Manual Toxicologia Edicion 2

Laboratorio de Toxicologa
U
N
AM
DETERMINACIN DEL MECANISMO DE ACCIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

DE COMPUESTOS DE ORIGEN NATURAL
OBJETIVO ACADMICO
Que el alumno sea capaz de determinar el mecanismo de accin mediante el cual un compuesto de
,F
origen natural ejerce efecto antioxidante.
PROBLEMA
LO
Determinar el mecanismo antioxidante de una sustancia qumica a travs de la realizacin de las
pruebas de: 1. Inhibicin de la Xantina oxidasa, 2. Captura del radical superxido, 3. Captura de
TO
XI
perxido de hidrgeno y 4. Captura de radical hidroxilo.
ES
REACTIVOS
Solucin amortiguadora de carbonatos*
Xantina oxidasa (XO)
cido etilendiaminotetraactico (EDTA)
SO
Xantina (Xan)
Nitrato de cobre (II) (Cu(NO3)2)
FE
Nitroazul de tetrazolio (NAT)
PR
O
Sulfato de amonio y hierro (II) hexahidratado

(Fe(NH4)2(SO4)2 6H2O)
Vainillina
cido ferlico
LE
Alopurinol
cido sulfrico (H2SO4)

Butil hidroxitolueno (BHT)
G
IO
Naranja de xilenol (NX)
cido hexenico
Perxido de hidrgeno (H2O2)
,C
*Ver APNDICE II
MATERIAL POR EQUIPO DE 6 PERSONAS

1 gradilla para tubos Eppendorf
1 esptula de cromo nquel
1 micropipeta de 10-100 l
1 nave de pesado
1 celda para la regin visible (desechable)
2 matraces aforados de 250 mL
1 celda para la regin U.V. (cuarzo)
1 pipeta 1 mL
2 matraces aforados de 10 mL
1 pipeta 10 mL
BO
1 micropipeta de 100-1000 l
AD
12 Tubos Eppendorf de 1.5 mL
2 vasos de precipitados de 25 mL
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA
LA INNOVACIN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEANZA
41
EQUIPO
Bao Mara
U
N
AM
Balanza analtica
Espectrofotmetro
,F
DESARROLLO EXPERIMENTAL
A) Ensayo de inhibicin de la Xantina oxidasa empleando el sistema Xantina-Xantina oxidasa
LO
(Xan-XO)
XI
1. Los profesores indicarna cada equipo el antioxidante a evaluar.
TO
2. Marcar 3 tubos Eppendorf como control negativo (C-), control positivo (C+), antioxidante, y blanco para
antioxidante.
ES
3. Para los antioxidantes cido ferlico, alopurinol y vainillina preparar los tubos de acuerdo a la Tabla 1,
SO
siguiendo el orden de adicin indicado en la columna titulada reactivo.
Tabla 1. Preparacin de los tubos problema y control

Control positivo
( L)
100
100
100
100
Blanco para
antioxidante
( L)
100
100
,C
LE
900
600
800
500
100
100
1100
20 min
300
1100
20 min
1100
20 min
300
1100
20 min
E
D
G
IO
a. Xantina 1.5mM
b. EDTA 0.115mM
c. Solucin amortiguadora
de carbonatos 84 mM
pH=10.19
d. Solucin acuosa de
antioxidante 650 M
e. XO*
VOLUMEN TOTAL
f. Agitar e Incubar **
PR
O
Reactivo
Control
negativo ( L)
FE
Tubo
Antioxidante
( L)
100
100
AD
* Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo. ** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversin, colocar los tubos
en una gradilla e incubarlos en bao mara a 27C durante 20 min.
BO
4. Para el antioxidante BHT preparar los tubos de acuerdo a la Tabla 2, siguiendo el orden de adicin
indicado en la columna titulada reactivo.

42
Tabla 2. Preparacin de los tubos problema y control para BHT
a. Xantina 1.5mM
b. EDTA 0.115mM
c. Solucin amortiguadora de
carbonatos 84 mM pH=10.19
d. Metanol
e. Solucin de BHT en
metanol/amortiguador de
carbonatos (1:2) 650 M
f. XO*
VOLUMEN TOTAL
g. Agitar e Incubar **
100
100
100
100
Blanco para
BHT
( L)
100
100
850
550
800
50
50
1100
20 min
300
1100
20 min
BHT
( L)
100
100
500
100
100
1100
20 min
300
1100
20 min
LO
O
C
XI
TO
Reactivo
U
N
AM
Control positivo
( L)
Control
negativo ( L)
,F
Tubo
ES
en una gradilla e incubarlos en bao mara a 27C durante 20 min.
SO
5. Transcurrido el tiempo de incubacin leer el contenido de los tubos a 295 nm con celda de cuarzo,
FE
empleando el contenido del tubo Control negativo como blanco para medir el Control positivo. Para
PR
O
mayor comprensin, leer espectrofotomtricamente el contenido de los tubos en el orden numrico
que se indica en la Tabla 3.
G
IO
Tabla 3. Orden de lectura para la determinacin de cido rico

Orden de lectura
LE
Blanco
Control negativo (-)
Control positivo (+)

Blanco para antioxidante
Antioxidante
AD
,C
2
3
Muestra a leer
BO
6. Interpretar los resultados obtenidos considerando que la absorbancia del control positivo representa
el 100% de produccin de cido rico en el sistema Xan-XO de acuerdo a la siguiente frmula.
% inhibicin de la XO = 100 - [(AM) x 100/AC+]
En donde:
AM= absorbancia de la muestra que contiene antioxidante
43
A C+= absorbancia del control positivo
U
N
AM
7. Una vez obtenidos los resultados desechar el contenido de los tubos en un frasco etiquetado como
R1.
8. Lavar las puntas de pipeta y tubos Eppendorf empleados con metanol, jabn y agua destilada;
,F
secarlos y entregarlos al profesor. Depositar el agua y metanol empleado para enjuagar en el
contenedor R1
LO
B) Ensayo de captura de radical superxido (O2 -) empleando el sistema Xantina-Xantina
oxidasa-Nitroazul de tetrazolio (Xan-XO-NAT)
XI
1. Marcar 3 tubos Eppendorf como control negativo (C-), control positivo (C+), y antioxidante.
TO
2. Para los antioxidantes cido ferlico, alopurinol y vainillina preparar los tubos de acuerdo a la Tabla
ES
4, siguiendo el orden de adicin indicado en la columna titulada reactivo.
PR
O
FE
SO
Tabla 4. Preparacin de los tubos problema y control para determinacin de captura de

radical superxido (O2 -)
Control
Control
Antioxidante
Tubo
negativo
positivo
Reactivo
( L)
( L)
( L)
a. Xantina 1.5Mm
100
100
100
,C
LE
G
IO
b. EDTA 0.115Mm
c. Solucin amortiguadora de carbonatos 84
mM pH=10.19
d. NAT 0.1 M
e. Solucin acuosa de antioxidante 650 M
f. XO*
VOLUMEN TOTAL
g. Agitar e Incubar **
h. Cu(NO3)2 1.3 mM
VOLUMEN TOTAL FINAL
100
100
100
600
300
200
300
1100
20 min
200
1300
300
300
1100
20 min
200
1300
300
100
300
1100
20 min
200
1300
BO
AD
en una gradilla e incubarlos en bao mara a 27C.
3. Para el antioxidante BHT preparar los tubos de acuerdo a la Tabla 5, siguiendo el orden de adicin
indicado en la columna titulada reactivo.

44
Tabla 5. Preparacin de los tubos problema y control para determinacin de captura de
U
N
AM
radical superxido (O2 -) empleando BHT

Control
positivo
( L)
Antioxidante BHT
( L)
a. Xantina 1.5mM
100
100
100
b. EDTA 0.115mM
c. Solucin amortiguadora de carbonatos 84
mM pH=10.19
d. Metanol
e. NAT 0.1 M
f. BHT en metanol/amortiguador de carbonatos
(1:2) 650 M
g. XO*
VOLUMEN TOTAL
h. Agitar e Incubar **
i. Cu(NO3)2 1.3 mM
VOLUMEN TOTAL FINAL
100
100
550
250
50
300
50
300
,F
A
G
LO
200
300
100
300
1100
20 min
200
1300
300
1100
20 min
200
1300
TO
ES
1100
20 min
200
1300
100
XI
SO
Reactivo
Control
negativo
( L)
Tubo
PR
O
FE
Los profesores indicarn el antioxidante a evaluar
4. Transcurrido el tiempo de incubacin leer el contenido de los tubos a 560 nm empleando como
blanco el contenido del tubo etiquetado como control negativo.
5. Interpretar los resultados obtenidos considerando que la absorbancia del control positivo representa
G
IO
el 100% de formazn generado en el sistema Xan-XO-NAT de acuerdo a la siguiente frmula.
,C
LE
% de captura del radical superxido= 100 - [(AM) x100/A C+]

En donde:
AM= absorbancia de la muestra que contiene antioxidante
A C+= absorbancia del control positivo
AD
R1.
BO
contenedor R1.

45
C) Ensayo de Captura de perxido de hidrgeno (H2O2) y radical hidroxilo ( -OH) empleando
U
N
AM
el mtodo de FOX2 modificado.

1. Enjuagar con metanol los 5 tubos Eppendorf y marcarlos como blanco, control positivo H2O2,
control positivo -OH, Captura H2O2 y Captura -OH.
,F
2. Preparar los tubos de acuerdo a la siguiente tabla, siguiendo el orden de adicin indicado en la
LO
columna titulada reactivo.
Captura -OH
( L)
XI
Captura H2O2
( L)
TO
ES
PR
O
FOX-MeOH
FOX-Antioxidante
cido hexenico
H2O
H2O2*
VOLUMEN TOTAL
f. Agitar e Incubar **
900
100
1000
10 min
a.
b.
c.
d.
e.
Control
positivo
OH
( L)
900
40
40
20
1000
10 min
SO
Reactivo
FE
blanco
( L)
Tubo
Control
positivo
H2O2
( L)
900
80
20
1000
10 min
Tabla 6. Preparacin de los tubos problema y control
900
80
20
1000
10 min
900
40
40
20
1000
10 min
G
IO
3. Transcurrido el tiempo de incubacin leer el contenido de los tubos a 560 nm empleando como
blanco el contenido del tubo etiquetado como blanco.
LE
4. Interpretar los resultados obtenidos considerando que la absorbancia del tubo marcado como control
,C
positivo de H2O2 representa el 100% del perxido de hidrgeno adicionado al sistema y el tubo
-
OH representa el 100% del radical hidroxilo generado en el
marcado como control positivo
AD
sistema.
BO
% de captura de perxido de hidrgeno (H2O2) = 100 - [(AM) x100/AC+H2O2]

En donde:
AM= absorbancia del tubo marcado como Captura de H2O2
AC+H2O2 = absorbancia del tubo marcado como control positivo H2O2
% de captura de radical hidroxilo ( -OH) = 100 - [(AM) x100/A C+
En donde:
AM = absorbancia del tubo marcado como Captura de -OH
-OH ]
46
AC+
-OH =
absorbancia del tubo marcado como control positivo
OH
U
N
AM
R2.
,F
BO
AD
,C
LE
G
IO
PR
O
FE
SO
ES
TO
XI
LO
contenedor R2.

47
CUESTIONARIO
U
N
AM
1. Reporte sus resultados en la Tabla 1

Tabla 1. Resultados por equipo
Absorbancia de la muestra
Porcentaje
Control
antioxidante: ________________
de actividad
antioxidante*
positivo (C+)
Inhibicin XO
-
LO
Captura O2
Absorbancia
,F
Prueba
Captura H2O2
TO
XI
Captura -OH
ES
*Calcular el porcentaje de inhibicin de XO o Captura de O2 -, H2O2 o -OH segn sea el caso de

acuerdo a las ecuaciones presentadas en cada una de las secciones.
SO
2. De acuerdo a los resultados de la Tabla 1 Cul es el mecanismo de accin de la muestra de

antioxidante que analiz? Justifique su respuesta.
FE
________________________________________________________________________________
PR
O
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
G
IO
________________________________________________________________________________
LE
3. Compare las absorbancias de los controles positivos para cptura de H2O2 y -OH. A qu proceso o
procesos atribuye la diferencia?
,C
________________________________________________________________________________
AD
________________________________________________________________________________
BO
4. Esquematice con reacciones su respuesta anterior.

48
U
N
AM
5. Recopile los resultados grupales y reprtelos en la Tabla 2.

Tabla 2. Resultados grupales
% de Captura
de la XO
O2
H2O2
OH
% de inhibicin
Antioxidante
,F
Equipo
LO
XI
TO
ES
SO
PR
O
FE
10
6. Cul de los antioxidantes muestra mayor capacidad para inhibir a la XO?
___________________________________________________________________________________
G
IO
7. Cul de los antioxidantes muestra mayor capacidad para capturar al radical O2-?
LE
___________________________________________________________________________________
,C
8. Cul de los antioxidantes muestra mayor capacidad para capturar al H2O2?
AD
___________________________________________________________________________________
9. A qu atribuye este ltimo hallazgo?
BO
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
49
10.
Cul de los antioxidantes muestra una mayor capacidad para capturar al radical -OH?
11.
U
N
AM
________________________________________________________________________________
Considera que el consumo habitual de estos antioxidantes contribuira a disminuir el estrs
,F
oxidante? Justifique su respuesta.
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
LO
________________________________________________________________________________
TO
XI
________________________________________________________________________________
ES
BIBLIOGRAFA
BO
AD
,C
LE
G
IO
PR
O
FE
SO
Cadenas, E. Packer L. Handbook of Antioxidants. Marcel Dekker, Inc., New York, 2002.
Klaassen, C.D., Watkins, J.B. Manual de Toxicologa de Casarett & Doull: la ciencia bsica de los
txicos. (5 ed.) McGraw-Hill, Mxico, 2001.
Klassen, C.D. Casarett and Doulls Toxicologia. La ciencia de los venenos. (6a ed.). Ed. Mc Graw
Hill, Interamericana 2001.
Jiang, Z.Y., Hunt, J.V., Wolff, S. P. (1991). Ferrous Ion Oxidation in the Presence of Xylenol Orange
for Detection of Lipid Hydroperoxide in Low Density Lipoprotein. Analytical Biochemistry 202,
384-389.
Nourooz-Zadeh, J., Tajaddini-Sarmadi, J., and Wolff S.P. (1994). Measurement of Plasma
Hydroperoxide Concentrations by the Ferrous Oxidation-Xylenol Orange Assay in Conjunction
with Triphenylphosphine. Analytical Biochemistry 220, 403-409.
Martnez-Flrez, S., Gonzlez-Gallego, J., Culebras, J. M., y Tun, M. J. (2002). Los flavonoides:
propiedades y acciones antioxidantes. Nutricin Hospitalaria. XVII, 271 278.
Owena, P.L., Johns, T. (1999). Xanthine oxidase inhibitory activity of northeastern north American
plant remedies used for gout. Journal of Ethnopharmacology 64, 149 160.
Sdergren, E., Nourooz-Zadeh, J., Berglund, L., Vessby, B. (1998) Re-evaluation of the ferrous
oxidation in xylenol orange assay for the measurement of plasma lipid hydroperoxides. J.
Biochem. Biophys. Methods 37 137-146.
Tsutomu, K., Susumu, T., Hidetaka, N., et al. (2003). A novel and potent biological antioxidant,
kinobeon A, from cell culture off sunflower. Life Sciences 74, 87 97.
Wardman, P., (2007). Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and
nitrosactive species in cells and tissues: Progress, pitfalls, and prospects. Free Radical Biology &
Medicine 43, 995 1022.
World Health Organization monographs on selected medicinal plants. Volume 1. 1999, Geneva. Pp 1632.

50
APNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS
U
N
AM
1. Definicin del proceso de estrs oxidante.

2. Concepto de radical libre y especies reactivas.
3. Concepto de antioxidante y ejemplos.
,F
4. Reaccin de Fenton.
5. Concepto de peroxidacin de lpidos.
6. Importancia de la solubilidad de los antioxidantes en agua y metanol en funcin del procedimiento
LO
experimental, prestar particular atencin a las tablas 2 y 5.
7. Analice las reacciones planteadas en el siguiente diagrama y describa o complete lo solicitado en
FE
SO
ES
TO
XI
los incisos 7a-7c
PR
O
Xantina Oxidasa (XO)

cido rico
=
Xantina
BO
AD
,C
LE
G
IO
O2
H2O2 +
nm
O2
Reduccin
2e
2e
Azul de tetrazolio (NBT)
Formazn
=
nm
7a. Completar la longitud de onda a la que absorben las especies qumicas que se determinan
espectrofotomtricamente en las pruebas de inhibicin de la Xantina Oxidasa y de captura del
radical superxido, respectivamente.

51
7b. Propsito de la adicin secuencial de: xantina, EDTA, solucin amortiguadora de carbonatos
U
N
AM
pH 10.2, nitroazul de tetrazolio, XO y Cu(NO3)2 en las pruebas de inhibicin de la Xantina

Oxidasa y de captura de radical superxido.
,F
7c. Identificar las especies reactivas de oxgeno, indicando si son radicales o no.
8. Analice las reacciones planteadas en el siguiente diagrama y describa lo solicitado en los incisos
LO
9a-9c
XI
Mtodo de FOX2 modificado

Naranja de Xilenol (NX)
FeIII NX
+ OH + OH
( =560 nm)
ES
FeIII
TO
H2O2
FeII
LOOH
FeIII + OH + OH
NX
FeIII NX
( =560 nm)
FeII
PR
O
FE
SO
+L
(cido hexenico)
,C
LE
G
IO
NX = Naranja de Xilenol
FeIII NX = Complejo colorido de hierro III y Naranja de Xilenol
L= Lpido = cido hexenico
LOOH = Lpido hidroperxido producto de la peroxidacin de lpidos
en presencia de OH
AD
9a. Propsito de la adicin de Naranja de Xilenol y H2SO4 en el reactivo de FOX2.
BO
9b. Propsito de la adicin de H2O2.

9c. Propsito de la adicin de cido hexenico en los tubos de captura de radical OH -.
9d. Identifique la reaccin de Fenton en el diagrama

52
U
N
AM
APNDICE II: PREPARACIN DE REACTIVOS

Nota: Las soluciones 17 y 18 se deben preparar al inicio de cada sesin. Todo el material de vidrio
para preparar los antioxidantes deber ser enjuagado previamente con EDTA. Se recomienda que
,F
cada equipo prepare las soluciones acuosas o metanlicas del antioxidante que el profesor les haya
asignado a evaluar.
LO
Xantina 1.5 mM
Pesar 11.3 mg de xantina, agregar Na2CO3 0.4 M hasta solubilizar y aforar a 50 mL con solucin
TO
XI
amortiguadora de carbonatos.
ES
Solucin amortiguadora de bicarbonato de sodio-carbonato de sodio 84 mM, pH 10.2
Pesar 970 mg de NaHCO3 y 1.01 g de Na2CO3, disolverlos con agua destilada. Ajustar pH a 10.2 y
FE
SO
aforar a 250 mL.
PR
O
Nitroazul de tetrazolio 0.1 M
Pesar 41 mg de nitroazul de tetrazolio y aforar a 50 mL con agua destilada. Guardar la solucin en un
frasco mbar en el refrigerador.
G
IO
EDTA 0.1 mM
,C
Xantina oxidasa
LE
Pesar 33.6 mg de EDTA, disolver con agua destilada, aforar a 1L.
AD
La enzima se preparar durante la sesin de laboratorio de acuerdo a la indicacin de los profesores.
Nitrato de cobre 1.3 mM (Cu(NO3)2)
BO
Pesar 12.2 mg de Cu(NO3)2 y aforar a 50 mL con agua destilada.

Solucin acuosa de vainillina 0.65 mM
Pesar 1 mg de vainillina y aforar a 10 mL con solucin amortiguadora de carbonatos pH 10.2

53
Solucin acuosa de cido ferlico 650 M
U
N
AM
Pesar 1.3 mg de cido ferlico y aforar a 10 mL con solucin amortiguadora de carbonatos pH 10.2
Solucin acuosa de Alopurinol 650 M
,F
Pesar 2.2 mg de alopurinol y aforar a 25 mL con solucin amortiguadora de carbonatos pH 10.2
Solucin de BHT en metanol/amortiguador de carbonatos (1:2) 650 M
LO
Pesar 1.4 mg de butil hidroxitolueno y disolver en 5 mL de metanol; aforar a 10 mL con solucin
TO
XI
amortiguadora de carbonatos pH 10.2
Solucin acuosa de H2O2 250 M
ES
Tomar 0.1 mL de una solucin de perxido de hidrgeno al 50.4% y aforar a 10 mL con agua destilada;
PR
O
Solucin metanlica de vainillina 4.4 mM
FE
SO
de esta solucin tomar 17 L y aforar a 10 mL con agua destilada.
Pesar 6.7mg de vainillina y aforar a 10 mL con MeOH
Solucin metanlica de cido ferlico 4.4 mM
LE
G
IO
Pesar 8.5 mg de cido ferlico y aforar a 10 mL con MeOH
Solucin metanlica de Alopurinol 4.4 mM
,C
Pesar 6.0 mg de Alopurinol y aforar a 10 mL con MeOH
AD
Solucin metanlica de BHT 4.4 mM
BO
Pesar 9.7mg de BHT y aforar a 10 mL con MeOH

Reactivo de FOX2
Mezclar 33.6 mg de naranja de xilenol, 50.2 mg de Fe(NH4)2(SO4)26H2O y disolver en H2O destilada,
agregar 695 mL de H2SO4 concentrado y aforar a 50 mL con agua destilada.
54
Solucin FOX-MeOH
U
N
AM
Mezclar 1 mL del reactivo de FOX2 con 9 mL de MeOH
,F
Mezclar 1 mL del reactivo de FOX2 con 9 mL de la solucin metanlica de antioxidante
Solucin FOX-Antioxidante
correspondiente.
LO
Solucin acuosa de cido hexenico 500 M
Pesar 6.6 mg de cido hexenico y aforar a 50 mL con agua destilada, tomar de esta solucin 5 mL y
ES
TO
XI
aforar a 10 mL con agua destilada.
APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS
SO
R1: xantina, xantina oxidasa, EDTA, solucin amortiguadora de carbonatos pH 10.2, nitroazul de
PR
O
formazn, cido rico, H2O2, metanol.
FE
tetrazolio, cido ferlico, vainillina, butil hidroxitolueno, alopurinol, Cu(NO3)2, azul de tetrazolio,
R2: Naranja de xilenol, sulfato de amonio y hierro (II), H2SO4, cido hexenico, H2O, H2O2,
BO
AD
,C
LE
G
IO
vainillina, alopurinol, butil hidroxitolueno, cido ferlico metanol.

55
U
N
AM
DETERMINACIN DE MUTGENOS AMBIENTALES A TRAVS DE LA PRUEBA DE

AMES.
OBJETIVO ACADMICO
Determinar la presencia de compuestos mutagnicos en muestras de inters o de impacto ambiental
,F
empleando la prueba de Ames
PROBLEMA
LO
Que el alumno obtenga a partir de muestras de inters ambiental, la fraccin que contiene los
compuestos de naturaleza orgnica y realice la prueba de Ames para determinar si las fracciones
TO
XI
contienen compuestos con potencial mutagnico.
ES
MATERIAL BIOLGICO.
Cultivo nutritivo de 16 horas a 37C de Salmonella typhimurium, cepa TA98, cuyos marcadores
SO
genticos son: requerimiento de histidina (His-), sensibilidad al cristal violeta (mutacin en rfa),
PR
O
frecuencia de reversin espontanea.
FE
presencia del plsmido R (resistencia a ampicilina), sensibilidad a la luz U.V. (mutacin en uvrB) y
MUESTRA AMBIENTAL POR EQUIPO
LE
G
IO
Traer por equipo de 6 personas una de las dos muestras siguientes:
a) Colillas de cigarro: Recolectar en una bolsa plstica limpia 20 colillas de cigarro a las que
,C
debern retirar el papel envolvente y conservar nicamente el algodoncillo del filtro.
b) Residuos de escape automotriz: Recolectar con un algodn el holln remanente en el escape de

para tener acceso hasta el lugar en donde el holln se acumula.
BO
AD
un autobs y guardarlo en una bolsa plstica limpia; si es necesario emplear unas pinzas largas

56
Extraccin
U
N
AM
MATERIAL POR EQUIPO (6 personas).
Prueba de Ames
Anillo metlico
Agitador vortex
Embudo de cola corta
Mechero Bunsen
Embudo de separacin
Mechero Fisher
Matraz de bola de 100 mL
Micropipeta 10-100 L
Probeta de 100 mL
Micropipeta 100-1000 L
Vaso de precipitados de 100 mL
Pipetas graduadas 2 mL estriles
Vidrio de reloj
Puntas desechables estriles para
TO
XI
LO
,F
Vaso de precipitados de 100 mL
Parrilla de calentamiento
Tubos
de
ensayo
de
plstico
FE
10
Pedazos de papel filtro 7x7cm
SO
ES
micropipetas (6 amarillas + 1 azul)
Material para el conteo:

Plumn indeleble de punto fino
Lmpara
Lupa
Pinzas para tubos de ensayo
Termmetro
PR
O
desechables de 5 mL estriles
Bolsa de plstico para residuos
10
Cajas Petri con medio mnimo E de

Vogel-Bonner
Tubo Eppendorf
Unidad Swinex (Millipore, 0.45 m)
BO
AD
Tubos de ensayo 16x150 mm con 15

mL de agar de superficie
,C
LE
G
IO
Hielo

57
REACTIVOS
U
N
AM
Extraccin
Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4)
Diclorometano (CH2Cl2)
,F
Dimetilsulfxido (DMSO)
Prueba de Ames
LO
Hipoclorito de sodio
Solucin L-histidina 0.5mM / biotina 0.5 mM
XI
Mezcla fraccin S9:
TO
Amortiguador de fosfatos 0.2 M pH 7.4
ES
Solucin de MgCl2 6H2O 0.4 M/ KCl 1.65 M

Glucosa 6-fosfato
FE
Medio mnimo de Vogel-Bonner (en cajas Petri)
SO
NADP+
PR
O
Agar de superficie (15 mL en tubos de ensayo 16x150mm)
EQUIPO
G
IO
Incubadora
Refrigerador
,C
Lmparas
LE
Rotaevaporador
AD
DESARROLLO EXPERIMENTAL PRIMERA SESIN

NOTA 1. Antes de comenzar el trabajo experimental, los encargados de higiene y seguridad deben
BO
verificar que todos los integrantes del equipo porten bata, guantes, cubrebocas y lentes de seguridad.
NOTA 2. Colocar las cajas de Petri con medio mnimo de Vogel-Bonner en la incubadora a 37C al
inicio de la clase.

58
EXTRACCIN DE MUTGENOS A PARTIR DE MUESTRAS AMBIENTALES.

Preparar un sobre doble de papel filtro de aproximadamente 5 x 5 cm de longitud de acuerdo a la
U
N
AM
1.
AD
,C
LE
G
IO
PR
O
FE
SO
ES
TO
XI
LO
,F
Figura 1.
BO
2.
Figura 1. Elaboracin de sobre doble de papel filtro.
Colocar el material de estudio en el sobre y depositarlo en un vaso de precipitados de 250 mL,

aadir 100 mL de CH2Cl2, tapar y agitar delicadamente 30 segundos. Macerar durante 30
minutos. (No agitar durante ese tiempo).
3.
Filtrar por gravedad el extracto obtenido y recolectarlo en un vaso de precipitados.

59
4.
Colocar el sobre doble de papel filtro sobre papel peridico en la campana de extraccin. Al
U
N
AM
finalizar la sesin los responsables de seguridad e higiene debern colocarlos en una bolsa de
plstico, cerrar y etiquetar como R1.
5.
Adicionar al disolvente de extraccin del inciso 3 sulfato de sodio anhidro para eliminar la
,F
presencia de agua en la muestra, posteriormente filtrarlo por gravedad a travs de algodn y

Reconstituir el residuo final con 500 L de DMSO.
LO
6.
concentrar in vacuo.
PRUEBA DE AMES.
XI
NOTA 3. Antes de montar el rea de trabajo es importante asegurarse que ya NO haya disolventes
TO
orgnicos en las mesas.
Sanitizar el rea de trabajo limpiando con jabn e hipoclorito de sodio.
2.
Enseguida sanitizar con etanol al 70%.
3.
Adecuar el rea de trabajo a un ambiente estril de acuerdo a la Figura 2.
Figura 2. rea de trabajo ordenada y sanitizada.
BO
AD
,C
LE
G
IO
PR
O
FE
SO
ES
1.
4.
En la parrilla de calentamiento, fundir con mucha precaucin los 15 mL de agar de superficie

contenido en el tubo de ensayo para evitar proyecciones y prdidas de reactivo.
5.
Aadir 1.5 mL de solucin L-Histidina/Biotina.

60
Mantener la mezcla anterior a 45C en bao mara como indica la Figura 2.
7.
Los encargados de seguridad prepararn para todo el grupo la mezcla S9 de acuerdo a las
U
N
AM
6.
instrucciones del APNDICE I. A los equipos que les corresponda utilizar dicha mezcla se les
proporcionar en tubos Eppendorf 1.3 mL de mezcla S9 para el bioensayo la cual deber
,F
mantenerse todo el tiempo en bao de hielo.
NOTA 4: Los pasos del 7 al 12 deben hacerse lo ms rpido posible para evitar riesgos de
contaminacin.
Tomar uno o dos tubos de ensaye de plstico estriles, segn el tratamiento que se est
LO
8.
realizando, quitarles la tapa por presin sin tocar los bordes y aadir a cada tubo 2 mL de agar
XI
de superficie previamente tratado en el paso 4. Mantenerlos a 45C como los muestra la Figura
TO
2.
Realizar slo los tratamientos expuestos en la Tabla 1 o 2 segn el equipo correspondiente,
ES
9.
comenzando por el control negativo. CADA REACTIVO DEBE AGREGARSE EN EL ORDEN

Desechar las puntas para micropipetas en la bolsa de residuos colocada a un costado del rea de
FE
10.
SO
INDICADO.
PR
O
trabajo y etiquetada como R2.
,C
LE
G
IO
Tabla 1. Prueba de Ames con la Cepa TA 98 para el equipo A

Reversin
Tratamientos
Control negativo
espontnea
(por duplicado)
CDIGO
CRE1
RE2
Reactivo
1.- Agar de superficie*
2mL
2 mL
2 mL
S/S91
S/S92
2 mL
2 mL
100 L
100 L
100 L
100 L
3.- Mutgeno ambiental
25 L
25 L
AD
2.- Cultivo bacteriano
BO
Sin S9
(por duplicado)

61
Tabla 2. Prueba de Ames con la Cepa TA 98 para el equipo B

Control negativo
Slo mutgeno
Tratamientos
fraccin S9
(por duplicado)
U
N
AM
(por duplicado)
Reactivo
1.- Agar de superficie*
M1
M2
C/S91
C/S92
2 mL
2 mL
2 mL
2 mL
2 mL
2.- Cultivo bacteriano
100 L
100 L
25 L
25 L
25 L
25 L
500 L
500 L
500 L
,F
100 L
TO
XI
*Mantener siempre a 45C en bao mara

**Mantener siempre en hielo.
Sacar de la incubadora dos cajas Petri, etiquetar las cajas en la tapa segn el cdigo indicado en
ES
11.
4.- Mezcla S9**
LO
3.- Mutgeno ambiental
C-S9
CDIGO
Con S9
las tablas 1 y 2, para cada tratamiento agregando el nmero de grupo y equipo.

Mezclar el contenido de cada tubo en el agitador vortex.
13.
Verter el contenido de cada tubo en la caja de Petri con medio mnimo de Vogel-Bonner
FE
SO
12.
14.
PR
O
correspondiente.
Desechar los tubos de plstico en la bolsa de residuos colocada en un costado del rea de trabajo
y etiquetada como R2.
Distribuir cuidadosa y homogneamente el agar de superficie realizando movimientos circulares.
16.
Dejar solidificar las cajas a temperatura ambiente en una superficie plana durante 10 minutos.
17.
Repetir los pasos 7 al 15 para los otros dos tratamientos.
LE
G
IO
15.
,C
NOTA 5: Recordar en todo momento que se est trabajando con compuestos con posible actividad
mutagnica y con un cultivo bacteriano que no es incuo.

Colocar el sobrante de la muestra ambiental en DMSO en el contenedor etiquetado como R3.
19.
Fijar las tapas de las cajas Petri a su contraparte con cinta adhesiva e introducirlas de manera
BO
AD
18.
20.
invertida a la incubadora a 37C por 48 horas.

Una vez terminado el tiempo de incubacin, guardar las cajas de Petri invertidas en el
refrigerador a 4C.

62
DESARROLLO EXPERIMENTAL SEGUNDA SESIN

Antes de comenzar el conteo de colonias, verificar que el crecimiento sea homogneo, es decir,
U
N
AM
21.
que las colonias tengan las mismas caractersticas, de lo contrario informar al profesor para
Contar el nmero de colonias revertantes que crecieron en la caja con ayuda de una lmpara y
LO
23.
cajas presenten estas condiciones, informar al profesor para rechazarlas.
,F
Identificar si existe algn tipo de contaminacin por hongos u otras bacterias. En caso de que las
22.
recibir instrucciones.
una lupa, marcndolas con un plumn indeleble de punto fino.

Registrar en la Tabla 3 los resultados obtenidos.
25.
Una vez terminada la cuenta, recolectar las cajas de Petri y sujetarlas con cinta adhesiva,
ES
TO
XI
24.
colocarlas en la bolsa roja para RPBI y etiquetarlas como R4
SO
NOTA 6. Se considera un resultado positivo cuando el nmero de revertantes inducidas es igual o
BO
AD
,C
LE
G
IO
PR
O
FE
superior al doble del nmero de colonias revertantes espontneas.

63
CUESTIONARIO
1. Anote el nmero de revertantes encontradas en la Tabla 3
Tabla 3. Resultados con la cepa TA98
Muestra:
Repeticin
A
G
LO
O
C
XI
TO
ES
R
Slo
mutgeno
SO
Con
fraccin
S9
FE
Sin
fraccin
S9
,F
1
2
Promedio
1
2
Promedio
1
2
Promedio
1
2
Promedio
1
2
Promedio
Reversin
espontnea
Equipo
Control
negativo
fraccin S9
Control
negativo
U
N
AM
PR
O
2. En cul de las muestras evaluadas, el nmero de revertantes inducidas es igual o superior al doble
del nmero de colonias revertantes espontneas?
G
IO
___________________________________________________________________________________
3. Considera que logr identificar la presencia de mutgenos en la muestra ambiental evaluada?
LE
___________________________________________________________________________________
,C
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
4. Qu tipo de mutaciones provocan?
BO
AD
___________________________________________________________________________________
5. Cmo influye la biotransformacin en estos procesos?
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
6. Qu caractersticas de solubilidad poseen los xenobiticos presentes en la muestra evaluada?
64
U
N
AM
___________________________________________________________________________________
7. Qu importancia tiene la concentracin de los mutgenos en la muestra con respecto a la
confiabilidad de la prueba?
,F
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
BO
AD
,C
LE
G
IO
PR
O
FE
SO
ES
TO
XI
LO
___________________________________________________________________________________

65
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
XI
LO
,F
U
N
AM
Maron, D. & Bruce, A. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Research 113
(1980)173-215.
Cortinas, C. & Ostrosky, P. (Editoras) Manual de mtodos para la identificacin de mutgenos y
carcingenos qumicos ambientales, Volumen 1. Instituto de Investigaciones Biomdicas,
UNAM. Mxico, 1980. Pgs. 31-50.
Caldern-Segura, M. E., Gmez-Arroyo, S., Villalobos-Pietrini, R., Butterworth, F. M., AmadorMuoz, O. The effects of seasonal weather on the genotoxicity, cytokinetic properties,
cytotoxicity and organochemical content of extracts of airborne particulates in Mexico City.
Mutation Research 558 (2004) 717.
Villalobos-Pietrini, R., Hernndez-Mena, L., Amador-Muoz, O., Munive-Coln, Z., Bravo-Cabrera, J.
L., Gmez-Arroy, S., Fras-Villegas, A., Waliszewski, S., Ramrez-Pulido, J., Ortiz-Muiz, R.
Biodirected mutagenic chemical assay of PM10 extractable organic matter in Southwest Mexico
City. Mutation Research 634 (2007) 192204.
TO
APENDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS
ES
1. Concepto de contaminacin atmosfrica.
SO
2. Posibles compuestos mutagnicos existentes en las muestras seleccionadas.

3. Efectos generales que sobre el organismo tienen los contaminantes ambientales.
PR
O
5. Fundamento de la prueba de Ames.
FE
4. Caractersticas generales de solubilidad de dichos compuestos.

6. Concepto de revertante espontnea.
7. Caractersticas generales de las cepas Salmonella typhymurium utilizadas en la Prueba de Ames
G
IO
y especialmente la cepa TA 98.
LE
8. Utilidad del agar de superficie.
9. Importancia del bao de temperatura a 45C.
,C
10. Finalidad de colocar en el medio una solucin que contenga histidina y biotina.
11. Caractersticas de la fraccin S9 y su utilidad.
AD
12. Numero de colonias revertantes necesarias para considerar un resultado positivo.

laboratorio.
BO
13. Precauciones que se deben considerar para obtener resultados ptimos de la prueba en el

66
U
N
AM
APNCIDE II: PREPARACIN DE REACTIVOS.

a) Sales de Vogel-Bonner 50X.
K2HPO4 anhdro
500 g
NaHPO44 H2O
175 g
,F
100 g
cido ctricoH2O
10 g
LO
MgSO47 H2O
En 600 mL de agua destilada tibia disolver las sales en el siguiente orden:
XI
Aforar a 1 litro. Esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura ambiente.
TO
b) Bacto-agar
ES
En un matraz de 1 L colocar 15 g de Bacto-agar ms 500 mL de agua destilada. Esterilizar en
Dilucin de las sales Vogel-Bonner 50x
FE
c)
SO
autoclave el material a anterior 121C durante 15 minutos
PR
O
En un matraz de 1 L colocar 20mL de las sales de Vogel-Bonner 50x ms 500 mL de agua destilada.
Esterilizar en autoclave el material anterior a 121C durante 15 minutos

Solucin de glucosa al 40% p/v
d)
G
IO
En un matraz de 125 mL colocar 20 g de glucosa ms 50 mL de agua destilada. Esterilizar en
LE
autoclave el material anterior a 121C durante 15 minutos

Cajas Petri con Medio mnimo E de Vogel-Bonner
,C
e)
En un matraz de 2 L limpio, seco y esterilizado en autoclave a 121 C por 15 minutos, aadir los 500
AD
mL de bacto-agar, 500 mL de la dilucin de las sales Vogel-Bonner y 50 mL de solucin de glucosa al
40% p/v, mezclar perfectamente y distribuir en cajas Petri de 15x100 estelizadas por rayos gamma
BO
hasta cubrir la base (aproximadamente 30 mL/caja). Esta cantidad de medio alcanza para preparar
aproximadamente 33 cajas.

67
f)
Solucin Histidina 0.5 mM/Biotina 0.5 mM
U
N
AM
Pesar 0.0077 g de L-histidina, 0.0122 g de D-biotina, disolver con agua destilada y con calentamiento,
aforar a 100 mL. Esterilizar por filtacin o autoclave. Almacenar a 4C en oscuridad.
Agar de Superficie
,F
g)
Pesar 0.6 g de Bacto Agar y 0.5 g de NaCl, agregar 100 mL de agua destilada. Alicuotar 15 mL de la
mezcla en tubos de 16x150 mm, cubrirlos con algodn, esterilizar en autoclave y almacenar a
TO
XI
h)
Amortiguador de fosfatos 0.2 M pH 7.4
Solucin A. Disolver 2.84 g de Na2HPO4 en 100 mL de agua destilada.
LO
temperatura ambiente
Solucin B. Disolver 2.76g de NaH2PO4H2O en 100 mL de agua destilada.
ES
Para el amortiguador pH 7.4, tomar 81 mL de la Solucin A y 19 mL de la Solucin B. Almacenar a
SO
4C. Esterilizar la solucin final en autoclave.
Solucin de Cloruros: MgCl2 6H2O 0.4 M/ KCl 1.65 M
FE
i)
PR
O
Disolver 8.1332 g de MgCl2 6H2O + 12.302 g de KCl en agua destilada, aforar a 100 mL. Esterilizar
Mezcla fraccin S9
G
IO
j)
en autoclave y almacenar a 4C.
Para preparar esta mezcla se requieren dos tubos estriles de 16 x 150 mm y descongelar previamente
LE
la fraccin S9 en bao de agua con hielos (4C). Tomar las alcuotas indicadas en la Tabla 4 y mezclar
,C
siguiendo las instrucciones posteriores. Pesar la glucosa 6P y el NADP+, usando aplicadores de madera
para poder pesar los reactivos, (con una navaja, una de las puntas del aplicador de madera se plana para
BO
AD
poder tomar el reactivo y pesarlo), vaciarlos cada uno a tubos Eppendorf de 1.5 mL.

68
Tabla 4. Alcuotas para preparar la mezcla S9
6H2O 0.4 M/ KCl 1.65 M

Glucosa-6-fosfato*
NADP+*
S9
7.2 mL
0.16 mL
0.0104 g
0.024 g
0.8 mL
0.0013 g
0.0030 g
100 L
U
N
AM
mLde mezcla S9
recomendada para
Para 1 mL de Para 8
mezcla S9
(Cantidad
un grupo)
0.9 mL
Amortiguador de fosfatos 0.2 M pH
0.02 mL
7.4 Solucin de Cloruros: MgCl2
,F
Reactivos
LO
*Antes de iniciar pedir al profesor que proporcione los tubos Eppendorf de 1.5 mL con la glucosa 6P
y el NADP+ pesados en la cantidad correspondiente, empleando para ello aplicadores de madera
TO
XI
desechables.
ES
En un tubo estril de 16x 150mm, aadir el amortiguador de fosfatos y la solucin de cloruros, mezclar
en vortex, tomar una alcuota de 500 L(con micropipeta) y aadirla en el tubo Eppendorf que contiene
SO
a la glucosa 6P para disolverla y agregarla al resto del tubo de 16 x 150 mm, mezclar nuevamente en el
FE
vortex. Tomar nuevamente otra alcuota de 0.5 mL y aadirla al tubo Eppendorf que contiene el
PR
O
NADP+ para disolverlo, agregar al resto del tubo de 16 x 150 mm. Mezclar la fraccin S9 y tomar la
alcuota correspondiente para aadirla al tubo de 16 x 150 mm, mezclar en vortex perfectamente y
filtrar utilizando una unidad Swinex (Millipore, 0.45 m), obteniendo el filtrado en otro tubo de
G
IO
16x150mm ESTRIL. Alicuotar 1.3 mL de la mezcla para cada equipo en tubos Eppendorf.
APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS
,C
LE
NOTA 6: Tomar en cuenta que la mezcla siempre debe estar en hielo.
R1: Sobre doble con muestra ambiental y disolvente CH2Cl2.
R2: puntas para micropipeta y tubos de plstico.
AD
R3: Concentrado de muestra ambiental en DMSO, este extracto puede contener hidrocarburos
BO
aromticos policclicos y otros compuestos mutagnicos.

R4: Cajas de Petri con cultivo bacteriano de Salmonella typhimurium, cepa TA98.

69

Manual Toxicologia Edicion 2

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Laboratorio de Toxicologa

DETERMINACIN DEL MECANISMO DE ACCIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

origen natural ejerce efecto antioxidante.

Determinar el mecanismo antioxidante de una sustancia qumica a travs de la realizacin de las

perxido de hidrgeno y 4. Captura de radical hidroxilo.

Solucin amortiguadora de carbonatos*

Xantina oxidasa (XO)

cido etilendiaminotetraactico (EDTA)

Nitrato de cobre (II) (Cu(NO3)2)

Nitroazul de tetrazolio (NAT)

Sulfato de amonio y hierro (II) hexahidratado

cido sulfrico (H2SO4)

Naranja de xilenol (NX)

Perxido de hidrgeno (H2O2)

MATERIAL POR EQUIPO DE 6 PERSONAS

1 celda para la regin visible (desechable)

2 matraces aforados de 250 mL

1 celda para la regin U.V. (cuarzo)

12 Tubos Eppendorf de 1.5 mL

A) Ensayo de inhibicin de la Xantina oxidasa empleando el sistema Xantina-Xantina oxidasa

1. Los profesores indicarna cada equipo el antioxidante a evaluar.

siguiendo el orden de adicin indicado en la columna titulada reactivo.

Tabla 1. Preparacin de los tubos problema y control

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA

Tabla 2. Preparacin de los tubos problema y control para BHT

mayor comprensin, leer espectrofotomtricamente el contenido de los tubos en el orden numrico

que se indica en la Tabla 3.

Tabla 3. Orden de lectura para la determinacin de cido rico

Control positivo (+)

A C+= absorbancia del control positivo

secarlos y entregarlos al profesor. Depositar el agua y metanol empleado para enjuagar en el

B) Ensayo de captura de radical superxido (O2 -) empleando el sistema Xantina-Xantina

oxidasa-Nitroazul de tetrazolio (Xan-XO-NAT)

4, siguiendo el orden de adicin indicado en la columna titulada reactivo.

Tabla 4. Preparacin de los tubos problema y control para determinacin de captura de

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA

Tabla 5. Preparacin de los tubos problema y control para determinacin de captura de

radical superxido (O2 -) empleando BHT

Los profesores indicarn el antioxidante a evaluar

blanco el contenido del tubo etiquetado como control negativo.

el 100% de formazn generado en el sistema Xan-XO-NAT de acuerdo a la siguiente frmula.

% de captura del radical superxido= 100 - [(AM) x100/A C+]

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA

C) Ensayo de Captura de perxido de hidrgeno (H2O2) y radical hidroxilo ( -OH) empleando

el mtodo de FOX2 modificado.

columna titulada reactivo.

Tabla 6. Preparacin de los tubos problema y control

OH representa el 100% del radical hidroxilo generado en el

marcado como control positivo

% de captura de perxido de hidrgeno (H2O2) = 100 - [(AM) x100/AC+H2O2]

absorbancia del tubo marcado como control positivo

secarlos y entregarlos al profesor. Depositar el agua y metanol empleado para enjuagar en el

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA

1. Reporte sus resultados en la Tabla 1

*Calcular el porcentaje de inhibicin de XO o Captura de O2 -, H2O2 o -OH segn sea el caso de

2. De acuerdo a los resultados de la Tabla 1 Cul es el mecanismo de accin de la muestra de

procesos atribuye la diferencia?

4. Esquematice con reacciones su respuesta anterior.

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA

5. Recopile los resultados grupales y reprtelos en la Tabla 2.

6. Cul de los antioxidantes muestra mayor capacidad para inhibir a la XO?

8. Cul de los antioxidantes muestra mayor capacidad para capturar al H2O2?

9. A qu atribuye este ltimo hallazgo?