6/marzo/2015

P1. Actividad enzimtica fosfatasa alcalina

Apellidos: Plaza Jarque
Profesor/a: M Angeles Ull Solis

Nombre: Paula

Grupo: A3

1.- Indica las condiciones del ensayo de actividad enzimtica referidas a

la concentracin de los componentes del mezcla de reaccin:
Para realizar este ensayo, donde se realizan anlisis cinticos en ausencia y
presencia de inhibidor, se empieza preparando directamente en las cubetas las
mezclas de reaccin. Esta cintica se realiza a diferentes concentraciones de
sustrato sin que vare la cantidad de enzima. Pero la cantidad que se pone de
sustrato en los dos ensayos es la misma en las series homlogas, es decir, se
pone la misma cantidad de sustrato en la serie 1 de ambos ensayos, en la serie
2, Entonces con los siguientes datos:

Sustrato 1mM

0,07 ml

0,11 ml

0,15 ml

0,30 ml

0,60 ml

Y como se sabe que a cada una de las mezclas de reaccin se le aade

0,15ml de la disolucin de la enzima, con la siguiente ecuacin se obtendr la
concentracin de sustrato para cada una de las series:
Serie 1:
Serie 2:
Serie 3:
Serie 4:
Serie 5:

0,07 10!! L 1 10!! M = 1,5 10!! L [S]!

[S]! = 4,6666 10!! M
0,11 10!! L 1 10!! M = 1,5 10!! L [S]!
[S]! = 7,3333 10!! M
0,15 10!! L 1 10!! M = 1,5 10!! L [S]!
[S]! = 1 10!! M
0,30 10!! L 1 10!! M = 1,5 10!! L [S]!
[S]! = 2 10!! M
0,60 10!! L 1 10!! M = 1,5 10!! L [S]!
[S]! = 4 10!! M

Estas son las concentraciones que presentar el sustrato en cada serie. Y

como se ha dicho anteriormente la concentracin en el ensayo con inhibidor y
sin inhibidor es la misma, ya que se pone el mismo volumen en los dos
ensayos.

2.- Cintica de la fosfatasa alcalina en ausencia (Tabla 1) o en presencia

(Tabla 2) de fosfato inorgnico.
Completa las Tablas teniendo en cuenta el valor del coeficiente de extincin
molar del producto de la reaccin.
= 1,7 10! M !! cm!!
Determinar los valores de Km y vmax empleando la representacin de
Lineweaver-Burk.
Para poder obtener la pendiente, se ha tenido que realizar una representacin
de la absorbancia que presenta cada cubeta frente al tiempo en el que se mide.
En cada cubeta se introduce lo que indica en el guin:
Tabla 1.1. Absorbancia en un determinado tiempo a =400nm.

1
2
3
4
5

20s
0,073
0,075
0,095
0,113
0,12

40s
0,127
0,149
0,182
0,219
0,242

60s
0,178
0,222
0,27
0,326
0,363

80s
0,225
0,285
0,35
0,429
0,48

Representacin 1. Absorbancia frente al tiempo.

Con la pendiente de cada una de las siguientes series se podrn determinar los
siguientes parmetros:

Tabla 1. Ausencia de inhibidor.

Cubeta
1
2
3
4
5

A400/s
0,0025
0,0035
0,0043
0,0053
0,006

v0 (M s-1)
1,47059E-07
2,05882E-07
2,52941E-07
3,11765E-07
3,52941E-07

v0-1 (M s-1)-1
[S] (M)
[S]-1 (M)-1
6800000 4,66667E-05 21428,571
4857142,857 7,33333E-05 13636,363
10000
3953488,372
0,0001
5000
3207547,17
0,0002
2500
2833333,333
0,0004

Ahora se tendr que realizar el mismo procedimiento pero con presencia de

inhibidor, donde se ver que la velocidad es menor.
Entonces se mide tambin la absorbancia de las diferentes series a los
distintos tiempos, para poder obtener la pendiente de la recta que hace
referencia a A400/s.
Tabla 2.1 Absorbancia con inhibidor en un determinado tiempo a =400nm.

1
2
3
4
5

20s
0,023
0,03
0,039
0,057
0,085

40s
0,044
0,061
0,08
0,105
0,162

60s
0,066
0,09
0,118
0,153
0,241

80s
0,088
0,12
0,157
0,2
0,32

Representacin 2. Absorbancia con inhibidor frente al tiempo

Con esta representacin se podrn obtener los siguientes datos:

Tabla 2. Presencia de inhibidor

Cubeta
1
2
3
4
5

A400/s
0,0011
0,0015
0,002
0,0024
0,0039

v0 (M s-1)
6,47059E-08
8,82353E-08
1,17647E-07
1,41176E-07
2,29412E-07

v0-1 (M s-1)-1
15454545,45
11333333,33
8500000
7083333,333
4358974,359

[S] (M)
4,66667E-05
7,33333E-05
0,0001
0,0002
0,0004

[S]-1 (M)-1
21428,571
13636,363
10000
5000
2500

Una vez que se tienen todos estos datos, se puede realizar la representacin
de dobles inversos para as poder calcular Km y Vmax, donde se representar el
inverso de la velocidad inicial frente a la inversa de la concentracin tanto del
ensayo con inhibidor como sin inhibidor. El punto donde se nos cortan las dos
rectas (que tericamente, se deben cortar en el eje de ordenadas) se tendr el
inverso de la velocidad mxima, y cuando se corte en el eje de abscisas, se
tendr el inverso de Km.
Dicha informacin se obtiene del diagrama de Lineweaver-Burk. Su utilidad
consiste en el recproco de la cintica de Michaelis-Mentel:
! =

!"#
! +

1
1
! 1
=
+
! !"# !"# []
Realizando la representacin:
Representacin 3. Inverso de la velocidad frente al inverso de la concentracin.
3.1 Sin inhibidor

3.2 Con inhibidor

v0-1 (M s-1)-1 [S]-1 (M)-1

6800000 21428,57143
4857142,857 13636,36364
3953488,372
10000
3207547,17
5000
2833333,333
2500

v0-1 (M s-1)-1 [S]-1 (M)-1

15454545,45 21428,57143
11333333,33 13636,36364
10000
8500000
5000
7083333,333
2500
4358974,359

Pero en dicha representacin no se ve donde cortan las rectas en el eje de

ordenadas ni en el eje de abscisas, por lo tanto se tiene que realizar una
extrapolacin. Para hacer dicha extrapolacin, se tiene que hacer ms
pequea la escala, ya que el programa Excel no permite realizar
extrapolaciones en escalas tan grandes. Entonces se han multiplicado todos
los factores por 10-4.
A parte, para mejorar el coeficiente de regresin se quita de la recta el punto 4
del ensayo con inhibidor, ya que al quitarlo el coeficiente de regresin aumenta,
pero no ocurre lo mismo en la recta sin inhibidor, porque cuando se quita dicho
punto, la recta de regresin apenas cambia.
Teniendo en cuenta todos estos factores la grfica que se obtiene es la
siguiente:
Representacin 4. Dobles inversos extrapolado.

Se observa como las rectas no cortan en el eje de ordenadas, como debera de

ser tericamente. Se podra hacer una igualdad entre las dos ecuaciones de la
recta, pero segn la ecuacin de Michaelis-Mentel no se podra hacer ese
sistema de ecuaciones,Por lo tanto, el valor que se obtiene de vmax, en la
reaccin sin inhibidor es la siguiente:
209,96x+212,3=y
y=209,960+212,3
y=212,3104
1
!"#

= 212,05 10! ; !"# = 4,71031 10!! !!

Y respecto a la vmax de la reaccin con inhibidor, se obtiene que:

592,97x+286,05=y
y=592,97(-0,192553)+286,05
y=286,05104
1
!"#

= 286,05 10! ; !"# = 3,496014 10!! !!

Se ve como difieren unas unidades. El valor que se debera de obtener sera

obtener, es para ambas, la misma vmax y cortar en el eje de ordenadas.
Y el valor de Km ser, y=0 respecto a la de sin inhibidor;
209,96x+212,3=y
x=-1,0111

1
= 1,011 10! ; ! = 9,8897 10!!
!

Y el de Km ser, y=0 respecto a la de con inhibidor;

592,97x+286,05=y
x=-0,4824

1
= 0,4824 10! ; k ! = 2,0729 10!!
k!

Por ltimo, se calcula el valor de Ki:

K !! = K ! (1 +

I
)
K!

Donde se tiene que el valor de la concentracin del inhibidor [I]=10-4M

Por lo tanto, sustituyendo se obtiene dicho valor:
2,0729 10!! = 9,8897 10!! 1 +

K ! = 9,123928 10!!

10!!
K!