Instituto Tecnolgico Superior de Abasolo

Fecha :
Formato de prcticas de laboratorio
Nombre de la practica
Tincin de Gram

Materia
Biotecnologa Ambiental I

Carrera
Ing. Ambiental

Nmero de Alumnos

1.- Introduccin:
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el microscopio ptico. La
principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de
aumentar el contraste entre la clula y el medio que la rodea es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse
tambin para localizar estructuras especficas en la clula o para distinguir entre tipos diferentes de clulas.
Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas, proceso llamado fijacin. Para
las bacterias la fijacin por el calor es lo ms corriente, aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como
formaldehdo, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido secadas
sobre un portaobjetos, tratando despus ste con el agente fijador y siguiendo inmediatamente el proceso de tincin.
La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales
celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se
combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y
los polisacridos cidos.
La tincin de Gram, denominada as por el bacterilogo dans Hans Christian Gram, quien la desarrollo en 1884, es
una tincin diferencial, puesto que no tie igualmente todas las clulas. Sobre la base de su reaccin a la tincin de
Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, Gram + y Gram -.
Gram +: se tien de color violeta, esto se debe a que la pared esta formada por una gruesa capa de peptidoglicano
(un polmero complejo de amino-azcares, tambin llamado murena).
Gram -: se tien de color rosado, la pared de estas bacterias consiste en una capa delgada de peptidoglicano y una
capa exterior, la membrana externa con lipoprotenas y lipo-polisacridos. Debido a esta estructura el primer
colorante es extrado luego del lavado con etanol, fijndose posteriormente el segundo colorante.

NOTAS:
La solucin de Violeta cristal y Fucsina (o Safranina) son irritantes en contacto con la piel, ojos y mucosas.
La solucin de alcohol-acetona y la solucin de Fucsina (safranina) son inflamables por lo tanto se deben de
tomar los cuidados requeridos para el manejo de productos inflamables.
El mal uso de la solucin Alcohol-acetona puede llegar a decolorar los grmenes Gram +.
Cultivos y muestras viejas pueden dar resultados atpicos. Por ello se recomienda usar muestras de 18 a 24 hrs
como mximo o recientes.
Es importante controlar la fijacin por calor (dos o tres pasadas de un segundo por llama suave), un exceso del
mismo puede dar coloraciones errneas.
Agua altamente clorada puede debilitar la coloracin de contraste.
2.- Objetivo:
Relacionar la practica con el tema de Aislamiento y caracterizacin de moos de importancia ambiental visto en
clase
Aprender una de las tcnicas de tincin ms utilizadas en el laboratorio: la tincin de Gram
Adquirir destreza en la realizacin de observaciones microscpicas de moos.
Apreciar de forma visibles las diferentes formas microbianas
Distinguir bacterias Gram + y Gram
3.- Material:
Violeta Cristal (Violeta de
genciana)
Lugol
Alcohol Acetona (80-20), se
debe de preparar ya que no hay
en el laboratorio, un solo equipo
puede hacerlo para todos
Fucsina bsica Safranina
Agua destilada
Acetona
Alcohol del 96

Microscopio
5 Porta y cubreobjetos (por equipo)
4 Pizetas
4 Mechero Bunsen con manguera
Cronometro o timer
4 Goteros (por equipo)
2 Asas bacteriolgicas (o palillos de dientes)
1 Frasco de vidrio c/taparosca para 100 mL (solo el equipo que va a preparar
la solucin)
1 Frasco de vidrio c/taparosca para 25 mL (por equipo)
1 Probeta de 100 mL
Etiquetas para marcar
Servilletas
Muestras a utilizar: yogurt, soful, yakult, saliva, alimento en descomposicin
Encendedor o cerillos

4.- Desarrollo de la prctica:

1.- Realizar un frotis: colocar una gota de agua destilada sobre un portaobjetos limpio y desengrasado, enseguida
con el asa bacteriolgica previamente esterilizada tomar un alcuota de la muestra y dispersarla sobre la gota de
agua, dejar secar al aire por 1 minuto.
2.- Posteriormente fijar por calor, para esto se pasa 3 veces, lentamente el lado inferior del portaobjetos (la parte del
frotis queda arriba) por la parte superior de la flama del mechero.
2.- Dejar enfriar por 1 minuto
3.- Cubrir la preparacin fijada en el portaobjetos con una o dos gotas de Cristal violeta (Violeta de Genciana) y
dejar secar al aire por 1 minuto.
4.- Lavar con agua destilada (usa la pizeta), agrega el agua de forma paulatina (de gota en gota), esto solo es para
eliminar el exceso de Cristal violeta que no se fijo
5.- Dejar secar al aire, por 1 minuto
6.- Eliminar el exceso de agua, usando el extremo de una servilleta, solamente toca las gotas de agua (procura no
tocar con la servilleta el frotis)
7.- Cubrir con una o dos gotas de lugol, dejar secar al aire por 1 minuto
8.- Lavar con agua destilada (usa la pizeta), agrega el agua de forma paulatina (de gota en gota), solo es para
eliminar el exceso de lugol que no se fijo
9.- Dejar secar al aire, por 1 minuto
10.- Eliminar el exceso de agua, usando el extremo de una servilleta y solamente toca las gotas de agua (procura no
tocar con la servilleta el frotis)
11.- Decolorar la placa con Alcohol-acetona (80-20), durante 15 a 30 segundos hasta que la placa decolore
totalmente (usa otra pizeta para agregar la solucin, de la misma forma ve agregando de gota en gota)
12.- Lavar con agua destilada (usa la pizeta), agrega el agua de forma paulatina (de gota en gota), solo es para

eliminar el exceso de Alcohol-acetona que no se fijo

13.- Dejar secar al aire, por 1 minuto
14.- Eliminar el exceso de agua, usando el extremo de una servilleta y solamente toca las gotas de agua (procura no
tocar con la servilleta el frotis)
15.- Cubrir la preparacin con Fucsina bsica (o Safranina), dejar secar al aire por 1 minuto.
16.- Lavar con agua destilada (usa la pizeta), agrega el agua de forma paulatina (de gota en gota), solo es para
eliminar el exceso de Fucsina bsica (o Safranina), que no se fijo
17.- Dejar secar al aire, por 1 minuto
18.- Eliminar el exceso de agua, usando el extremo de una servilleta y solamente toca las gotas de agua (procura no
tocar con la servilleta el frotis)
19.- Agregar una gota de aceite de inmersin al preparado
20.- Cubrir con un cubreobjetos
21.- Examinar al microscopio usando el objetivo de inmersin (100X)
22.- Reportar tus observaciones
4.- Preguntas
1.- Qu importancia posee la tincin de Gram en el rea de Ingeniera Ambiental?
2.- Investigar la forma en que actan ciertos antibiticos, como la penicilina sobre la pared celular bacteriana
3.- Qu otras tinciones existen y cmo se realizan?, Cul es la diferencia con la tincin Gram?
4.- Para qu reas de la biotecnologa se puede aplicar la tincin Gram?
5.- Conclusiones:

M. en. E. IBQ. Erick R. Lpez Almanza