Escrito por Nina Peralta y Didier Tobn.

MTODOS EN BIOFISICA MOLECULAR.

Medicin de la concentracin de protenas en hgado por el mtodo Biuret y

Bradford, al aplicar procesos de desnaturalizacin trmica y lavado superficial.
Espectros de absorcin y luminiscencia de las protenas y sus aplicaciones para las investigaciones biolgicas.

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Medelln Antioquia, Colombia, Sur Amrica

Nina Rosa Peralta Rumbo, Didier Alejandro Tobn Cuartas

nrperaltar@unal.edu.co diatoboncu@unal.edu.co

Estudiante de ingeniera biolgica, estudiante ingeniera fsica. Facultad de ciencias.

Universidad Nacional de Colombia sede Medelln.
Recibido para revisar 10-09-2012.
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Resumen
Las protenas son macromolculas, formadas por la unin de un conjunto de aminocidos que interaccionan por medio
de enlaces peptdicos, entre los componentes de las protenas estn: un extremo amino(-NH ), un grupo metilo
unido a un grupo orgnico que define generalmente las caractersticas del aminocido (-CH - R) y un grupo
carboxlico (COOH); las protenas generalmente tienen pesos moleculares altos, tienen propiedades anfipticas, es decir
cumplen funcin como cidos (grupo carboxilo) o como bases (grupo amino) y desarrollan diversas funciones a nivel
biolgico, en algunas observaciones, as como en la purificacin de protenas es necesario determinar la concentracin
de protenas en las muestras biolgicas; para lo cual existen varios mtodos como los de determinacin colorimtrica o
los de determinacin fluorimtrica. Para efectos prcticos se trabajo con el mtodo biuret que se basa en la formacin de

un complejo coloreado entre el ion cprico (Cu ) y los grupos aminos (pertenecientes al enlace pptido; que existe
entre los aminocidos que forman una protena). Esta reaccin suele ser muy especifica y la intensidad en la coloracin
varia segn el numero de enlaces peptdicos, generalmente la reaccin tiene mejores efectos en soluciones con gran
concentracin de protena. Entre los objetivos del estudio se encontraba evaluar los efectos de algunos procesos
mecnicos en la concentracin del extracto enzimtico de hgado y conocer las posibles interferencias que podan tener
los mtodos pticos de anlisis bioqumico.
Palabras Clave: Mtodo biuret, protenas, fluorescencia, longitudes de onda, espectrofotometra, espectrofluorimetria.
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1. Introduccin
La palabra protena tiene su origen en el trmino
griego proteios, que quiere decir lo principal o lo ms
importante. Son unas de las biomolculas ms
importantes encontradas en las clulas vegetales y
animales, que fueron descubiertas por Berzelier en
1838 y posteriormente descritas por Mulder. [1] Las
protenas puede desempear muchas funciones que
dependen sobre todo de la cadena de aminocidos que
las compone, son macromolculas de alta importancia a
nivel biolgico, compuestas principalmente por
carbono, hidrgeno, oxgeno y nitrgeno; algunas
contienen molculas de azufre o fsforo. [2] Las
protenas son polmeros lineales conformados por
aminocidos que se unen entre si por medio de enlaces
peptdicos (enlaces amida). Muchas de las interacciones
dadas entre los aminocidos en una secuencia lineal,
influyen y estabilizan la conformacin tridimensional
que pueda adquirir la protena para tener funcionalidad.
[3] Las protenas constituyen cerca del 50% del peso
seco de los tejidos, se encuentran en diversos tipos de
clulas y alimentos (carnes, huevos, cereales); son los
compuestos de mayor abundancia en seres vivos y

tienen actividad en gran parte de los procesos celulares,

existen protenas estructurales que brindan rigidez a la
clula; protenas transportadoras la cuales regulan el
flujo de materiales a nivel membranal, protenas
reguladoras que actan como sensores controlando la
actividad de los genes; entre las funciones que
desempean las protenas a nivel de los organismos
encontramos: Enzimas (actan como catalizadores
biolgicos); tendones y cartlagos (presentes en el
cuerpo humano para dar soporte estructural y
movimiento); hemoglobina (agente transportador a
travs del torrente sanguneo); hormonas (agentes
sealizadores); Albuminas (agentes de almacenamiento.
Para la escritura de las protenas convencionalmente el
grupo amino libre se escribe de lado izquierdo
(aminocido N terminal), el aminocido con el grupo
carboxilo libre se escribe de lado derecho (aminocido
C terminal).[4]
El
proceso de desnaturalizacin es un cambio
estructural que sufren las protenas perdiendo su
estructura nativa, funciones biolgicas y algunas de sus
propiedades fisicoqumicas. Procesos como el lavado
superficial de un tejido, la maceracin, y calentamiento

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producen efectos y cambios sobre la estructura nativa

de la protena. Es muy posible que estos cambios
estructurales en la -hlice, -lamina o en
las
diferentes conformaciones (dominios o motivos) que
tenga una protena en su estructura generen cambios
fsicos en la absorcin de la luz. [5]
Experimentalmente, la determinacin de los cambios de
absorcin que acompaa a la desnaturalizacin de una
protena puede llevarse a cabo con el fin de determinar
la diferencia de absorcin entre un cromforos en una
solucin de agua destilada y el mismo cromforos en
una solucin donde se haya perturbado el medio. [6]
La determinacin por el mtodo de biuret representa un
mtodo de anlisis colorimtrico, en el cual la protena
se mezcla con una solucin de NaOH y una solucin de
sulfato de cobre (CuSO) por lo que se produce una
coloracin violeta. Este tipo de procedimiento permite
detectar la presencia de enlaces peptdicos y ser
positivo cuando existan 2 o mas enlaces.
La coloracin observada se basa en la formacin de un
complejo entre el Cu con los grupos aminos que
forman el enlace peptidico, de esta manera se forma un
complejo coordinado. [7] Y tambin contrastar cuando
por medio de procesos fsicos como maceracin y
lavado se rompen dichos enlaces generando una
disminucin de la coloracin violeta.

3
una longitud de onda de mxima absorcin de 280 nm.
[8].
Las bandas de absorcin ms significativas se
encuentra en la regin ultravioleta cercana, en el
intervalo de longitud de onda entre 230 y 300 nm, en
este rango absorben concretamente las cadenas laterales
de los aminocidos aromticos o como la histidina y la
cistina.
La cistina presenta una banda centrada a 250 nm, pero
apenas se puede considerar, ya que es muy dbil y el
porcentaje relativo de puentes disulfuro es muy
pequeo en una protena.
Este tipo de procedimiento se permite si los cromforos
despus de un proceso de desnaturalizacin trmica
estn ms expuestos al medio, permitiendo una mayor
absorcin de la luz. Realizando su contraste con una
muestra que no fue sometida a desnaturalizacin
trmica.

La coloracin observada se basa en la formacin de un

complejo entre el CuSO4 con los grupos aminos que
forman el enlace peptdico, de esta manera se forma un
complejo coordinado.
Fig. 2. Absorbancia de los cromforos triptfano, Fenilalanina y
Tirosina.

Se sabe que 100 g hgado de res tienen 20 g protena,

luego 1 g hgado de res posee 200 mg protena.
Para una concentracin del 10% p/v 1g hgado de res /
10 ml H2O se trabaja con 20 mg protena /1 ml H2O.
Las protenas de este alimento perteneciente a la
categora de las vsceras, estn formadas por
aminocidos como:
Fig. 1. Complejo coordinado entre el ion de cobre y los grupos
aminos.

El uso del espectro de absorcin de una protena

plegada como una mezcla de individual de los espectros
de los residuos aromticos, en donde la mayora de las
emisiones intrnsecas de una protena es debido a la
excitacin de los residuos de triptfano, con algunas
emisiones debido a la tirosina y fenilalanina; y algunos
enlaces de di-sulfuro tambin tienen una notoria
absorcin en el rango de longitud de onda del
ultravioleta cercano. Usualmente, el triptfano tiene

Aminocido.

Cantidad.

cido asprtico

1825 mg g
2542 mg
g
1228 mg
g
1109 mg
g
239 mg
g
998 mg
g

cido glutmico
Alanina
Arginina
Cistena
Fenilalanina

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1.825
2.542
1.228
1.109
0.239
0.998

4
centrifuga. La segunda muestra se lav por 4 veces con
agua sin destilar y luego se procedi a macerar en 10
ml de agua destilada, filtrndose y centrifugndose por
10 minutos. De ambos procesos se obtuvo un extracto
de hgado de aproximadamente 9 ml.

Glicina

1271 mg 1.271
g
Histidina
563 mg 0.563
g
Isoleucina
981mg 0.981 g
Leucina
1697 mg 1.697
g
Lisina
1493 mg 1.493
g
Metionina
512 mg 0.512
g
Prolina
1049 mg 1.049
g
Serina
947 mg 0.947
g
Tirosina
657 mg 0.657
g
Treonina
861 mg 0.861g
Triptfano
264 mg 0.264
g
Valina
1254mg 1.254
g
Fig. 3. Tabla de aminocidos presente en el hgado de res.

Del extracto de hgado sin lavar, se llev a dos tubos de

ensayos muestras de 0.2 ml (para obtener
aproximadamente 4 mg de protena en la muestra) con
0.3 ml de agua destilada y 2.3 ml de reactivo BIURET.
Esto mismo se realiz para el extracto de hgado que
fue lavado previamente. En total se cont con 4 tubos
de ensayo (dos extracto de hgado sin lavar y dos con
extracto de hgado lavado).
Cada una de estas muestras se dejo por 30 minutos para
que la reaccin entre el extracto proteico y el reactivo
de BIURET ocurriera y las muestras se tornarn de
color violeta.

2. Materiales y mtodos
2.1 Determinacin de protenas en hgado por
medio del mtodo biuret.

10 g de hgado de res.
Agua destilada.
Mortero
Tubos de ensayo
Balanza
Reactivo de biuret
Na - cholate.

Primeramente se realiz la curva de calibracin, a partir

de BSA (Albumina de suero bovino), donde se tomaron
las siguientes medidas.
Reactivo
H2O (ml)
BSA (ml) (10 mg/ml de
agua)
BIURET (ml)

1
0.5
0

2
0.4
0.1

2.3

2.3

Muestras
3
4
0.25 0.1
0.25 0.4
2.3

2.3

5
0
0.5
2.3

Tabla 1 reactivos y cantidades para la preparacin de la curva de

calibracin con BSA para determinacin de concentracin protenica
por medio de BIURET.

Luego con las 5 muestras para realizar la curva de

calibracin y con las 4 muestras del extracto de hgado,
se observaron las absorbancias a 540 nm.
2.2 Determinacin del efecto de la temperatura en
la desnaturalizacin del extracto enzimtico del
hgado.
5 gramos de hgado
Bao termostatado
Balanza
Tubos de ensayo
Centrifuga
Espectrofotmetro
Cubeta de cuarzo
Se pesaron aproximadamente 2 gramos de hgado, que
fue macerado con 10 ml de agua destilada, que fueron
llevados durante 10 minutos a una centrifuga. Se
obtuvieron 4 ml de extracto enzimtico de hgado que
fue llevado hasta un volumen de 12 ml con agua
destilada; de este extracto se tomo1ml y se diluyo hasta
10 ml, luego se tomaron 7 ml y se llevaron a un
volumen de 14 ml de agua destilada para obtener una
concentracin 2 veces menor a la concentracin del
extracto inicial.

Luego de haber tenido los 5 tubos de ensayo

organizados debidamente segn las instrucciones de la
tabla 1, se deja por 30 minutos para que la reaccin
entre la protena BSA y el reactivo BIURET se lleve a
cabo.

De la ultima dilucin se tomaron en tubos de ensayo

rotulados, 4 ml a temperatura ambiente y a un bao
termostatado durante 5 minutos se llevaron: 4ml a una
temperatura de 55C, 3 ml a una temperatura de 65C y
2.5 ml a una temperatura 75C, luego cada uno de los
tubos se llevaba a un bao frio durante 30 segundos.

Luego, se pesaron 2
aproximadamente 1
muestra se macero
filtrndose y luego

Luego de lo cual se observaron las absorbancias para

cada uno de los tubos en diferentes longitudes de onda
(280nm y 295nm)

muestras por separadas, cada una

gramo de hgado. La primera
con 10 ml de agua destilada,
llevndose por 10 minutos a la

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5
3. Resultados
3.1 Determinacin de protenas en hgado por
medio del mtodo BIURET
Curva de calibracin para la medicin de protenas
a partir de las mediciones de la absorbancias de las
muestras de BSA.
Muestr
a
1
2
3
4
5

Absorbancia
s
A 540 nm
0.028
0.111
0.249
0.361
0.448

Tabla 2, Valores de las absorbancias de la muestra de BSA con

el reactivo BIURET a longitud de onda 540 nm.

A partir de la tabla 2, se procede a realizar la curva de

calibracin haciendo uso de Microsoft Excel, como
software para graficar.

Grfico 2 Curva de relacin entre la cantidad de protena usada en

cada una de la muestras y la absorbancia de ellas.

Del grfico 2, se puede obtener una ecuacin de

linealizacin que relacione cantidad de protena con
Absorbancia.

( cantidad de Prote na(mg) )=

A 540 0.0298
(1)
0.0838

Donde A540 Absorbancia a 540 nm

Absorbancias obtenidas en cada una de las muestras
del extracto de hgado con el reactivo BIURET.
De las 4 muestras de extracto de hgado, una de las
muestras del hgado que no fue lavado, fue descartada
por presentar una mayor turbidez. Luego quedaron tres
muestras para trabajar.

Grfico 1 Absorbancias obtenidas en cada una de las muestras con

BSA para realizar la curva de calibracin de las pruebas de medicin
de cantidad de protena con BIURET.

Con base en el grfico 1 y en la tabla 1, se puede

obtener una relacin entre la absorbancia a 540 nm y la
cantidad de protena en la muestra.

Muestr
a
H-1
H-2
H-3

Descripcin
Muestra de hgado lavado
Muestra de hgado sin lavar
Muestra de hgado lavado

Tabla 3 Clasificacin de la muestras de hgado con el reactivo

BIURET

Al medir la absorbancia de cada una de las muestras, se

obtienen el siguiente grficoi.

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Grfico 3 Absorbancias obtenidas de las 3 muestras de extracto de

hgado.

Usando como base la ecuacin de linealizacin 1,

obtenida del grfico 2, podemos encontrar una posible
aproximacin de la cantidad de protena presente en la
muestra.
Muestr
a
H-1
H-2
H-3

Cantidad de Protena (mg)

2,9
4,9
4,3

Tabla 4 Cantidad de protena en muestras calculada en base a la

ecuacin 1

De lo anterior podemos mirar que la muestra H-1 se

aleja mucho del valor esperado que es
aproximadamente 4 mg; esto se debe a que la muestra
H-1 presentaba un mayor volumen de los 2.8 ml para
cada muestra y por tal motivo la reaccin con el
reactivo de BIURET no se llevo en las mismas
condiciones que las otras dos muestras.
La diferencia que existe entre la muestra H-2 y H-3, se
debe a los procesos fsicos a los que fueron expuestos
antes de su maceracin. H-2 fue una muestra que se
tom directamente sin pasar por un proceso de lavado
con agua sin destilar, por ende la cantidad de protenas
de ste expuestas en el extracto son mnimas con
respecto a la cantidad de protenas expuestas en el
extracto de hgado lavado con agua sin destilar.
Adems de esto H-2 se presenta una menor dispersin
de la luz.

Grfico 4 Absorbancias obtenidas de la muestra H-3 de extracto de

hgado antes y despus de agregar 0.2 m de Na Cholate

Nuevamente usando como base la ecuacin de

linealizacin 1, obtenida del grfico 2, podemos
encontrar una posible aproximacin de la cantidad de
protena presente en la muestra.
Muestr
a
H-3 -D
H-3 +D

Cantidad de Protena (mg)

4,3
3.9

Tabla 5 Cantidad de protena en muestras calculada en base a la

ecuacin 1

Como se pudo apreciar el Na Cholate permite la

clarificacin o eliminacin de la turbidez en la muestra,
con lo cual se da una mayor dispersin de la luz; y un
acercamiento al valor esperado de la cantidad de
protena
3.2 Determinacin del efecto de la temperatura en
la desnaturalizacin del extracto enzimtico del
hgado.
El rango en el que se midieron las absorbancias fue
desde 220 320 nm.
Longitud de onda (nm)

Absorbancia.

280
295

0,701
0,533

Tabla 6. Valores de absorbancia para extracto de hgado a

temperatura ambiente (25C).

Absorbancias obtenidas despus de haber agregado

Na cholate.
A la muestra H-3 se le agregaron 0,2 ml Na Cholate,
con el fin de disminuir la turbidez de la muestra.

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7
Grfico 5 Absorbancias obtenidas de la dilucin de extracto de
hgado a temperatura de 25 C

Longitud de onda (nm)

Absorbancia.

280
295

0,924
0,731

Tabla 7. Valores de absorbancia para extracto de hgado a

temperatura de 55C.

Grfico 8 Absorbancias obtenidas de la dilucin de extracto de

hgado a temperatura de 75 C

4. Discusiones y conclusiones.

Grfico 6 Absorbancias obtenidas de la dilucin de extracto de

hgado a temperatura de 55 C

Longitud de onda (nm)

Absorbancia.

280
295

2,009
1,632

Tabla 8. Valores de absorbancia para extracto de hgado a

temperatura de 65C.

El aumento de la temperatura en las protenas,

genera procesos de desnaturalizacin, y por ende
cambios en su estructura conformacional, causando
que esta cambie algunas de sus propiedades fsicas,
como por ejemplo la absorcin de la luz, debido a
que la cantidad de cromforos en el medio
aumenta con la temperatura.
Al obtener el extracto enzimtico del hgado, se
obtienen tambin varios elementos trazas o
componentes celulares aumentando la turbidez de
ste; generando interferencia en la medicin de la
absorbancia. Para esto se pueden utilizar
detergentes que ayuden a clarificar la muestra,
dando as un dato ms exacto de la absorbancia.
Existen otros factores como el pH que pueden
influir la estructura conformacional de las
protenas desnaturalizndolas, un ejemplo de esto
es la maduracin de las carnes en donde el pH
disminuye, permitiendo degradacin de protenas y
el ablandamiento de los tejidos.

Referencias

Grfico 7 Absorbancias obtenidas de la dilucin de extracto de

hgado a temperatura de 65 C

Longitud de onda (nm)

Absorbancia.

280
295

2,490
2.038

Tabla 9. Valores de absorbancia para extracto de hgado a

temperatura de 75C.

[1] Ibarra, A. Bioqumica. [En lnea] disponible en:

http://www.aibarra.org/Apuntes/Biofisica_Bioquimica/Bioqui
mica.
[2] Bioqumica estructural. Editorial Tbar. [En lnea]
disponible
en:
http://www.editorialtebar.com/flash/pdf/Bioquimica
%20estructural.pdf
[3] Hormaza, A. Manual de laboratorio de biorgnica.
Universidad Nacional de Colombia Sede Medelln. 2008
[4] Lodish, H.; Berk, A.; Matsudaira, P.; Kaiser, C.; Krieger,
M.; Scott, M.; Zipursky, S.; Darnell, J. Biologia celular y
molecular. 5 Edicin. 2011
[5] Fernndez, E.; Glvan A. Mtodos para la cuantificacin
de protenas. Departamento de Bioqumica y Biologa
Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio
Severo Ochoa, 14071-Crdoba
[6] Angulo, Y. Bioqumica Manual de Laboratorio.
Universidad de Costa Rica. 1999
[7] Switzer, R. y L. Garrity. Experimental Biochemistry:
Theory and exercises in fundamental methods. 3rd edition,
Freeman and Company, New York; 1999
[8] Donovan, J. Changes in Ultraviolet Absorption Produced
by Alteration of Protein Conformation. Estados Unidos, The
Journal of Biological Chemistry, 244, April 25, 1969 pg.
1961-1967
[9] Intrinsic Fluorescence of Proteins and Peptides. En lnea.
Disponible
en:
http://dwb.unl.edu/Teacher/NSF/C08/C08Links/pps99.cryst.b
bk.ac.uk/projects/gmocz/fluor.htm
[10] Sanz-Medel, A. ICP-MS for multiplex absolute
determinations of proteins. Agosto 2010

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Medelln Antioquia, Colombia, Sur Amrica

8
[11] M. Meury, D. Harder. Structure determination of
channel and transport proteins by high-resolution microscopy
techniques. Institute of Biochemistry and Molecular
Medicine. Switzerland
[12] Mehmet BALAR1. Mustafa Fatih. Determination of
protein and gluten quality-related parameters of wheat flour
using near-infrared reflectance spectroscopy (NIRS). Bayburt

University, Engineering Faculty, Food Engineering TURKEY

[13] Cindy Moser; Kathy Herman. Method for the Rapid
Determination of Protein in Meats Using the CEM Sprint
Protein Analyzer. Journal of AOA C International Vol. 94, N
o. 5, 2011

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i Las grficas 3 y 4 fueron desarrolladas en PAINT, debido a que las grficas originales obtenidas por el software de espectrometra, fueron borradas del
computador.