MINISTERIO DE SALUD

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

CENTRO DE INFORMACIN Y DOCUMENTACIN CIENTFICA

ESTUDIO EXPERIMENTAL DEL EFECTO

INMUNOMODULADOR DEL EXTRACTO
HIDROALCOHLICO DE CAPSICUM
ANNUNM SOBRE LA ARTRITIS INDUCIDA
EN RATAS
SERIE INFORMES TCNICOS N36

Q.F. DIANA VERGARA NEZ

IVN LOZADA-REQUENA

2005

ESTUDIO EXPERIMENTAL DEL EFECTO INMUNOMODULADOR DEL EXTRACTO HIDROALCOHLICO DE

CAPSICUM ANNUNM SOBRE LA ARTRITIS INDUCIDA EN RATAS

CDIGO OGITT: 2-01-04-02-093

Ttulo en castellano del artculo:

ESTUDIO

EXPERIMENTAL

DEL

EFECTO

INMUNOMODULADOR

DEL

EXTRACTO

HIDROALCOHLICO DE CAPSICUM ANNUNM SOBRE LA ARTRITIS INDUCIDA EN RATAS

Ttulo en ingls del artculo:

EXPERIMENTAL

STUDY

OF

EFFECT

INMUNOMODULADOR

OF

EXTRACT

HIDROALCOHOLICO OF CAPSICUM ANNUNM ON ARTHRITIS INDUCED IN RATS

Ttulo corto:
EFECTO DEL EXTRACTO HIDROALCOHLICO DE CAPSICUM ANNUNM SOBRE LA
ARTRITIS.

INVESTIGADORES:
1

Diana Vergara Nez , Ivn Lozada-Requena ,

1 Centro Nacional de Control de Calidad. Instituto Nacional de Salud. Lima, Per
2 Seccin Inmunologa. Facultad de Ciencias y Filosofa. Universidad Peruana Cayetano
Heredia. Lima, Per
Q.F. Diana Mabel Vergara Nez, Analista de Certificacin. - Direccin Ejecutiva de
Certificacin Centro Nacional de Control de Calidad Instituto Nacional de Salud. Lima, Per.
Direccin: Av. Defensores del Morro No. 2268 (ex Huaylas) Chorrillos- Lima 9.
Telfono: (511) 467-6696 Anexo 589
Correo electrnico: dvergara@ins.gob.pe

ESTUDIO EXPERIMENTAL DEL EFECTO INMUNOMODULADOR DEL EXTRACTO HIDROALCOHLICO DE

CAPSICUM ANNUNM SOBRE LA ARTRITIS INDUCIDA EN RATAS

RESUMEN
Objetivos: El propsito de este trabajo es obtener el extracto hidroalcoholico del Capsicum
annum y comprobar el efecto inmunomodulador en ratas con Artritis rematoidea (AR) inducidas
por colgeno. Material y Mtodos: Se realizaron ensayos analticos de identificacin para
detectar la presencia de alcaloides mediante reaccin de color, aislamiento y determinacin del
principio activo de la capsaicina por cromatografa en capa delgada del extracto
hidroalcoholico, utilizando estndar de capsaicina con pureza de 97% (SIGMA). Se realiz una
prueba piloto utilizando un test de ELISA para la determinacin de TNF-en suero de ratas
Sprague-Dawley y determinar el efecto inmunomodulador. Resultados: A partir del extracto
hidroalcohlico se logr identificar los alcaloides mediante la marcha fotoqumica por reaccin
de color, y mediante cromatografa capa delgada (CCD) identificamos el principio activo de
capsaicina. La prueba piloto no evidenci cambios significativos en los niveles de TNF-
respecto al control positivo. Conclusiones: La purificacin e identificacin del principio activo
(capsaicina) del extracto hidroalcohlico, debido a que las ratas Sprague-Dawley no
desarrollaron completamente la induccin por colgeno la artritis reumatoidea (AR) es
necesario obtener ratas con cepas susceptibles (AR), ratas especficamente con cepas LEWIS.
Palabra clave: Capsicum annuum L., extracto hidroalcohlico, antiinflamatorio.

SUMMARY
Objectives: The intention of this work is to obtain the extract hidroalcoholico of the Capsicum
annum and to verify the effect inmunomodulador in rats with Arthritis rematoidea (AR) induced
for colgeno. Material and Methods: Analytical essays of identification were realized to detect
the presence of alkaloids by means of reaction of color [olga Lock], isolation and determination
of the active beginning of the capsaicina for cromatografa in thin layer of the extract
hidroalcoholico, using standard of capsaicina with purity of 97 (SIGMA). A test was realized I
pilot using a test of ELISA for the determination of TNF - in whey of rats Sprague-Dawley and
to determine the effect inmunomodulador. Results: From the extract hidroalcohlico one
managed to identify the alkaloids by means of the march fitoqumica for reaction of color, and by
means of cromatografa thin layer (CCD) we identify the active beginning of capsaicina. The test

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CAPSICUM ANNUNM SOBRE LA ARTRITIS INDUCIDA EN RATAS

pilot did not demonstrate significant changes in the levels of TNF - with regard. Conclusions:
The purification and identification of the active beginning hidroalcohlico, anti-inflammatory. to
the (capsaicina) of the extract hidroalcohlico, because the rats Sprague-Dawley did not
develop completely the induction for colgeno the arthritis rheumatoid (AR) is necessary to
obtain rats with capable vine-stocks (AR), rats specifically with vine-stocks LEWIS.
Key word: Capsicum annuum L., hidroalcohlico, antiinflammatory extract.

INTRODUCCIN
Las plantas con accin medicinal son popularmente utilizadas debido a sus propiedades
tradicionalmente atribuidas, los cuales han mostrado validez cientfica de alguna de sus
propiedades tradicionales atribuidas.
El aj de trueno (Capsicum Annuum), familia Solanacea, de la Selva de Bagua, su principal
principio

activo capsaicina (8-metil-N-vanilil-6-nonenamida; C18 H27NO3 ), sustancia

que

pertenece a la familia de los vaniloides, grupo de sustancias con actividad irritante natural
(Wekh J M, Simon S A, Reinhart P H. 2000; 97(25):13889-13894) (Johnston J J, Goldade D A,
Chipman R B 2002; 21:1109-1112.), ocasiona la pungencia y es capaz de irritar cualquier tejido
con el que se ponga en contacto. Se ha encontrado que la capsaicina es capaz de reducir la
"sustancia P", un qumico que lleva los mensajes de dolor desde las terminales nerviosas de la
piel al sistema nervioso central. Las investigaciones clnicas han demostrado que el 75 % de
los pacientes a los que se ha aplicado crema de capsaicina en sus zonas enfermas
experimentaron una disminucin sustancial del dolor, con solo una ocasional sensacin de
quemadura. Por esta propiedad est siendo investigado el uso de la capsaicina en otros
problemas de la piel que ocasionan dolor, (Keville, 1992: 57-58).
En el Per se aconseja el consumo en las comidas por sus efectos digestivos, colagogos y
carminativos. Para aprovechar las propiedades analgsicas y rubefacientes, el fruto y las
semillas deben ser macerados en alcohol de 70%, y el lquido resultante se debe aplicar como
linimento en las zonas del cuerpo afectadas (Palacios Vaccaro 1992: 4).
Externamente se usa como revulsivo en pomadas y linimentos contra los dolores reumticos y
las neuralgias.

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CAPSICUM ANNUNM SOBRE LA ARTRITIS INDUCIDA EN RATAS

La capsaicina es un alcaloide natural derivado de la guindilla, que cuando se aplica de forma

tpica acta deplecionando el contenido de sustancia P en las terminaciones nerviosas
perifricas responsables de la transmisin del impulso nervioso. La sensacin lgica se
transmite a travs de impulsos dolorosos donde la sustancia P y otros neurotransmisores
tienen un papel determinante. La interrupcin en la transmisin del impulso doloroso se
conseguira con una disminucin en el contenido de estos neurotransmisores. En esta accin
actan diversos mecanismos: bloqueo de los canales del calcio, inhibicin del receptor
especfico de membrana, acumulacin intracelular de iones que producen cambios osmticos y
activacin de procesos enzimticos proteolticos. El dolor crnico tiene como base una
hiperexcitabilidad de impulsos sobre las fibras C. La capsaicina reduce esta actividad por lo
que actuara impidiendo la perpetuacin del estado doloroso. La aplicacin tpica de
capsaicina a concentracin de 0,025% provoca una vasodilatacin cutnea en el lugar de la
aplicacin que se traduce en dolor ardiente, sensacin que disminuye despus de la aplicacin
repetida. No debe utilizarse sobre la piel lesionada, ni sobre reas inflamadas (herpes zster en
fase aguda) ni en conjuntivas ni mucosas. Debe observarse una limpieza cuidadosa de las
manos despus de cada aplicacin. Debe aplicarse tres o cuatro veces al da ya que su efecto
es de corta duracin, obtenindose un alivio del dolor entre las dos y cuatro semanas, con una
respuesta mxima entre las cuatro y seis semanas. Se ha comprobado que cuando cesa la
aplicacin de capsaicina los niveles de sustancia P se normalizan, lo que justifica que su efecto
analgsico sea reversible.(CAPTULO XIII Tratamiento Farmacolgico del Dolor: 149)
Es en este contexto TNF- se convierte en una citokina pvot durante el desarrollo de la AR,
la produccin de molculas bloqueadoras de TNF- , como el caso de los anticuerpos
monoclonales anti-TNF- , como Infliximab y Adalimumab o los receptores solubles de TNF- ,
como Etanercept (Berg L, Lampa J, Rogberg S, van Vollenhoven R and Klareskog L. 2001:60
133-139) (Gotlieb D. 2001.) Consecuentemente, los agentes teraputicos que se dirijan a
actuar sobre la expresin del gen que codifica el TNF-
e l mismo TNF-

o sobre el NF-kB
tienen una gran probabilidad de combatir la artritis (Aguilar J, Rojas P, Marcelo A, Plaza A,
Bauer R, Reininger E, Cristoph A K and Merfort I. 2002.)

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CAPSICUM ANNUNM SOBRE LA ARTRITIS INDUCIDA EN RATAS

OBJETIVOS
Objetivos Generales:
Identificar y aislar del extracto hidroalcohlico de Capsicum annum.
Determinar el efecto inmunomodulador de un extracto hidroalcohlico de Capsicum
annum en la artritis inducida por colgeno en ratas.

Objetivos especficos:
Presentar evidencias para considerar la evaluacin del uso de esta planta medicinal
Capsicum annum (Aj de trueno) como tratamiento alternativo en la AR en humanos.

Medir los niveles de Factor de Necrosis Tumoral tipo alfa como indicador del efecto
inhibidor de la respuesta inflamatoria inducida por el extracto hidroalcohlico de
Capsicum annum

MATERIAL Y MTODOS
Preparacin de la muestra y extracto hidroalcoholico

La muestra de Capsicum Annuum (aj de trueno) se recolecto en la zona de Bagua Chica, se

transporto la planta completa a la ciudad de Lima, la cual fue llevada al Museo de la Historia
Natural de UNMSM, para ser identificada taxonmicamente, mediante la Constancia N 079USM-02 DE LA Universidad Nacional Mayor de San Marcos, MUSEO DE HISTORIA
NATURAL. (anexo 1)
As mismo se colecto frutos de la planta las cuales fueron desinfectadas, secadas y preparadas
para la obtencin del extracto hidroalcoholico.
Se pulverizo la muestra y luego se peso 50 g agregando 500 mL de Etanol durante 24 horas en
agitacin constante.
Para la comprobacin de la presencia de alcaloides se ha desarrollado ensayos de coloracin y
de precipitacin; con la reaccin a los reactivos de Dragendorf, Mayer, Warner. (Olga lock
Ugaz 1994:5-7)

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CAPSICUM ANNUNM SOBRE LA ARTRITIS INDUCIDA EN RATAS

Marcha fotoqumica preliminar

Muestra seca molida
2-3 g
+ 20 mL etanol
calentar de 5-10 minutos a ebullicin
filtrar
Extracto
+ 1 gota de HCl
Alcaloides
Positivo al reactivo de Dragendorf
Positivo al reactivo de Mayer
Positivo al reactivo de Wagner
TRATAMIENTO DEL ESTANDAR DE CAPSAICINA
La capsaicina fue obtenida de SIGMA-ALDRICH St. Louis Mo, USA, M-2028; con un grado de
pureza mnima de 97%. Se prepar una solucin stock (0,1 mg/mL) usando como diluyente
etanol.
AISLAMIENTO DE CAPSAICINA
100 g de semillas pulverizadas son agitadas con 200ml de ter de petrleo a temperatura
ambiente por 24 horas. Se filtra y el slido es lavado con 25 ml de ter de petrleo.
Se obtiene una solucin de color rojo el cual es diluido con el triple de volumen de ter.
Posteriormente se adiciona 100 ml hidrxido de potasio al 30% en metanol la mezcla es
agitada por 8 horas. Las phytoxantinas libres son disueltas en ter: La fase etrea es lavada
despus con agua y secada con sulfato de sodio anhidro y concentrada a un volumen de 20 ml
bajo presin reducida a 45 C en un rotavapor.
El residuo etreo es diluido con 60 ml de ter de petrleo y dejado en refrigeracin por 24 h. La
capsaicina es filtrada y recristalizada con pequeas cantidades de metanol.
La purificacin de capsaicina que a menudo se obtiene acompaada de otros componentes
(Zeaxantina, capsorubina etc)

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CAPSICUM ANNUNM SOBRE LA ARTRITIS INDUCIDA EN RATAS

MTODO DE EXTRACCIN DE LOS COMPONENTES DE MATERIA PRIMA DE

CAPSAICINA
Cromatografa en columna rpida (CCR):
A partir del extracto obtenido por maceracin metablica de los frutos del aj de trueno, fue
controlada por cromatografa en capa fina analtica, detectndose la presencia de alcaloides.
Se fracciono por cromatografa en columna rpida:
Fase fija: Silicagel 40 para cromatografa en columna.
Fase mvil o eluyente: n-hexano, diclorometano, metanol y agua destilada.
Procedimiento: Se realizo una papilla del extracto de silicagel para columna para dispensarlo
homogneamente y poder sembrarlo en una superficie de la silicagel de columna usada para
fraccionamiento, luego se eluyen con los solventes indicados en forma sucesiva, se evapora los
solventes obtenindose los cuatro extractos de las fracciones correspondientes, que luego
fueron controladas en capa fina.
Fase fija: Cromatoplaca silicagel 60 F 254 20 x 10 cm
Sistema solvente: eter dietilico: Etanol 39,2 : 2,2 obtenindose alcaloides mayoritariamente
Reveladores: Solucin de 2,6-dibromoquinone-chlorimide in metanol al 0,5 % y camara con
vapores de amoniaco.
Obtencin de extractos oxindlicos:
En un matraz erlenmeyer con tapa esmerilada colocar 1 g de la muestra pulverizada
agregar amoniaco al 10% para humedecer durante una hora y lograr la liberacin de los
componentes qumicos, dejar que el amoniaco se volatilice y luego agregar 20 mL de agua
destilada, mezclar bien y pasar por un embudo de separacin, realizar tres extracciones
con 30 mL de diclorometano, separar por filtracin la fase diclorometanica sobre un papel
de filtro que contiene 1 g de sulfato de sodio anhidro, para desecar la solucin
diclorometanica que se esta filtrando, se recibe en un beacker, se evapora el solvente
diclometano y se obtiene el extracto diclorometanico que contiene los alcaloides
oxindlicos y otros metabolitos secundarios, fueron controladas en capa fina en la misma
forma que los extractos obtenidos por Cromatografa en columna rpida (CCR).

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CAPSICUM ANNUNM SOBRE LA ARTRITIS INDUCIDA EN RATAS

ANIMALES DE EXPERIMENTACIN

Ratas hembras Sprague-Dawley de 3 meses de edad, con peso entre 150 200 g se
obtuvieron del bioterio de la Universidad Peruana Cayetano Heredia. El bioterio mantiene
lneas de ratas con parmetros estndar en cuanto a su reproduccin y caractersticas
adecuadas de mantenimiento de la lnea. Los animales fueron alimentados con alimento
balanceado y agua ad libitum.
TOMA DE MUESTRA
Se realiz la toma de muestra a dos ratas para lo cual se tuvo que anestesiarlas.
La toma de muestra se realiz por puncin intra-orbital.
Se obtuvo muestras de suero de ambas ratas.

Realizacin del ensayo de ELISA

Se utiliz el kit Rat TNF-ELISA de BD Biosciences, el cual se basa en el inmunoensayo
asociado a una encima de tipo sndwichque determina la presencia de la citokina TNF- .
El ensayo se realiz siguiendo las instrucciones del fabricante y todo el ensayo duro
aproximadamente 6 horas.
Las lecturas se realizaron con equipo de la Seccin Inmunologa UPCH.

RESULTADOS
Preparacin del extracto hidroalcoholico:
El extracto de Capsicum obtenida tenia el aspecto de un liquido transparente de color
anaranjado rojizo de olor fuerte caracterstico, sabor picante ardiente.
Por cromatografa de capa delgada se obtuvo el perfil del extracto comparndolo con el
estndar, el color azul y el valor del Rf de la mancha principal obtenida a partir de la solucin de
prueba corresponde a la propiedad de la mancha principal obtenida a partir de la solucion
estndar. (USP 28 2005:336)

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CAPSICUM ANNUNM SOBRE LA ARTRITIS INDUCIDA EN RATAS

En la tabla 1 se muestran los resultados de las corridas de la cromatografcas en los diferentes

extractos estudiados en relacin con el estndar.

Tabla 1. ndices medidos a los diferentes extractos de extractos de C. annuum

La intensidad y el valor Rf de la
mancha principal obtenida de la
N de
muestra

Extractos

Rf

Mancha azul solucin prueba corresponden a

los

obtenidos

en

la

solucin

estndar (USP 28 2005:336)

1

Estndar

0,73

Corresponde

Alcaloides oxindlicos

0,74

Corresponde

Capsaicina aislada

0,73

Corresponde

n-hexano

---

No se evidencia

Diclorometano

0,73

Corresponde

Metanol

0,73

Corresponde

Agua destilada

---

No se evidencia

En las fig. 1 se presentan los perfiles cromatogrficos obtenidos en las diferentes condiciones y se relacionan los intervalos de
valores de Rf y el color para cada una de las bandas detectadas como a continuacin se describe detallan.
Estndar Diclorometano Metanol Alcaloides Purificada

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Datos y Resultados del ensayo de ELISA

Disposicin de estndares y muestras:
1
A
B
C
D
E
F
G
H

Donde:

ST1-7
RT1
RT2
*

Blanco
ST1 (2000 pg/ml)
ST2 (1000 pg/ml)
ST3 ( 500 pg/ml)
ST4 ( 250 pg/ml)
ST5 ( 125 pg/ml)
ST6 ( 62,5 pg/ml)
ST7 ( 31,3 pg/ml)

2
ST1 (2000 pg/ml)
ST2 (1000 pg/ml)
ST3 ( 500 pg/ml)
ST4 ( 250 pg/ml)
ST5 ( 125 pg/ml)
ST6 ( 62,5 pg/ml)
ST7 ( 31,3 pg/ml)
RT1*

3
RT1*
RT2*
RT2*
RT1
RT1
RT2
RT2
RT1

: Estndares (Concentracin TNF -)

: Rata con Artritis Inducida por Colgeno
: Rata con Artritis Inducida por Adyuvante Completo de Freund
: Sueros que presentaron hemlisis

Lecturas a 450 nm en unidades de Densidad ptica (DO):

A
B
C
D
E
F
G
H

0,227
1,875
0,995
0,105
0,485
0,360
0,309
0,235

1,710
1,011
0,648
0,433
0,357
0,326
0,284
0,197

0,218
0,225
0,271
0,234
0,226
0,187
0,201
0,216

Lecturas Corregidas con el Blanco:

1
2
0
1,483
A
1,648
0,784
B
C
0,768
0,421
D
-0,122*
0,206
0,258
0,130
E
F
0,133
0,099
G
0,082
0,057
0,008*
-0,030
H
* Estos valores no se tomaron en cuenta por presentar error o contaminacin.

3
-0,009*
-0,002*
0,044
0,007
-0,001*
-0,040
-0,026
-0,011*

Curva estndar
Elaborada a partir del promedio de las lecturas de los 7 estndares. Grfica de regresin linear utilizando logaritmos.
Concentracin Estndar
(pg/ml)
2000
1000
500
250
125
62,5
31,3

D.O. a 450 nm
1,566
0,776
0,421
0,232
0,132
0,091
0,057

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CAPSICUM ANNUNM SOBRE LA ARTRITIS INDUCIDA EN RATAS

Ecuacin de la curva: DO = -2,486 + 0,793(Conc. TNF-

en pg/ml)

ELISA para T NF -al fa en s uero d e Ratas

W = Logt en(Y), Z = Lo gten(X)
W = -2. 48589 + 0. 792977 Z
R -S q = 99. 1 %

1 .5 0

Y (DO 450 nm

1 .0 0
0 .8 0
0 .6 0
0 .4 0
0 .3 0
0 .2 0
0 .1 5
0 .1 0
0 .0 8
0 .0 6

30

40

60

8 0 1 00

1 5 0 20 0

3 00 4 0 0

60 0 8 0 01 0 00

1 50 0 2 00 0

X (T NF pg/ml

Muestra
RT1*
RT2*
RT1
RT2

D.O. (450 nm)

-0,030
0,044
0,007
-0,040

Conc. TNF- (pg/ml)

3,91
3.19
3,14
3,08

INMUNIZACION DE RATA (CEPA SPRAGUE-DAWLEY) CON COLAGENO TIPO II DE POLLO

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CAPSICUM ANNUNM SOBRE LA ARTRITIS INDUCIDA EN RATAS

MEDICION DEL ESPESOR DE LA PATA DE LA RATA

CONCLUSIONES
1. Los kits para la determinacin de TNF en ratas indican que los niveles de dicha citokina son
muy bajos estando por debajo de la mnima concentracin de estndar.
2. Debido a que los sueros presentaron hemlisis es muy probable que esta haya contribuido al
poco nivel encontrado de la citokina TNF-en las muestras.
3. Se deben tener en cuenta los errores de pipeteo y de material incorrectamente esterilizado.
4. En el caso de las ratas con Artritis Inducida por Colgeno, estas todava no han concluido su
proceso de induccin por lo que tambin es probable que esta sea la causa del bajo nivel de
TNF-.
5. Se volver a repetir el ensayo en aproximadamente 10 15 das para dar tiempo a que los
animales se recuperen del traumatizante proceso de toma de muestra.
6. Se utilizar la va por puncin cardiaca en vez de la ocular, ya que esta presenta problemas
de coagulacin y no permite obtener el volumen adecuado de la muestra.

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CAPSICUM ANNUNM SOBRE LA ARTRITIS INDUCIDA EN RATAS

RECOMENDACIONES
Ante la dificultad de la adquisicin de las ratas cepas lewis, y para cumplir con el objetivo
solicitamos una adenda, donde planteamos el uso de un modelo in vitro en el que se usaran
Clulas Mononucleares de Sangre Perifrica (CMSP) humanas para que sean cultivadas,
tratadas con el mismo principio activo del Capsicum annum, capsaicina y luego estimuladas
con Liposacaridos (LPS), el cual es un potente inductor de produccin TNF-alfa para luego
evaluar cual fue el efecto inmunomodulador de capsaicina sobre los niveles de citokinas, con
su respectivo presupuesto (excluyendo la compra de las ratas), dicha Adenda fue aprobada
mediante MEMORANDO N 675-2004-DG-OGITT-OPD/INS (09-12-2004), pero a la fecha no
se han comprado los materiales solicitados.
Para el cumplimiento de dicho trabajo es necesario contar con el material solicitado.
ANEXO 1

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CAPSICUM ANNUNM SOBRE LA ARTRITIS INDUCIDA EN RATAS

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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