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30/05/2012

Algumas consideraes...

Funes no-catalticas das


Protenas
Armazenamento e transporte de O2
Interaes imunolgicas

Ligante: molcula/on que se liga reversivelmente


a uma protena;
A reversibilidade importante para que o organismo
possa responder mudanas ambientais e metablicas;
Um segundo ligante pode interferir na ligao do
primeiro ligante, devido mudana na estrutura
tridimensional;

Ex: reguladores enzimticos


(ativao/inibio)

As protenas no so estticas....
Flexibilidade: mudanas sutis (respiraes) na
conformao das protenas;
Devido vibraes moleculares e pequenos movimentos
de resduos de aminocidos (rotao em torno das
ligaes simples com o C);
O desempenho da funo das protenas comumente
depende da flexibilidade;

Ajuste induzido: flexibilizao de uma protena para


ajustar o stio de ligao ao ligante, proporcionando
maior estabilidade na ligao;
Em protenas multimricas: a mudana de
conformao em uma subunidade afeta a conformao
das outras subunidades;

Transporte e armazenamento de oxignio:


importncia do grupo prosttico heme
O oxignio no possui alta solubilidade em solues
aquosas (ex: plasma sanguneo);
A difuso do oxignio entre os tecidos no ultrapassa distncias maiores que
alguns milmitros;

Metais de transio, especialmente o ferro, possui forte


tendncia de se ligar ao oxignio;
O ferro no pode ficar livre, pois, promove a formao de
espcies de oxignio altamente reativas;
O ferro incorporado em um grupo prosttico no interior de protenas,
chamado de grupo heme;

Mioglobina: armazena oxignio nos msculos;


Hemoglobina: transporta oxignio e gs carbnico
atravs da corrente sangunea;

30/05/2012

Grupo prosttico Heme

- Protoporfirina:
estrutura
orgnica
complexa, em anel;
- A esta estrutura liga-se um nico tomo
de ferro, em estado ferroso (Fe2+);
- Cada tomo de N contm uma par de
eltrons livres no centro do anel =>
formao de ligaes coordenadas com o
Ferro;

* L. coordenadas: tipo de ligao covalente em que o


par de eltrons compartilhado entre dois tomos
provm de apenas um dos tomos.
- O tomo de ferro possui 6 ligaes coordenadas, 4 a tomos de N do grupo planar,
e 2 no grupo perpendicular (1 ao N da cadeia lateral de um aminocido Histidina / 1
ligao aberta, onde pode ligar-se ao O2);
- Os tomos de N coordenados, possuem carter doador de eltrons, ajudando a
impedir a oxidao do estado ferroso (Fe2+) em estado frrico (Fe3+), o estado
frrico no liga ao oxignio;

MIOGLOBINA
HisF8: histidina da hlice F que
se liga o grupo heme (histidina
proximal);
HisE7: histidina da hlice E que
fica a uma pequena distncia do
grupo heme (histidina distal);

Quando o O2 se liga ao ferro h uma


pequena mudana no ngulo entre a
estrutura planar e a histidina
proximal (flexo : respirao)

O monxido de carbono (CO) uma molcula pequena


que coordena o ferro do grupo heme com maior
afinidade que o O2;
CO liga-se a molculas do heme 20.000 vezes melhor que o
O2, ou seja, sua Kd (constante de dissociao) 20.000 vezes
menor que para oxignio;
Se o CO liga-se ao grupo heme, exclui o stio de ligao do O2
asfixia.

Mas... quando o heme est inserido em uma globina,


esse nmero diminui drasticamente;

O que ocasiona esta reduo?


O fato de o grupo heme estar dentro de uma protena...
As globinas adquirem uma conformao tal, que favorece a
ligao com o O2 e desfavorece com o CO;

O O2 realiza uma ligao angular


com o ferro. Ocorre uma pequena
flexo
do
grupo
heme,
possibilitando uma aproximao
do O2 histidina distal. Resultado:
formao de uma ligao de H
com a His distal (estabiliza);
O CO tem uma ligao linear com
o ferro, sendo forado a uma leve
inclinao na formao da ponte
de H, o que enfraquece sua
ligao com o grupo heme;
Ou seja, a conformao da
protena atua seletivamente,
favorecendo a ligao com o O2
e desfavorecendo com o CO;

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Hemcias e Hemoglobina
Os eritrcitos (hemcias) perdem algumas
organelas internas em seu processo de
maturao; O espao antes ocupado por tais
organelas passa a ser preenchido por
molculas de hemoglobina;
Aproximadamente 34% do peso de uma
hemcia composto por hemoglobina;
Tempo de vida de uma hemcia: 120 dias;

Na mioglobina
Na Hb estado R

Na hemoglobina
(estado T)

Na conformao T da hemoglobina o Ferro


no se encontra suficientemente prximo
HisF8 para forma a ligao coordenada
com este aminocido. Isso s ocorre aps a
ligao com o O2 (conformao R) =>
porfirina adquire conformao mais planar
aproximando o Fe da HisF8;

Conformao estrutural da hemoglobina


Ocorrem duas principais conformaes:
Estado R (relaxado): maior afinidade ao O2 (oxi-hemoglobina);
Estado T (tenso): menor afinidade ao O2 (desoxi-hemoglobina);

No estado T a Hb estabilizada por um grande n de pares de inicos nas interfaces ;


Quando o O2 se liga ao estado T, a conformao da hemoglobina muda para o estado R;
Alguns pares inicos so desfeitos e outros so formados promovendo um
deslizamento entre os pares e, uma rotao, estreitando o bolso (espao) entre as
subunidades ;

A hemoglobina precisa ter afinidade o suficiente


para se ligar ao O2 nos alvolos pulmonares, mas
essa afinidade no pode ser to grande a ponto de
impedir a liberao do O2 nos tecidos...
Isso em parte resolvido pela presso de O2, que nos alvolos
bem maior que nos tecidos;
Outra parte, deve-se transio entre estado T e R, medida
em que as molculas de O2 vo sendo ligadas;
A ligao do O2 subunidades individuais da hemoglobina
capaz de alterar a afinidade de subunidades adjacentes;
Tal propriedade chamada de Alosteria (a ligao de um ligante a um stio
afeta as propriedades de ligao em outro stio na mesma protena); A primeira
molcula de O2 que interage com a desoxi-Hb (estado T), leva a alteraes de
conformao (estado R) que so comunicadas s outras subunidades, tornando
mais fcil a ligao de O2 aos 3 demais grupos heme da hemoglobina;

Por ltimo, a influncia do pH...

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Influncia dos produtos da respirao celular


A hemoglobina tambm transporta H e CO2, provenientes da
respirao celular (mitocndrias nas clulas dos tecidos);

Trocas O2 / CO2 nos tecidos e pulmes


O CO2 ainda presente nos tecidos na forma gasosa, liga-se a stios de ligao na
Hb diferentes do stio de ligao do O2 (a reao de ligao do CO2 libera H,
diminui do pH no sangue);
Nas hemcias tambm h a presena da enzima anidrase carbnica, que
converte CO2 bicarbonato e H (diminui pH sanguneo);
Tal diminuio de pH nos tecidos e no sangue, promove alteraes na estrutura
tridimensional da Hb, enfraquecendo a ligao com o O2 => liberao de O2 nos tecidos;

Ainda nos tecidos, parte do CO2 hidratado formando


bicarbonato e difunde para o sangue, pois, a forma gasosa
pouco solvel em soluo aquosa e bolhas poderiam ser
formadas (embolia);
Esta reao reversvel catalisada pela enzima anidrase
carbnica, resulta tambm na liberao de H => diminui o pH
dos tecidos;

A combinao entre os
efeitos do pH e da
concentrao de CO2 sobre
a ligao/liberao do O2,
chama-se efeito de Bohr.

O bicarbonato difunde para o plasma e posteriormente para os rins (isso ocorre


com cerca de 75% do C liberado pelos tecidos);
Cerca de 25% do C permanece na forma de CO2 ligado Hb e transportado
at os pulmes para liberao na expirao (por diferena de presso - difuso
simples);
Os H livres na Hb, ligam-se a qualquer um dos aminocidos da protena (Hb
protonada). Os H que estavam livres, no esto mais => eleva o pH do sangue;
Com a elevao do pH a Hb volta a ter afinidade ao O2 => o O2 que entrou nos
alvolos (inspirao) difunde para as Hb das hemcias e transportado para os
tecidos;
e o ciclo continua...

2,3 bifosfoglicerato (BPG)


Composto presente nas hemcias, formado a
partir de um intermedirio do metabolismo de
carboidratos;
Importante na regulao da oxigenao dos
tecidos em casos de mudana de altitude e
desenvolvimento fetal;
BPG reduz a afinidade da Hb pelo O2, atravs de
sua ligao a um stio de ligao diferente do stio
de ligao do O2 ;

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Oxigenao em relao altitude


Ao nvel do mar: 40% do oxignio carregado pelo
sangue repassado para os tecidos;
Sem BPG maior facilidade
em adquirir o estado R
Maior afinidade ao O2

O stio de ligao
para BPG fica na
cavidade entre as
subunidades ,
distante dos grupos
heme;

Com BPG maior


estabilidade no estado T
Menor afinidade ao O2

- A cavidade revestida por aminocidos com cargas


positivas, os quais interagem com as cargas negativas
do BPG;
- A ligao de BPG estabiliza o estado T, por isso,
diminui a afinidade com o O2;
- Na ausncia de BPG, a Hb convertida ao estado R;

Hemoglobina (fetal)
A Hb (HbF) possui uma
afinidade muito menor ao
BPG, logo... possui maior
afinidade ao O2 em
comparao com a Hb
(HbA);
Ao chegar na placenta, um
ambiente pobre em O2, a
Hb materna libera o gs
que rapidamente ligado
Hb fetal;

Em grandes altitudes: a diminuio da presso do O2


faz com que esta porcentagem diminua para 30%;
Aps algumas horas, ocorre aumento de BPG => diminui
afinidade da Hb pelo O2 => a porcentagem de liberao
de O2 re-estabelecida;

A situao invertida quando h retorno baixa


altitude;
Pessoas com problemas relacionados deficincia respiratria
ou circulatria, normalmente produzem uma quantidade maior
de BPG;

Sistema Imunolgico
Todos os vertebrados possuem um sistema
imunolgico capaz de distinguir o prprio do noprprio e, destruir o que identificado como noprprio;
A resposta imunolgica constituda por um conjunto
de interaes, complexas e coordenadas, entre
diversas classes de protenas e outras molculas, alm
de tipos celulares;
Na resposta imunolgica, um sistema bioqumico
altamente sensvel e especfico construdo com base
na interao entre ligantes e protenas;

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SistemaS ImunolgicoS
Sistema humoral (humor = fluido): dirigido contra
infeces extracelulares;
Sistema celular: dirigido para infeces que
ocorrem no interior de clulas (contra protozorios,
helmintos e tecidos transplantados tambm);
Anticorpos ou Imunoglobulinas : protenas com
funo imunolgica;
Leuccitos: clulas com funo imunolgica;

Leuccitos
So originados na medula-ssea;
De maneira geral: percorrem a corrente sangunea, reconhecem
possveis invasores, produzem anticorpos que se ligam aos
agentes estranhos (sinalizam a infeco => destruio);

Tc : libera perforina (forma poros na MP da clula-alvo, descontrole de entrada


e sada de substncias); Tambm induz apoptose (morte celular programada);

Em geral, h pouca quantidade de


leuccitos, eles proliferam rapidamente
quando h infeco.

Imunoglobulinas (Ig)
Constituem at 30% do total de protenas do
plasma;
Produzidas pelos linfcitos B;
Ligam-se aos invasores e os marcam para serem
destrudos;
Os seres humanos so capazes de produzir mais
de 108 anticorpos com diferentes especificidades
de ligao;

Antgenos
Toda molcula ou patgeno capaz de induzir uma
resposta imunolgica denominado de antgeno;
Cpsula viral, parede celular bacteriana, toxina, uma
molcula qualquer...

O stio de ligao onde o antgeno ligado ao


anticorpo ou a um receptor de um leuccito,
chamado de determinante antignico ou eptopo.
Um antgeno complexo pode ter diferentes
determinantes antignicos, ou seja, pode interagir com
diferentes anticorpos;

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PRINCIPAIS
ANTGENOS

PRINCIPAIS RESPOSTAS IMUNOLGICAS


- Fagocitose (macrfagos);
- Anticorpos (linfcitos B)

BACTRIAS
EXTRACELULARES

- Ativao do sistema complemento;


- Neutralizao de toxinas liberadas pelas
bactrias;

BACTRIAS
INTRACELULARES
(capacidade de
sobreviver dentro dos
macrfagos)

- Sistema MHC II (clulas T e macrfagos);

VRUS
(parasitas intracelulares
qualquer clula)

- Sistema MHC I e II (clulas T e B, macrfagos);

MHC Complexo de Histocompatibilidade


As propriedades de ligao aos receptores das clulas T so
extremamente complexas;
Tais receptores no reconhecem antgenos livres, apenas os que
esto ligados protenas especficas da superfcie celular
(MHC);
MHC: so protenas transmembrana que se ligam fragmentos
de peptdeos de protenas (ex: peptdeos provenientes da
digesto de vrus ou de componentes da prpria clula) e os
expe na superfcie celular;
Tais fragmentos ligados s protenas MHC constituem os
antgenos que os linfcitos T reconhecem como no-prprio;
H duas classes de protenas MHC...

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MHC classe I
Acredita-se que so encontradas em todas as clulas dos
vertebrados;
Ligam-se fragmentos de peptdeos resultantes da digesto de
protenas que ocorrem ao acaso dentro das clulas (inclusive que
so provenientes da prpria clula);
Cada linfcito Tc possui receptores especficos para o complexo
MHC I-peptdeo (assim qualquer complexo MHC I seria atacado,
inclusive de clulas normais);
Durante o processo de maturao (no timo), os linfcitos T so
selecionados, havendo eliminao daqueles que reconheceriam os
peptdeos prprios ligados MHC I e manuteno daqueles que
reconhecem peptdeos estranhos associados s protenas MHC I;
Isso leva destruio especialmente de clulas infectadas por
vrus, alm de constituir em um fator de rejeio em casos de
transplante de rgos;

As clulas T que foram selecionadas para maturao no timo,


reconhecem apenas as protenas MHC com peptdeos no-prprios.

Interaes moleculares na superfcie


celular
Quando a presena de um antgeno detectada, as
poucas clulas T e B precisam proliferar rapidamente e
seletivamente;
Exemplo: infeco viral
Uma vez que estejam dentro das clulas, as molculas virais
so inacessveis ao sistema imunolgico humoral;
Protenas MHC I (qualquer clula) podem expor peptdeos
provenientes das protenas virais na superfcie celular =>
reconhecimento pelas clulas Tc;
Protenas MHC II presentes em macrfagos que ingeriram
partculas
virais,
tambm
podem
exp-los
=>
reconhecimento por clulas TH e estmulo da proliferao das
clulas de defesa (e todo o processo conseqente);

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CD8: co-receptor (intensifica as


interaes de ligao entre
receptores de clulas Tc e MHC);

CD4: mesma funo em TH;


Clulas TH secretam
interleucinas, que so
reconhecidas pelas clulas
Tc e B, as quais respondem
apresentando proliferao
celular; *Estas interleucinas so
especficas, induzem a proliferao
apenas de clulas T e B que
possuem receptores para elas =>
seleo clonal;

Clulas Tc destroem as
clulas-alvo (porfirinas e
apoptose);
Clulas B secretam
anticorpos solveis que se
ligam aos antgenos no meio
humoral (protenas
complemento, as quais
danificam cpsulas virais e
paredes bacterianas);

MHC classe II

Memria Imunolgica

Ocorre na superfcie de clulas especializadas em captar


antgenos estranhos, os macrfagos e os linfcitos B;

Uma vez esgotado o antgeno (agente infeccioso),


a maioria das clulas imunolgicas ativas morrem
por apoptose;
Algumas clulas B e T amadurecem e se tornam
residentes permanentes no sangue;

Esta classe no se liga peptdeos derivados da digesto


intracelular, mas peptdeos derivados de protenas
externas ingeridas pelas clulas;

So ento reconhecidas pelos linfcitos T (Tc e TH);


TH: estimula a produo de citocininas, as quais
estimulam a proliferao das clulas Tc;
Tc: atuam na destruio dos macrfagos infectados;

Como elas j passaram pela seleo clonal (possuem os


receptores especficos para as interleucinas ativadas
pelos antgenos), caso estes antgenos voltem a ocorrer
no organismo, o desencadeamento da resposta
imunolgica ser mais rpido.

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Classes de Imunoglobulinas
Cada classe possui particularidades em relao estrutura
tridimensional da protena, bem como, em relao funo;
IgM: primeiro anticorpo liberado pelas clulas B (importante
nos estgios iniciais de resposta imunolgica primria);
IgG: a mais abundante no plasma sangneo
Principal anticorpo de resposta imunolgica secundria (a partir
de clulas B de memria);
Ativa protenas complemento e macrfagos;

IgA: encontradas em secrees (lgrimas, leite, saliva, etc);


IgD: presentes nos linfcitos B;
IgE: relacionada com respostas anti-alrgicas;
Ativa liberao de histaminas (dilatao e aumento da permeabilidade dos
vasos sanguneos, facilitando a chegada das clulas e protenas imunolgicas
no local da inflamao).

Especificidade antgeno-anticorpo
A especificidade determinada
pelos aminocidos presentes no
domnio varivel da cadeia da
imunoglobulina;
Complementariedade:
Forma, grupos com cargas,
apolaridade...
Manuteno do complexo
antgeno-anticorpo por vrias
interaes fracas;

Mudanas na conformao
facilitam, por ex, a ligao de coreceptores => ajuste induzido;
Representao da cadeia de IgG

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Testes sorolgicos
Devido grande especificidade, os anticorpos so timos
reagentes analticos;
Para a realizao de alguns testes sorolgicos
importante haverem preparaes de anticorpos;

Preparaes Monoclonais de anticorpos:


Atravs de culturas de clulas (linfcitos B) possvel
obter inmeros anticorpos idnticos;

A seguir: alguns princpios empregados em testes


sorolgicos (e no todos os detalhes dos procedimentos) ...

Teste ELISA (enzyme-linked

Coluna cromatogrfica
de afinidade
Um anticorpo selecionado
acoplado covalentemente a uma
resina;
A amostra adicionada coluna;
Se houver o antgeno procurado,
ele se ligar ao anticorpo presente
na coluna;
A coluna lavada com uma
soluo: o antgeno fica retido na
coluna e as demais protenas so
eludas;
Esta tcnica bastante usada para
purificao de protenas em geral;

Immunoblot

immunosorbent assay)

As protenas so isoladas
em gel atravs de
eletroforese;
So transferidas para uma
membrana de nitrocelulose;
A membrana passa por um
processo de submisso aos
anticorpos (semelhante ao
teste ELISA);
Revela-se colorao na
protena de interesse;

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