las concentraciones ms altas de estos disolventes
(50% y 80%) causaron una prdida inmediata de la actividad lipoltica,
probablemente debido a que promueven la rpida desnaturalizacin de las
protenas. Sin embargo, la lipasa de P. hubeiensis (cepa HB85A) era estable en
presencia de iso-octano y hexano a la concentracin de 80% (104,86% y
103,23% de actividad residual, respectivamente) ligeramente estable a la
concentracin de 50% de metanol, n-butanol y acetona (8,7%, 20,5% y 11,3%,
respectivamente). Se detect una actividad de lipasa residual (12,7%) cuando

la solucin de enzima se incub en n-butanol a una concentracin de 80%. De

hecho, las lipasas son diversas en su sensibilidad a los disolventes orgnicos
miscibles. A diferencia de P. hubeiensis HB85A, la lipasa de Kurtzmanomyces
present una estabilidad significativa en acetona, etanol y 2-propanol a las
concentraciones de 20%, 40%, 60% y 80% despus de la exposicin durante 1
h a 30? C (Kakugawa et al ., 2002). La lipasa de B. thermoleovorans tambin
mostr una alta estabilidad en presencia de disolventes orgnicos miscibles
con agua, ya que ha retenido casi el 100% de actividad despus de la
exposicin durante 1 h a 30? C en 70% de metanol, etanol 70%, 70% de 2propanol y 70% de acetona (Castro-Ochoa et al., 2005). La lipasa de P.
aurantiogriseum, por otra parte, perdio su actividad lipoltica en presencia de
metanol, etanol y acetona y tena un poco de actividad residual en la presencia
de 2 propanol (1,9%) despus de 1 h a 28? C (Lima et al., 2004).
Conclusiones
La fermentacin por lotes a escala de planta piloto para la produccin de lipasa
por P. hubeiensis (cepa HB85A) en un reactor de 14 L mostr una tasa de
buena relacin coste / beneficio para la consecucin de la enzima, que denota
que la produccin de lipasa a escala industrial puede suceder de una manera
econmicamente atractiva. La lipasa se caracteriz, con el objetivo de nuevas
aplicaciones industriales. La buena estabilidad de la enzima en disolventes
orgnicos, as como en pHs cidos, y su actividad ptima a 40? C hacen de la
lipasa de P. hubeiensis (HB85A cepa) un buen candidato para potenciales
aplicaciones principalmente en biocatlisis no acuoso, tal como la produccin
de biopolmeros, biodiesel, productos farmacuticos, productos agroqumicos y
enantiopuros compuestos de sabor.