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2013;20(6):250---254
www.elsevier.pt/ge
ARTIGO ORIGINAL
Determinac
o das diferentes estirpes de Clostridium difcile num
grupo de doentes com infecc
o causada por esta bactria
Cludia Cardoso a, , Ricardo Freire a , Jesuna Duarte b , Mnica Oleastro c ,
Andrea Santos c , Joo Carlos Rodrigues c , Isabelle Cremers a e Ana Paula Oliveira a
a
PALAVRAS CHAVE
Clostridium difcile;
Ribotipagem;
Electroforese em gel
por capilaridade
Resumo
Introduco: Nos ltimos anos tem-se vericado uma incidncia crescente da doenc
a associada
a Clostridium difcile (DACD). A caracterizac
o molecular das vrias estirpes tem permitido o
reconhecimento de determinados ribotipos da bactria associados a uma maior virulncia.
Objetivo: Isolamento e caracterizac
o molecular das estirpes de Clostridium difcile responsveis por DACD e a sua correlac
o clnica numa srie hospitalar.
Material e mtodos: Anlise prospetiva de doentes consecutivos com DACD, includos durante
um perodo de 18 meses. Foi realizada a colheita de dados epidemiolgicos, clnicos e laboratoriais. Aps exame cultural das fezes, todas as estirpes da bactria foram caracterizadas
geneticamente, por detec
o do gene gluD, especco da espcie, e dos genes codicantes das
toxinas A e B. Posteriormente, as estirpes foram genotipadas, com determinac
o do ribotipo,
por amplicac
o por PCR da regio intergnica RNAr16S-23S e separac
o por eletroforese em
gel por capilaridade.
Resultados: Foram includos 20 doentes, 65% do sexo feminino, com uma idade mdia de
73 anos. A maioria dos doentes adquiriu a infec
o em contexto nosocomial e apresentava
histria de antibioterapia prvia. O diagnstico de DACD ocorreu, em mdia, ao 7. dia de
internamento. Todas as estirpes foram conrmadas como sendo Clostridium difcile, produtoras das toxinas A e/ou B. Foi possvel obter um perl de ribotipo em 17 estirpes, no tendo sido
identicada nenhuma dominante. Os ribotipos mais observados foram o R014, o R027, o R126 e
o R501, cada um detetado em 2 doentes. Foram ainda isolados 3 novos pers, sem homologia na
base de dados. No houve correlac
o entre a gravidade da doenc
a e os ribotipos identicados.
Concluses: Na nossa casustica no se isolou nenhum ribotipo dominante, observando-se 2
casos causados pela estirpe hipervirulenta R027. No se vericou associac
o entre a gravidade
da doenc
a e os ribotipos isolados.
2012 Sociedade Portuguesa de Gastrenterologia. Publicado por Elsevier Espaa, S.L. Todos os
direitos reservados.
0872-8178/$ see front matter 2012 Sociedade Portuguesa de Gastrenterologia. Publicado por Elsevier Espaa, S.L. Todos os direitos reservados.
http://dx.doi.org/10.1016/j.jpg.2013.01.002
KEYWORDS
Clostridium difcile;
Ribotyping;
Pulsed eld gel
electrophoresis
251
Introduc
o
O Clostridium difcile (C. difcile) uma bactria gram
positiva anaerbia que se encontra presente na ora intestinal de 3% da populac
o adulta saudvel.
Existem, no entanto, vrias condic
es que podem afetar
a ora intestinal e predispor a doenc
a associada a C. difcile
(DACD) no Homem.
O espectro clnico da DACD varia desde o portador
assintomtico (cuja prevalncia atinge os 35% em doentes
hospitalizados) at colite pseudomembranosa grave com
megaclon txico associado, cuja mortalidade se situa entre
6-30%1---3 .
Tradicionalmente, a DACD ocorre em contexto nosocomial, associada utilizac
o de antibiticos (principal factor
de risco para a infec
o), idade avanc
ada e estados de
imunossupresso. Existem, contudo, na literatura, casos
descritos de infec
o por esta bactria em populac
es da
comunidade consideradas de baixo risco4 .
A sua virulncia mediada, na maioria dos casos, pela
produc
o em simultneo de 2 toxinas, A e B, ambas codicadas por genes do locus de patogenicidade, ocorrendo a sua
transmisso por via fecal-oral e a sua disseminac
o atravs
do contacto com doentes infetados, prossionais de sade
ou superfcies contaminadas5,6 .
Nos ltimos anos, tem-se assistido, a nvel mundial, a
um aumento do nmero de casos de infec
o por C. difcile associados a doenc
a mais grave, maior resistncia aos
antibiticos, com mortalidade e taxa de recidivas mais elevadas. So conhecidos atualmente mais de 150 ribotipos e 24
toxinotipos da espcie7 . A emergncia de uma nova estirpe
de C. difcile, designada de NAP1 ou ribotipo 027, tem
sido implicada em vrios surtos de doenc
a grave na ltima
dcada quer em contexto hospitalar quer em populac
es
saudveis da comunidade. A produc
o de nveis mais
elevados de toxinas A e B, para alm de uma toxina adicional conhecida como a toxina binria, parecem conferir
uma maior virulncia8---10 .
No Centro Hospitalar de Setbal assistiu-se, em determinada altura, a um aumento da incidncia de DACD com
critrios de gravidade e com uma percentagem de recidiva
mais elevada, o que motivou o incio deste estudo inovador com o intuito de caracterizar as estirpes circulantes na
nossa Instituic
o e melhorar as recomendac
es diagnsticas,
teraputicas e preventivas na DACD.
Objetivo
Isolamento e caracterizac
o molecular das estirpes de
C. difcile responsveis por DACD e a sua correlac
o clnica
numa srie hospitalar.
Material e mtodos
Anlise prospetiva de doentes consecutivos com DACD,
includos durante um perodo de 18 meses (marc
o de 2010agosto de 2011). O estudo foi aprovado pela Comisso de
tica Hospitalar, tendo sido obtido o consentimento informado em todos os casos.
Foram includos doentes seguidos em internamento nos
Servic
os de Medicina Interna, Gastrenterologia e Nefrologia
do Centro Hospitalar de Setbal.
O diagnstico de DACD baseou-se no quadro clnico complementado por um dos seguintes achados:
- Presenc
a de toxinas A e/ou B nas fezes detetadas atravs
do mtodo de imunocromatograa (sensibilidade de 8792%).
252
C. Cardoso et al.
Resultados
Foram includos 20 doentes, 65% do sexo feminino, com uma
idade mdia de 73 anos (32-89).
A infec
o foi adquirida em contexto nosocomial em 85%
dos casos. Todos os doentes se encontravam sob antibioterapia. As principais doenc
as infeciosas que motivaram a
necessidade de antibioterapia foram a respiratria e a urinria (g. 1). As classes de antibiticos mais utilizadas foram
as penicilinas, carbapenems, quinolonas e cefalosporinas
(g. 2). O nmero mdio de antibiticos por doente foi de 2.
Trs doentes adquiriram a doenc
a em ambulatrio, sem
fatores de risco identicados para infec
o.
O diagnstico de DACD ocorreu em mdia ao 7. dia de
internamento. A diarreia aquosa foi a forma de manifestac
o
da doenc
a em todos os casos, com um nmero mdio de
7 dejec
es/dia. As principais alterac
es analticas foram
a leucocitose (55%), com valores inferiores a 15.000 clulas/mL, e a hipoalbuminmia (85%), com um valor mdio de
Penicilina
Carbapenem
10
Quinolona
4
Cefalosporina
Aminoglicosdeo
4
4
Macrlido
Metronidazol
Figura 2
Classe de antibitico.
Infeco
respiratria
Figura 1
Diarreia
100%
Dor abdominal
35%
Leucocitose
55%
Hipoalbuminmia
85%
Complicaes
0%
Figura 3
Caracterizac
o clnica/analtica.
253
1
3
1
2
1
Metronidazol
2
Vancomicina
17
1
2
Figura 4
1
Gel agarose 2%
1
014
027
501
126
005
017
019
241
400
203
Figura 6
tcdA
Ribotipos isolados.
tcdB
cdtB
cdtA
gluD
Figura 5
Perl de migrac
o em gel de agarose.
Discusso
A diarreia associada a C. difcile constitu a causa mais
frequente de diarreia infeciosa nosocomial no mundo ocidental. A apresentac
o clnica e a gravidade da doenc
a so
variveis, com um espectro clnico que vai desde a diarreia
ligeira at colite grave complicada de megaclon txico,
perfurac
o intestinal, spsis e morte.
A virulncia da bactria mediada pelas enterotoxina
A e a citotoxina B, ambas codicadas por genes do locus de
patogenicidade e cuja expresso regulada pelo gene TcdR,
estimulador da expresso, e reprimida pelo gene TcdC11,12 .
Atualmente so conhecidos mais de 150 ribotipos da bactria, mas apenas alguns so enteropatogneos humanos.
A amplicac
o por PCR da regio intergnica RNAr16S-23S
e separac
o por eletroforese em gel por capilaridade o
mtodo mais utilizado a nvel europeu na identicac
o dos
254
prospetivo multicntrico que permitisse a incluso de um
maior nmero de doentes seria desejvel, com o intuito de
se determinar os ribotipos circulantes a nvel nacional e o
seu impacto clnico.
Concluindo, embora com um nmero reduzido de doentes
includos, na nossa casustica no se isolou nenhum ribotipo dominante, observando-se 2 casos causados pela estirpe
027. No se vericou associac
o entre a gravidade da doenc
a
e os ribotipos isolados. Foram detetados 3 novos pers de
ribotipos sem homologia na base de dados europeia e que
aguardam denominac
o.
C. Cardoso et al.
5.
6.
7.
8.
Responsabilidades ticas
Protec
o de pessoas e animais. Os autores declaram que
para esta investigac
o no se realizaram experincias em
seres humanos e/ou animais.
Condencialidade dos dados. Os autores declaram ter
seguido os protocolos do seu centro de trabalho acerca da
publicac
o dos dados de pacientes e que todos os pacientes includos no estudo receberam informac
es sucientes
e deram o seu consentimento informado por escrito para
participar nesse estudo.
9.
10.
11.
12.
Direito privacidade e consentimento escrito. Os autores declaram que no aparecem dados de pacientes neste
artigo.
13.
Conito de interesses
14.
15.
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