La scurit microbiologique

des eaux potables :

un des enjeux majeurs
du XXIme sicle
Henry-Michel Cauchie

Aquaple
22 fvrier 2007

Structure de lexpos
1. Prsentation du Centre de Recherche Public Gabriel Lippmann
2. Le risque microbiologique li aux eaux potables
1. Dfinitions: risque microbiologique, scurit,
2. Caractristiques des agents pathognes
3. Situation actuelle dans le monde
3. Moyens mettre en uvre pour assurer la scurit microbiologique
des eaux potables
4. Recherche et dveloppement au CRP-GL dans ce domaine
5. Conclusions

1. Prsentation du Centre de Recherche Public Gabriel Lippmann

Mission du Centre de Recherche Public Gabriel Lippmann

Recherche oriente

Recherche fondamentale
Recherche applique
Transfert technologique

Partenaires publics et privs

Dpartement EVA Environnement et Agro-Biotechnologies

Responsable Dr L. Hoffmann

Unit de recherche Ecosystmes aquatiques et terrestres

Responsable Dr H.M. Cauchie

Cr en 2000, actuellement 17 chercheurs et techniciens

Deux axes de recherche principaux :

Analyse et gestion de la biodiversit et des services cologiques des
cosystmes

Microbiologie environnementale
 Taxonomie et cologie microbienne
 Microbiologie applique (puration, biomthanisation,)
 Analyse quantitative du risque microbiologique dans les eaux
5

Analyse quantitative du risque microbiologique dans les eaux

Dynamique des pathognes lis leau dans les bassins versants ou
zones contributives
(protection des ressources, sant publique, interactions cologiques)

Indicateurs : E. coli, intestinal

enterococci, bacteriophages,
Pathognes:Salmonella, Legionella,
Giardia, Cryptosporidium, Hpatite
A, norovirus, poliovirus,
cyanobactries,

2. Le risque microbiologique li aux eaux potables

Dfinitions

Danger : Source de dommage pour lhomme ou les biens exposs

Risque : Probabilit de dommage dans des conditions donnes
dexposition au danger
Scurit (safety) : mise en place de barrire de protection
(traitements de leau, pratiques,) entre le danger (agent pathogne)
et les personnes

Brve histoire de la connaissance des maladies lies leau

Du moyen ge la moiti du XVIIIme sicle:
Les maladies (la Peste, le Cholra,) se propagent par les miasmes
disperss dans lair.

Brve histoire de la connaissance des maladies lies leau

John Snow, pidmiologiste anglais (1813 1858)
Il analyse la dynamique spatiale et temporelle
de lpidmie de cholra qui svit dans le
quartier de Soho Londres en 1854.

Il en dduit que le cholra

atteint les personnes ayant bu
de leau de la pompe deau
publique de Broad Street.

10

Un certain nombre de maladies sont dues des germes prsents dans leau

Cholra : bactrie Vibrio cholerae

7 pandmies entre 1817 et 1961

Fivre typhode : bactrie Salmonella typhi

Epidmie en Rpublique dmocratique

du Congo (27 Septembre 2004 - 11
Janvier 2005):
- 42 564 cas
- 214 mort (taux de mortalit: 0.5%)
11

Traitements des eaux et sant

A partir du XIXme sicle, mise en place de systmes

de collecte et traitement des eaux uses

(assainissement)

de traitement de leau destine la consommation

Paris 1820

humaine : filtration de leau, chloration

12

Le traitement de leau rduit la mortalit due la fivre typhode

Salmonella typhi

13

Endmisme, pisodes pidmiques (outbreak)

14

pisodes pidmiques aux tats-Unis (1920 2002)

1920 1930 : ~ 17 pisodes pidmiques par an
1991 2002 : ~ 15 pisodes pidmiques par an

15

pisodes pidmiques aux tats-Unis (1920 2002)

Vaccinations
Traitements thrapeutiques

16

Constats

Dans les pays industrialiss, la mise en place de mesures

dassainissement des eaux uses et de traitement de potabilisation des
eaux ont rduit loccurrence endmique des maladies lies leau.
Par contre, la frquence des pisodes pidmiques na par contre pas
diminu au cours du XXme sicle.
Les causes en sont notamment les changements doccupation des sols
(intensification de lagriculture, urbanisation), la croissance
dmographique et la centralisation des systmes de distribution deau.

17

Diversit et caractristiques majeures des pathognes

Bactries:
Campylobacter jejuni

Gastroentrite grave

Escherichia coli

O157:H7 Enterohmorragique
Entroinvasive (dysenterie - fivre),

Salmonella spp

Diarrhe sanglante, arthrite

Shigella spp.

Dysenterie, fivre

Vibrio cholera

Diarrhe, vomissements,

- Dose minimale infectieuse: 102 (Shigella) 108 (E.coli) cellules.

- Peuvent entrer en dormance dans le milieu ou se multiplier.
- Fort abattement avec les systmes de dsinfection classique (filtration,
chloration,)
- Traitements thrapeutiques gnralement efficaces

18

Diversit et caractristiques majeures des pathognes

Virus entriques:
Astrovirus

Gastroentrite svre

Norovirus

Gastroentrite svre, nause, vomissement

Entrovirus (poliovirus) Diarrhe, mnigites, encphalite,

Hpatite A

Fivre, anorexie, douleur abdominale

Dose minimale infectieuse: 1 10 (100)

- Persistance importante ou inconnue
- Abattement significatif avec chloration, ultrafiltration efficace

19

Diversit et caractristiques majeures des pathognes

Protozoaires parasites:
Cryptosporidium parvum

Diarrhe svre

Entamoeba histolytica

Douleur abdominale, diarrhe sanglante

Giardia lamblia

Douleur abdominale

Dose minimale infectieuse: 1 20 (100)

- Persistance trs importante
-Relativement rsistant la chloration
- ultrafiltration efficace
20

Diversit et caractristiques majeures des pathognes

Cyanobacteries:

- Certaine souches sont toxiques, relarguant leur toxine aprs la mort

cellulaire
- Dermatites, hpatotoxicit, neurotoxicit

Anabaena

21

1941-1960

1920-1940

1961-1970

Source : Craun et al., 2006 J Water Health

1971-1990

1991-2002

22

Situation mondiale actuelle

23

Distribution du Cholra ltat endmique aujourdhui

24

Situation globale quelques chiffres

 1,1 milliards de personnes nont pas

accs au volume minimum deau propre
ncessaire journellement (5 litres)
 2,6 milliards de personnes (la moiti
de la population des pays en
dveloppement) nont pas accs un
assainissement
 1,8 millions denfants meurent chaque anne de diarrhe induite par des
pathognes vhiculs par leau
 443 millions de jours dcole manqus chaque annes
 Des millions de femmes passant plusieurs heures aller chercher de
leau chaque jour
25

Lassainissement et lamlioration de lapprovisionnement en eau

sont la priorit des pays en dveloppement pour rduire lendmisme
des maladies vhicules par leau

26

Donnes 1995-2004

2 dfis majeurs au XXIme sicle: laccroissement de

la population mondiale et le changement climatique

27

3. Moyens mettre en uvre pour assurer la scurit

microbiologique des eaux potables au XXIme sicle

28

Origines des pollutions tats-Unis (1971 2002)

29

Constats

La qualit de leau peut tre altre diffrents endroits de la

chane dapprovisionnement
Une surveillance au niveau de la source deau et/ou du
consommateur (End-of-pipe control) uniquement savre inefficace
prvenir le risque de contamination.
Le risque de contamination doit tre caractris chaque tape
de la production deau potable suivant un principe similaire au
principe HACCP ( hazard analysis critical control point ) utilis
dans lindustrie alimentaire.

30

Mise en place de systmes de contrle multi-barrires

Approche catchment to consumer propose par lOMS
Connatre
son bassin
versant
Connatre la
qualit de
leau
source

Matrise des

Protection

traitements

de la

de leau

distribution

Eau potable
sre

31

tapes des plans de scurit pour leau (OMS) Water Safety Plans

Evaluation du
systme

Description de la ressource
Identification & prioritisation des dangers
Identification des mesures de contrle

Plan de
scurit
pour
leau

Surveillance
oprationnelle

Dfinir les limites oprationnelles

Etablir une surveillance

Gestion
&

Rvision,
approbation et
audit

Actions correctives, rponses aux incidents

Enregistrement des actions

Communication
Validation et vrification

32

Analyse quantitative du risque microbiologique

33

Bioterrorisme : le cas particulier dune contamination intentionnelle

Aux Etats-Unis, le Center for Disease Control and Prevention

(CDC) a class certains pathognes vhiculs par leau dans la
catgorie dagents biologique 2 (dissmination moyennement ais
raliser, faible mortalit):
Vibrio cholerae
Cryptosporidium parvum

Aucune attaque de cette nature ce jour

 Stimulation des recherches sur les moyens de dtection en
temps-rel des pisodes pidmiques volontaires ou non
 Rflexion sur la protection des infrastructures
34

Rglementation actuelle et future

Actuellement, la Directive europenne 98/83/CE (eaux destines

la consommation humaine) est dapplication.
Cette Directive ninclus pas les principes des Plans pour le
Scurit pour lEau.
Par ailleurs, la Directive-cadre 200/60/CE fait rfrence explicite
la gestion des eaux de surface et des eaux souterraines en
vue de leur usage comme source deau potable.
 La Directive europenne 98/83/CE est en rvision et devrait
inclure plus explicitement une rfrence aux Plans de Scurit
pour lEau. Un groupe de travail OMS/UE a t cr.

35

3. Recherches dans le domaine de lanalyse du risque microbiologique

36

Dmarche classique pour dterminer la prsence dun risque pathognes

Les pathognes sont souvent prsents des concentrations
relativement basses;
La dose minimal infectante de certains pathognes est relativement
basse, voire trs basse (virus, parasites).

Une dtection dindicateurs de contamination fcale plutt quune

dtection des pathognes eux-mme est gnralement utilise. Les
critres de qualit de la Directive 98/83/CE sont dailleurs fixs vis-vis
dindicateurs.

37

Les indicateurs sont prsents en beaucoup plus grande abondance que les pathognes

38

Mais leur survie nest pas toujours en rapport avec la survie de certains pathognes

39

Importance des biofilms dans la dynamique des pathognes ?

Non-bacterial pathogens
(e.g. viruses, parasites)

Beaucoup de

Inactivation

Inactivation

donnes

Water

t
en
hm
t
t ac
en
De
hm
tac
At

disponibles

Sloughing
or erosion

Manque de
donnes

Inactivation

Biofilm

Surface
40

Dfinition des questions de recherche

Lanalyse quantitative du risque microbiologique ncessite
des techniques de concentrations
des pathognes partir de grands
volumes deau ou partir de biofilms.
des techniques dvaluation:
de labondance des pathognes;
de la viabilit de ces pathognes;
de leur caractre infectieux.

41

Objectifs des recherche en cours

1) Objectifs mthodologiques:
Dvelopper et appliquer des techniques de concentration de
pathognes et de dtermination de leur abondance et de leur
viabilit (bactries, parasites), de leur virulence (virus) ou de
leur toxicit (cyanobactries).
2) Objectifs exprimentaux:
Comprendre les interactions pathognes - biofilms
3) Objectifs appliqus:
Identifier et localiser les danger microbiologique non
bactriens dans les parties majeures du systmes de
production deau potable au Grand-duch de Luxembourg
42

Pathognes-cibles
Virus : norovirus, entrovirus
Protozoaires parasites : Giardia, Cryptosporidium
Cyanobactries toxiques
Virus

Norovirus

Entrovirus

Parasite
Giardia
Cryptosporidium

Dure
moyenne
d'excrtion
fcale

Concentration
virale par
gramme de
selles

Dose
minimale
infectante
(DMI)

Symptmes

3 jours
(entre 12 h
et >15
jours)

> 106

10-100

Gastro-entrite

1 mois

103 - 106

10-15

Transmission
DMI
Incubation
Fcale-Orale
1 10 kystes
6-16 jours
Fcale-Orale 10 100 oocytses
4-9 jours

Gastro-entrite,
mningite,
affection
respiratoire

Symptmes
Diarrhes profuses, nauses
Diarrhes profuses, vomissements
43

Cyanobactries
100 x

Microcystis

Planktothrix

Cylindrospermopsis

5 genres principaux
Anabaena

Vsicules
gazeuses
Aphanizomenon

44

Cyanotoxines
1. Neurotoxines :
Paralytic Shellfish Poisons (PSPs) :
Saxitoxine (carbamate),
Toxicit : Venin du Cobra
2. Dermatotoxines :
Alcalodes
Lipopolysaccharides endotoxines (LPS)

3. Hpatotoxines : polypeptides
Microcystine plus de 60 variantes

Inhibiteurs de phosphatases

Dsorganisation du
cytosquelette

45

Concentration de virus et de parasites partir de grands volumes

deau (> 1000 litres)
Filtration sur membrane ultrafiltration : essai de rcupration
simultane des pathognes

46

Rendement des systmes de concentration

Dopage de 50
litres deau
avec virus et
protozoaires

Concentration primaire
200 ml
Concentration secondaire

quelques ml

Rendement total : < 20% 60%

47

Dtection et dtermination de la virulence des virus

Occurrence :

Eau

Concentration

qPCR
virus

Biofilms

Elution

Virulence :
culture cellulaire

48

La PCR (Polymerase chain reaction), un nouvel outil

PCR

49

Dtection des produits de PCR

Visualisation sur gel : prsence dune bande

= prsence du pathogne

PCR en temps rel  PCR quantitative

50

Signification de la prsence de produits de PCR

On dtecte la prsence de gnome viral ou parasitaire.

Aucune information sur la viabilit ou la virulence des pathognes

51

Culture cellulaire : estimation de la virulence des virus

Dilutions

101

102

103
52

Bote outil disponible au CRP-GL

Sample preparation

Virus
Somatic
Coliphages

Concentration

Extraction

Detection

Occurrence
(PCR)

Virulence
(Cell culture)

NF XPT90-451
QIAamp
Viral RNA

ISO/FDIS
10705-2 (1999)

Viral indicators
F-specific
Bacteriophages
(Genogroup
I to IV)

Enterovirus

NF XPT90-451

NF XPT90-451

Pathogenic
viruses
Norovirus
(GGI et II)

QIAamp
Viral RNA

Ogorzaly &
Gantzer, 2006
NEW!

ISO/FDIS
10705-1 (1997)

QIAamp
Viral RNA

Fuhrman et
al., 2005

NF XPT90-451

QIAamp
Viral RNA

Vinj, 2006

NF XPT90-451

53

Dtection et dtermination de la viabilit des parasites

Occurrence : qPCR

Eau

Concentration

Occurrence : microscopie
USEPA Method 1623

parasites

Biofilms

Elution

IFA

DAPI

DIC

Sparation
Immunomagntique

Viabilit : RT-qPCR
mRNA giardin, HSP70

54

La dynamique des pathognes est lie lhydrologie des eaux considres

Provar
Bavigne

Provar
Bavigne

Misre
Prcipitations (mm)

Misre

14

12

30

20

10

Prcipitations (mm)

Kystes ou oocystes/ 50 L

10

0
20/01/06

0
27/01/06

03/02/06

10/02/06

17/02/06

24/02/06

03/03/06

10/03/06

17/03/06

24/03/06

SEBES : 60000 m3/jour = 5.106 Giardia et Cryptosporidium /jour

55

Marqueurs gnomiques et protomiques de viabilit chez Giardia lamblia

Post-doc 2006-2007:
Recherche exploratoire de nouveaux indicators de viabilit de
Giardia lamblia

kystes

dsenkystement

trophozotes

Comparison
56

Cyanobactries

Eau de surface
Echantillonnage au filet
plancton

Microscopie

culture
in vitro

Eau traite
Echantillons
deau

PCR
(toxin-producing
Genes)

Dosage des
hpatotoxines &
neurotoxines

Abondance
Toxicit
57

Cyanobactries
1. Hpatotoxine:
Microcystines:
Screening: Test ELISA
Analyse: LC-MS
(MC-LR, -RR, -YR, -LW, -LF)
2. Neurotoxine:
Anatoxin-a:
Analyse: LC-MS
Saxitoxine:
Screening: PSP Kit detection
Analyse: LC-MS

58

Cyanotoxines-opron mcy (microcystine)

Toxicit non lie la

morphologie !

Toxique ?

Toxique ?

Schma
opron mcy
1. Souches monoclonales
2. Echantillons ESS

59

Des efflorescences abondantes en 2005

60

Cyanobactries en 2005
Recommendations OMS :
1)
150

Main
reservoir
Lultzhausen

125

g/l

100
75
50

Niveau dalerte 2
(OMS)

25

Ap
r -0
5
M
ay
-0
5
Ju
n05
Ju
l -0
5
Au
g05
Se
p05
O
ct
-0
5
No
v05
De
c05
Ja
n06
Fe
b06
M
ar
-0
6

2) Moins de 1 g microcystine par litre :

> 1 g.l-1
61

Cyanotoxines (mcy) - souches monoclonales

Conditions
contrles

11 souches

3 genres diffrents

Souche

Lieu

Date

0 5 BA4 0 S1
0 5 BA4 1 S1
0 5 BA4 3 S1
0 5 BA4 5 S1
0 5 ES3 7 S1
0 5 ES4 0 S1
0 5 ES4 1 S1
0 5 ES4 2 S1
0 5 ES4 3 S1
0 5 M I3 9 S1
0 5 M I4 3 S1

Bavigne

05/
12/
26/
09/
15/
03/
12/
19/
26/
28/
26/

Lulthauzen

M isre

10/
10/
10/
11/
09/
10/
10/
10/
10/
09/
10/

Espce
05
05
05
05
05
05
05
05
05
05
05

M icr ocystis sp.

M icr ocystis sp.
Planktothr ix agar dhii
Planktothr ix agar dhii
Planktothr ix agar dhii
Planktothr ix agar dhii
Planktothr ix agar dhii
Planktothr ix agar dhii
Planktothr ix agar dhii
M icr ocystis sp.
Aphanizomenon gr acile

PCR
mcyA

mcyE

+
+
+
+

+
+
+
+

+
+
+

+
+
+

7/8
potentiellement
hpatotoxiques

62

Travail exprimental sur les relations entre pathognes et biofilms

Racteur annulaire pour la production de biofilms
Temperature: 4C
dop avec 106 :
- 1 and 10-m billes fluorescentes
- Cryptosporidium parvum oocysts
- Giardia lamblia kystes
- Poliovirus (enterovirus)
- PhiX174 (somatic coliphage)

63

Travail exprimental sur les relations entre pathognes et biofilms

64

Travail exprimental sur les relations entre pathognes et biofilms

Les biofilms apparaissent comme tant des environnement protecteur

pour les virus et les parasites
Lors de flux turbulent, les dtachements de biofilms peuvent tre
important, remettant en circulation des pathognes toujours actifs
Biofilms deau uses
Exprimentation avec des conduites frachement excaves

65

Conclusions

Les problmes se situent des niveaux diffrents dans les pays

industrialiss et les pays en dveloppement
Laccroissement dmographique va augmenter de manire trs
importante la pression sur les eaux de telle manire que leau potable
sera un des enjeux stratgiques majeurs des annes venir
La mise en place des Plans de scurit pour leau constitue une
rponse adquate la gestion du risque biologique
mais ce risque volue (pathognes mergents) et des besoins
scientifiques et techniques spcifiques apparaissent
La R&D en gestion du risque microbiologique sera ds lors de plus en
plus sollicite.

66

CRP-GL : Centre de connaissance et dexpertise

Veille documentaire
Expertise

Analyses

67

http://swap2007.lippmann.lu/ !!! avant

1er

mars !!!

68

Personnel impliqu dans lanalyse des risques microbiologiques

Cyanobactriologie Dr Raphal WILLAME
Virologie Dr Sylvain SKRABER
Dr Christophe GANTZER (LCPME, Nancy)
Parasitologie Mr Karim HELMI
Dr Isabelle BERTRAND (LCPME, Nancy)
Bactriologie Mlle Laurence LEBLANC
Ecologie Dr Isabelle THYS
Epidmiologie Dr Jol MOSSONG (Laboratoire National de Sant)
Rgulation lgale Dr Jean-Paul LICKES (Ministre de lIntrieur)
Assistance technique Mr Nicolas BONJEAN
Mme Delphine COLLARD
Mlle Julie MATHU

69