UNIVERSIDAD DE CARABOBO

FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS Y TECNOLOGA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGA
UNIDAD DE BIOTECNOLOGA APLICADA
SOCIEDAD VENEZOLANA DE MICROBIOLOGA - CAPITULO CARABOBO

Determinacin de Actividad Amilasa de Trichoderma asperellum en Fermentaciones Sumergidas y

Obtencin de Biomasa en medios Slidos

Autor: Ing. Macas Hendrick

Carabobo, Febrero 2015

Resumen

Se determin el rendimiento de las esporas de Trichoderma asperellum a travs de la fermentacin

slida, usando como medio de cultivo rico en carbohidrato arroz comercial a diferentes espesores de
lecho (25g, 50g, 75g), posterior fueron evaluados para conocer su rendimientos final de cantidad de
esporas obtenidas por cantidad de gramos de arroz utilizado siendo el mayor rendimiento el de
espesor de lecho de 25 g. reportando un promedio de 6,25 E +10 con la fermentacin sumergida se
determin la actividad de la enzima amilasa de Trichoderma asperellum sumergidos en un medio
compuesto de sales minerales y almidn como nica fuente de carbono en distintas muestras de 0,
24, 96 y 120 horas de incubacin.

Palabras claves: Espora, T. aperellum, medio de cultivo, enzima,

summary

Performance of spores of Trichoderma asperellum through solid fermentation was determined, using
as rich culture medium carbohydrate commercial rice different thicknesses bed (25g, 50g, 75g),
posterior were evaluated to final yields much spores obtained by many grams of rice used being the
highest performance of the thick bed 25 g. reporting an average of 6.25 E +10 submerged
fermentation with the enzyme amylase activity of Trichoderma asperellum was determined immersed
in a medium composed of minerals and starch as sole carbon source in different samples of 0, 24, 96
and 120 hours of incubation.

Keywords: Spore, T. aperellum, culture medium, enzyme,

Introduccin

Su principal uso en el comercio

mundial se deriva de su alta capacidad
celuloltica, la especie Trichoderma reesei
(Hypocrea jecorina). Trichoderma es tambin
un
eficiente
degradador
de
heteropolisacaridos como el xilano, mediante
la produccin de diversas hemicelulasas,
igualmente de amplio uso industrial (Biely y
Tenkanen, 1998) y algunos aislamientos son
agentes de bioremediacin, ya que degradan
algunos pesticidas de alta persistencia en el
ambiente, todos los anteriores se deben a su
capacidad de produccin de enzimas y
metabolitos.

La fermentacin en estado slido es

caracterizada por un proceso de fermentacin
sobre un soporte slido, el cual tiene un bajo
contenido de humedad (lmite inferior al 12%)
y ocurre en estado no asptico y natural
(Nigam and singh, 1994), este tipo de
fermentacin produce una alta concentracin
de producto con un relativamente bajo
requerimiento energtico (Mudeett et al,
1992; yang and yuan, 1900). En la industria de
alimentos ha sido explotada para diferentes
procesos productivos.

El gnero Trichoderma ha sido

estudiado para la produccin de enzimas y
otros metabolitos, as como para su
explotacin como efectivos agentes de control
biolgico, la especie predominante en este
estudio es el Trichorderma asperellum.

Al igual que la fermentacin lquida,

que Industrialmente tiene un amplio uso, de
los cuales destacan la obtencin de
metabolitos secundarios
principalmente
producidos bajo condiciones sumergidas
(fermentacin lquida), y ventajas que radican
en un mayor control de los parmetros como
son:
pH,
calentamiento,
condiciones
nutricionales, entre otros.

Materiales y Mtodos

Consiguiente a esto; la cepas nativas o

silvestres de bacterias y hongos, tienden a un
mejor comportamiento en condiciones de
fermentacin slida que los microorganismos
genticamente modificados, reduciendo
adems costos de energa y de requerimientos
(Barrios-Gonzlez et al. 1993).

Para la fermentacin solida se utiliz

como sustrato Arroz blanco comercial en
diferente espesor de lecho (25, 50 y 75 g) y se
inocul el medio con un caldo de Trichordema
asperellum que cubriera la totalidad de la
muestra.

En el caso de las especies del gnero

Trichoderma son abundantes en la naturaleza
y se encuentran frecuentemente en materiales
en descomposicin en el suelo, en donde
comprenden una porcin significativa de la
biomasa total de hongos (Osono T., 2005),
atacan superficialmente y son los primeros
colonizadores de la madera (Carlile M. et al,
2001). El gnero Trichoderma, segn Samuels
G.J, ET AL. (2012), agrupan alrededor de 80
especies, basados en datos moleculares que
incluyen hasta 100 especies, en su mayora
asociadas a estados telomorficos en los
gneros Hyprocrea y Podostroma.

Luego de la incubacin y desarrollo del

hongo se tom la muestra y se le agreg agua
corriente en cada uno de las muestras (25, 50,
75 g) y se homogenizaron con ayuda de una
paleta para obtener la mayor cantidad de
esporas, posterior se hizo pasar por un
colador, esta tcnica se repiti por triplicado
hasta que la suspensin del lavado de espora
fue aclarando, se trasvaso a un cilindro
graduado de capacidad de 1000 ml y se
determin el volumen obtenido. Posterior a
esto se realiza la toma de una alcuota de 1 ml
para realizar un dilucin seriada hasta 1/100,
as se determin el nmero de esporas/ml en
una cmara de Neubauer. Se anotaron los
3

diferentes resultados para comparar los

rendimientos en la fermentacin a distinto
espesor de lecho y determin cual es la
condicin que tiene mejor relacin costo
beneficio.

Resultados y discusin

Fermentacin Sumergida
Se tienen los resultados obtenidos de la
fermentacin
sumergida
del
hongo
Trichoderma asperellum expresados en la tabla
N 1, cuyas muestras se trabajaron en un caldo
con sales minerales y almidn como nica
fuente de carbono para la determinacin de la
actividad amilasa del almidn, puesto que en
presencia del grupo reductor de la glucosa se
reduce el cido 3,5 dinitirosalicilico de
coloracin amarilla a acido 3-amino5nitrosalicilico de coloracin rojo ladrillo, leda
en un espectrofotmetro a una longitud de
540nm. La mayor concentracin de azucares
reductores se obtuvieron en la muestra de 120
h de incubacin con una concentracin de
18,64 mg/L lo que conlleva una actividad
amilasa de 3,88 mg AR/ml.h lo que nos
evidencia que a mayor tiempo se obtuvo
mayor concentracin de glucosa como era de
esperarse, sin embargo al tener la
concentracin de amilasa directamente
proporcional pudo afectar que no se halla visto
afectado con el paso del tiempo ni haber
desarrollado alguna toxina propia del hongo
para hacer la actividad amilasa casi nula por ser
un cultivo considerado viejo.

Para la fermentacin sumergida se us un

caldo con sales minerales y almidn como
nica fuente de carbono, se utilizaron
diferentes muestras a tiempos de 0, 24, 72 y 96
horas de incubacin, se inoculo con esporas de
Trichoderma asperellum, se tom una muestra
inicial de 5 mL, dichas muestras fueron
centrifugadas (sobrenadante libre de clulas),
con la cantidad de 100 L de sobrenadante se
le aadi 100 L de solucin de almidn 0,1 %,
se mezcl adecuadamente y se tom 100 L y
se trasvas a otro tubo de muestra para
determinar los azucares reductores (AR)
iniciales, dicha tcnica se realiz por triplicado,
los cuales fueron congelados por 24h, los
restantes 100 L se incubaron a temperatura
ambiente por 24 h, al pasar las 24 h se
descongelaron las muestras para la
determinacin de los AR iniciales y finales
usando un kit de glucosa oxidasa y se llev a un
1 ml con agua destilada, se encubaron por 5
minutos y se determin la densidad ptica a
540nm.
Previamente se realiz la calibracin del
equipo (espectrofotmetro) con un blanco de
agua destilada, se realiz una curva de
calibracin de la glucosa y se compar la
actividad amilasa entre los distintos tiempos.

Tabla N 1 Valores de Absorbancia

Tiem
po
0
0
0
24
24
24
96
96
96
120
120
120

Inici
al
0.15
5
0.07
0
0.07
8
0.06
5
0.18
5
0.04
4
0.31
5
0.50
4
0.32
4
0.22
4
0.24
9
0.25
7

Fina
l
0.21
8
0.10
9
0.09
7
0.1
31
0.6
27
0.1
43
0.28
6
0.22
3
0.25
0
0.1
16
0.2
91
0.3
60

Inici
al
0
0
0
0
0
0
0.07
4
0.14
2
0.14
3
0.48
7
0.90
9
0.62
3

Fina
l
0.07
6
0.07
7
0.08
3
0.2
30
0.2
40
0.2
70
0.31
1
0.31
2
0.34
9
0.8
28
0.8
39
0.8
57

de lecho en comparacin con las otras

muestras, sabiendo que como caracterstica
del hongo usado crece en superficies en
condiciones aerobias, lo que representa un
mejor costo beneficio dando un promedio de
6,5E+10 Esp/g. Lo que demuestra que no es
necesario tener grandes cantidades de
sustrato para obtener altos rendimientos.

Prome
dio

0.0802
5

Tabla N 3 Rendimiento de esporas a

distintos espesor de lecho.

0.1612
5

Espesor
de lecho
25
25
25
25
25
25
25
50
50
50
50
50
50
75
75
75
75
75
75

0.2694
2

0.5033
3

Tabla N 2 Actividad Amilasa

Tiempo

0
24
96
120

Concentracin
de Azucares
reductores
(mg/L)
2,97
5,97
9,98
18,64

Actividad
amilasa
(mg
AR/mL.h)
0,62
1,24
2,08
3,88

Rendimiento
(Esp/g)
6,25 E + 08
3,3 E + 07
6,14 E + 09
5,63 E +10
1,21 E + 09
7,56 E +08
1,15 E + 09
9,0 E + 08
1,05 E + 09
9,98 E + 08
1,0 E + 09
2,73 E + 08
5,5 E + 07
5,1 E + 08
1,58 E + 08
1,30 E + 08
4,9 E + 06
2,22 E + 06
1,9 E + 08

Promedio

6,5 E + 10

1,2 E + 10

8,4 E + 8

Conclusiones

Fermentacin Solida.

En la tabla N 3 se contemplan los resultados

obtenidos en la fermentacin solida con el
hongo Trichoderma asperellum la cual fue
usado como cepa en un medio con arroz a
distinto espesor de lecho (25, 50 y 75 g), en los
cuales se observ un mayor crecimiento de
dicho hongo con coloracin verde ya
esporulado en la muestra de 25 g de espesor

En la fermentacin sumergida se
obtuvo mayor concentracin de
glucosa como era de esperarse a
mayor tiempo de incubacin.
La actividad amilasa fue directamente
proporcional con las concentraciones
de glucosa, lo que nos indica que en el
periodo de incubacin no fue afectada

por ninguna enzima o toxina generada

por el hongo.
La fermentacin solida usando la cepa
del hongo Trichordema asperellum se
obtuvieron mejores rendimientos de
espora en el espesor de lecho de 25
gramos de arroz.
La relacin costo beneficio se cumple
adecuadamente en este caso ya que
no es necesario poseer grandes
cantidades
de
sustratos
para
conseguir altos rendimientos.

Referencias Bibliogrficas

Barrios - Gonzalez J. Castillo T. Mejia A. (1993) Development of high penicillin-producing strauns fo

solid state fermentation. Biotechnol adr 11:525-537.
Biely, P. and Tenkanen M. (1993). Enzymology of hemicellulose degradation, Trichoderma ana
Gliocladium, pp 25-27.
Carlile M, etal. (2001). The fungi. second Edition Academic press.
Nigam P. Singh D. (1994) Solid-state (subtrate) fermentation systems and their applications in
biotechnology. J basic Microbiol 34:405-423.
Mudgett RE. Nash J. Ruther R. (1992). Controlled gas environments in solid state fermentations. Dev
Ind Microbiol 34:1217-1233.
Ogbonna J.C., Mashima, H., Tanaka, H. (2001). Scale up of etanol production from gar beet juice using
loofa sponge immobilized bioreactor. Bioresource Technology 76, 1-8.
Osono T. (2005). Colonization and succession of fungi during decomposition of swida controversa leaf
litter. MYCOLOGIA, 97,589-597.
Rivela. I., Rodriguez couto, S., Sanroman, A. (2000). Extracellular ligninollytic enzyme production by
Phanetrochaete Chysosporium in new solid-state bioreactor. Biotechology Letters 22, 14431447.
Samuel, G.J., Chaverri, P. Farr, DF,. and Macray, E.B (2012). Trichoderma online, systematic Mycology
and microbiology laboratory, ARS, USDA. Ultima versin en enero 2013 disponible en:
/Taxadescriptions/Keys/Trichodermaindex.cfm
Yang SS. Yuan SS., (1990). Oxytetracycline production by strepromyces rimosus in solid subtrate
cultivation on sweet potato residues. World J. Microbiol biotechnol 6:236-244.

Cuestionario

1. Cuadro comparativo entre fermentaciones slidas y sumergidas.

Fermentacin Solida
Fermentacin Sumergida
Medios simples, Requieren de agua o una Medios con mayor cantidad de ingredientes,
solucin mineral.
mayor costo. Buena reproducibilidad en medios
definidos.
Bajo riesgo de contaminacin (Baja Aw )
Alto riesgos de contaminacin.
Transferencia de calor critica.
Fcil control de temperatura por ser un medio
acuoso.
Mezclado imperfecto o casi imposible.
Mezclado intenso.
Microorganismos
usados
generalmente Se usan con mayor frecuencia levaduras y
hongos, pudiendo en algunos casos levaduras y bacterias.
bacterias.
Mayor formacin de Biomasa y etanol, Menor presencia de biomasa y etanol,
crecimiento de m.o lenta.
desarrollo de m.o rpida.
Medios concentrados, mayor concentracin de Medios diluidos, volmenes de fermentacin
producto.
grandes.
Menor consumo de energa para airear.
Transferencia G-L es generalmente limitante.
Cintica y fenmenos de transporte poco Modelos cinticos y disfuncionales.
conocidos.
2. Principales medidas de cuidado que se deben considerar al instalar e iniciar un proceso en
un fermentador sumergido.

La esterilizacin del medio de cultivo, as como del biorreactor o equipo que se utilice ya que
esta etapa ser crucial para el desarrollo del microorganismo en estudio.
Poseer el pleno conocimiento del equipo, para la realizacin de tomas de muestras, as como
cierre y aperturas de vlvulas, conexin de tuberas y mecanismo en general.
Transferencia de calor que disipara el medio con su correcta homogenizacin (aeracin del
medio).
Conocer el microorganismo en estudio para conocer comportamiento y posibles resultados.
1. Composicin particular del medio en la fermentacin sumergida de esta experiencia.
Fue usado un caldo con sales minerales y almidn como nica fuente de carbono para poder
determinar la actividad amilasa, ya que las amilasas son enzimas las cuales hidrolizan las molculas de
almidn dando como productos dextrinas y polmeros compuestos progresivamente por unidades de
glucosa, por ello la importancia del almidn en el medio de cultivo para tener una alta actividad
amilasa y poder determinarla.
1. Mecanismo qumico por el cual se determina la cantidad de azucares reductores con cido
dinitrosaliclico (DNS).
Se fundamente en el hecho de que una unidad de celulasa (IU) genera un micromol de
azucares reductores, expresados como glucosa, en un (1) minuto, bajo las condiciones del mtodo.

El reactivo consiste en una disolucin formada por los siguientes compuestos: acudo
dinitrosaliclico (cido 2-hidroxi-3,5dinitrobenzico), que acta como oxidante; sal de rochelle
(tartrato sdico-potsico), que impide la disolucin de oxgeno en el reactivo y hidrxido sdico, que
aporta el medio requerido para que se produzca la reaccin redox. De esta forma, el cido 2-hidroxi3,5dinitrobenzico se reduce, en presencia del grupo reductor de la glucosa, formando el cido 3amino-5dinitrosaliclico, mientras que el grupo aldehdo reductor se oxida, para formar un grupo
carboxlico. En el mtodo analtico el DNS esta en exceso frente a los grupos reductores y en todas las
muestras se adiciona la misma cantidad, de tal forma que mayores concentraciones de azucares
reductores provocan una mayor coloracin de la muestra. Estas diferencias de coloracin pueden
determinarse por espectrofotometra visible, a la longitud de onda de mxima absorbancia de 540nm.
2. Espesor de lecho y densidad aparente en una fermentacin slida.
El espesor de lecho se refiere a la cantidad e sustrato disponible para una fermentacin slida,
ms especficamente al grosor del sustrato disponible para la fermentacin, y la densidad aparente es
la relacin entre el volumen de aire contenido en el sustrato y el volumen total del sustrato. La
porosidad en el sustrato est determinada por la geometra y tamao, por lo que una eventual
compactacin modifica el volumen y porosidad hasta alcanzar un equilibrio. Bsicamente una
densidad aparente y espesor de lecho altos van a incidir en la fermentacin solida dependiendo del
tipo de sustrato y microorganismo con que se trabaje, pero se ha observado un mejor crecimiento en
fermentacin con menos espesor de lecho, por consiguiente que a menor espesor de lecho mayor
crecimiento se obtendr, al igual que a una densidad aparente alta favorecer el crecimiento debido
al oxigeno que favorece segn sea el caso de crecimiento microbiano.
3. Birreactores para fermentacin en estado solido

Biorreactor de lecho fluidizados

Sistema de operacin en modo continuo el cual puede ser operado por altos periodos de
tiempo a un alto valor de productividad, los primeros biorreactores costaban de un cilindro de vidrio,
con o sin chaqueta, llenado por una carga completa de lecho o sustrato, sin embargo causaba
problemas de compactacin. Las variaciones en el lecho han permitido un mejor funcionamiento de
este sistema ya que se utilizan pedazos de esponjas, troncos naturales, polmeros sintticos, as como
tambin canastas o cajas delgadas de acero inoxidable, que cuenten con perforaciones que permiten
tener una eficiente inmovilizacin de las clulas en el soporte con el medio de cultivo (Ogbonna, 2001;
rivela,2000). Dichos soportes son llenados por el medio solido a fermentar, los cuales fueron
previamente colocados a lo largo del contenedor.
El principio del diseo se basa de proveer agitacin y aeracin por flujo forzado de aire
proveyndolo por la parte del cilindro a travs de una bomba. El sistema provee un incremento en la
transferencia de oxgeno a la cama de sustrato, sin embargo, se presenta dao al inoculo por causa
del gran esfuerzo de corte generado, adems de que se forman gradientes de temperaturas a travs
de la columna que puede afectar el producto deseado.

Biorreactor contino tipo tanque agitado

Estos biorreactores trabajan en estado estacionario, es decir, que sus propiedades no varan
con el tiempo. Este modelo ideal supone que la reaccin alcanza la mxima conversin en el instante
9

en que la alimentacin entra al tanque. Es decir, que en cualquier punto de este equipo las
concentraciones son iguales a las de la corriente de salida. Adems se considera que la velocidad de
reaccin para cualquier punto dentro del tanque es la misma y suele evaluarse a la concentracin de
salida. Suele asumirse que existe un mezclado perfecto, pero en la prctica esto no es as, pero puede
crearse un mezclado de alta eficiencia que se aproxima a las condiciones ideales.

Biorreactor Biocon
Biocon diseo, desarrollo y patento un nuevo biorreactor llamado PlaFactorTM para llevar a
cabo fermentaciones usando matrices slidas. El sistema fue higinicamente diseado y automatizado
para un proceso de cultivo de charola, el cual ya es utilizado para un proceso de cultivo eficientemente
en plantas industriales en Biocon, en el desarrollo de productos de uso alimenticio. La fermentacin
se lleva a cabo en un biorreactor controlado por computadores. Todas las operaciones del proceso
fermentativo, como esterilizacin, enfriamiento, inoculacin, control, recuperacin de producto y
post- esterilizacin, se realiza en un solo quipo. El equipo consta de charolas selladas colocadas una
sobre la otra formando dos torres unidas por un eje central. Cada mdulo cuenta con un brazo de
mezclado, el cual rota alrededor axialmente, y con canales de remocin de calor metablico, control
de humedad, aireacin y vapor para la esterilizacin. Este equipo fue diseado con el objetivo de
reemplazar los cuartos de incubacin por un equipo ms compacto.

10