PROCEDIMIENTO METODO DE

RECUENTO EN PLACA DIRECTO

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Seccin Microbiologa
Alimentos

1.

PRT-712.02-024

Fecha emisin:
Octubre 2002
Revisin: 4
Fecha revisin:
27-05-2008
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OBJETIVO

Detectar el nmero de unidades formadoras de colonias (ufc.) de S. aureus presentes en muestras

de alimentos y agua
2.

CAMPO DE APLICACIN Y ALCANCE

Aplicar este procedimiento para

2.1. Analizar alimentos y agua en los cuales se espera un recuento > 100 clulas /g o mL
3.

FUNDAMENTO
Los Staphylococcus son microorganismos que viven en estrecha relacin con el hombre y la
gran mayora de las cepas son potencialmente capaces de causar enfermedad.
Staphylococcus aureus es un microorganismo fcilmente destruido por tratamientos trmicos
con altas temperaturas y por todos los agentes sanitizantes. Por lo cual la presencia de esta
bacteria o sus toxinas en alimentos procesados o en equipos, generalmente indica falta de
sanitizacin o contaminacin cruzada.
Los alimentos se analizan para pesquisar S.aureus por las siguientes razones:
Confirmar que este microorganismo fue el agente causal de la intoxicacin alimentaria.
Determinar qu alimentos o ingredientes de alimentos son fuente de contaminacin de
Staphylococcus aureus.

Demostrar contaminacin post proceso los cuales usualmente se deben a contacto humano
con alimentos procesados o exposicin del alimento a superficies inadecuadamente
sanitizadas.
Los alimentos comnmente asociados a intoxicaciones son: carne (vacuno, cerdo, pollo),
productos crneos (jamn, salame, vienesas) ,ensaladas (papas, porotos verdes, jamn, pollo),
productos de pastelera (cremas) y productos lcteos (queso, queso de cabra ,etc)

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4.
4.1
4.2
4.3

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REFERENCIAS
Bacteriological Analytical Manual Online Enero 2001.
Tcnica de coagulasa en tubo PRT-712.02-026.
Prueba de termonucleasa en cepa de S. aureus PRT-712.02-027

5.
TERMINOLOGA
No Aplica
6.

MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

6.1

MATERIALES

6.1.1 Pipetas bacteriolgicas de 1 mL.graduadas en 0,1.estriles

6.1.2 Rastrillos de vidrio o de plstico autoclavable estriles, de 3-4 mm de dimetro, 15-20 cm
de largo con ngulo de diseminacin de 45-55 mm.
6.1.3 Placas Petri de vidrio o desechables de 90-100 mm estriles.
6.1.4 Tubos de 13 x 100 mm con tapa rosca, estriles
6.2

EQUIPOS

6.2.1 Estufa de incubacin regulada a 35 C 1C

6.2.2 Agitador de tubos
6.3

MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

6.3.1 Agar Baird Parker pH 6,8-7,0 distribuido en Frascos Schott con 475 mL (o medio
completo plaqueado)
6.3.2 Solucin yema de huevo 50%.
6.3.3 Telurito de potasio al 1% (se puede utilizar solucin yema de huevo comercial con
telurito de potasio).
6.3.4 Solucin sulfametazina 0,1% (opcional para inhibir desarrollo Proteus).
6.3.5 Agar soya tripticasa pH 7,3 0.2

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6.3.6 Caldo infuso cerebro corazn pH 7,4 0.2 en tubo tapa rosca de 13x100 mm
6.3.7 Plasma de conejo con EDTA o plasma fresco diluido 1:3 con agua destilada estril.(usar
preferentemente plasma comercial)
6.3.8 Agar T B-DNA
6.3.9 agar triptona extracto de levadura M 165 BAM para preparar agar glucosa y agar manitol
6.3.10 Lisostafina
6.3.11 Aceite mineral estril
6.3.12 Perxido de hidrgeno al 3%
6.3.13 Agar conservacion de cepas pH 7,2 en tubo 10x75 mm
6.3.14 Cepa control coagulasa positiva: S. aureus.
6.3.15 Cepa control coagulasa negativa: S. epidermidis
7.

DESARROLLO

7.1

RECEPCIN DE LA MUESTRA EN EL LABORATORIO 346

7.1.1

Recibir en el Laboratorio de Recuentos, las muestras procesadas en el Laboratorio de

Recepcin de Muestras (dilucin 10- ) segn PRT-712.01-002.

7.1.2

Anotar en cuaderno de inscripcin, nmero de las muestras a sembrar y la clave

interna.

7.1.3

Identificar 3 placas Petri con nmero, dilucin de la muestra y clave interna.

7.1.4

Marcar en cada dilucin el volumen a sembrar en cada una de las placas Petri : 0,3 0,3
y 0,4 Ml.

7.1.5

De cada dilucin transferir 1 mL de suspensin a tres placas de agar Baird Parker

distribuyendo 1 mL equitativamente en las tres placas (0,3 , 0,3 y 0,4 mL).

7.1.6

Extender el inculo mediante rastrillo estril, hasta que la superficie est seca. Retener
las placas en posicin no invertida hasta que el inculo se absorba ( aprox 10 minutos).

7.1.7

Si el inculo no est completamente absorbido dejar las placas sin invertir en la

incubadora por 1 hora. Incubar las placas invertidas a 35 C durante 45-48 horas.

7.2

LECTURA Y REGISTRO

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7.2.1

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Recuento Presuntivo

7.2.1.1 Seleccionar las placas que contengan entre 20-200 colonias.

7.2.1.2 Realizar recuento de todas las colonias circulares, brillantes, convexas, de 2-3 mm de
dimetro, de color negro azabache o gris oscuro, con margen claro (blanco), rodeado
por zona opaca y fuera de ella una zona clara, de consistencia cremosa cuando son
tocadas con el asa de inoculacin. Ocasionalmente en varios alimentos y productos
lcteos pueden encontrarse cepas de apariencia similar a S. aureus no lipolticas, salvo
que las zonas claras y opacas alrededor de la colonia estn ausentes. Cepas aisladas de
productos deshidratados o congelados almacenados por largos perodos desarrollan
colonias menos negras que las colonias tpicas y pueden desarrollar apariencia rugosa y
textura seca.
7.2.1.3 Anotar el recuento obtenido en cada tipo de colonia y dilucin en el "Registro anlisis
de nuestras de alimentos y agua Laboratorio de Recuentos" Cdigo RG-712.00-023.
Recuento presuntivo =
7.2.2

Lectura x Factor de dilucin

Registro

7.2.2.1 Si son observados muchos tipos de colonias con apariencia similar a S. aureus en
todas las placas sembradas, registre el nmero de colonias contadas de cada tipo
separadamente.
7.2.2.2 Cuando placas de diluciones bajas tienen < 20 colonias, use este valor.
7.2.2.3 Si las placas contienen > 200 colonias de apariencia tpica y en diluciones ms altas no
hay colonias tpicas, utilizar estas placas para el recuento y no cuente las colonias no
tpicas.
7.2.2.4 Seleccionar ms de una colonia ( 3 a 5) para cada tipo de colonia contada y realizar test
de coagulasa y termonucleasa.
7.3
7.3.1

PRUEBAS CONFIRMATIVAS
Estudiar las colonias o un nmero significativo de ellas si el recuento es alto. El test de
produccin de coagulasa es especfico para la especie. Se pueden realizar otras pruebas
auxiliares como, catalasa, utilizacin anaerbica de glucosa, utilizacin anaerbica de
manitol, nucleasa termoestable, sensibilidad a la lisostafina. La termonucleasa es tan
especfica como la coagulasa pero menos subjetiva y es muy til para complementar y
confirmar los test de coagulasa registrados con lecturas de 3+, 2+ y 1+.

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7.3.2

Ensayo de coagulasa en tubo. Aplicar PRT-712.02-026.

7.3.3

Produccin de nucleasa termoestable. Aplicar PRT-712.02-027.

7.4
7.4.1

7.5

Fecha emisin:
Octubre 2002
Revisin: 4
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EXPRESION DE RESULTADOS
Segn la proporcin de colonias coagulasa positivas calcular el nmero de ellas por
gramo de la muestra.
CALCULO

Recuento de S. aureus = Rto presuntivo X N de colonias confirmadas

N de colonias repicadas
7.6
7.6.1
8.

INFORME
Se expresa en ufc de S. aureus por g o mL de producto analizado
REGISTROS

Identificacin
del registro

Almacenamiento

Proteccin

Recuperacin Tiempo
retencin y
disposicin
Acceso restringido al Papel
5 aos y
Registro control Archivador verde
Registros
Laboratorio
personal
Seccin
disposicin
en
de Ambiente
N 346 Seccin
Microbiologa
basura normal
cdigo RGMicrobiologa
partidos en
712.00-009.
Alimentos
trozos
Archivador verde
Acceso restringido al Papel
5 aos y
Registro control
Registros
Laboratorio
personal
Seccin
disposicin en
de esterilidad de
Microbiologa
basura normal
medios de cultivo N 346 Seccin
Microbiologa
partidos en
utilizados en el
Alimentos
trozos
anlisis
Laboratorio 346
cdigo RG712.00-010.

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Identificacin
del registro

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Pgina 6 de 13

Recuperacin Tiempo
retencin y
disposicin
Archivador azul
Acceso restringido al Papel
5 aos y
Registro anlisis
Registro
de
Lecturas
e
personal
Seccin
disposicin en
de muestras de
informes de resultado Microbiologa
basura normal
alimentos y agua
de
laboratorio
partidos en
Laboratorio de
trozos
Recuentos cdigo Recuento aerobios
mesfilos, S.
RG-712.00-023.
aureus,Mohos y
levaduras Seccin
Microbiologa
Alimentos
Archivador
Registros Acceso restringido al Papel
5 aos y
Registro
de
Entrega
diaria
personal
Seccin
disposicin en
entrega diaria de
Microbiologa
basura normal
muestras a los Laboratorio N 346
Seccin
Microbiologa
partidos en
laboratorios
Alimentos
trozos
cdigo
RG712.00-037.

9.

Almacenamiento

Fecha emisin:
Octubre 2002
Revisin: 4

Proteccin

TABLA DE MODIFICACIONES

Revisin N
3
3

Pg.
Motivo del cambio
Modificada
1
Se elimina pgina 1 por cambi en formato
documento institucional.
1 a 10
Se cambi formato del encabezado de pgina en
todo el documento.

Fecha
Aprobacin
27/05/2008
27/05/2008

Se corrige PRT-702.02-024 por PRT-712.02-024.

Se cambi nmero de revisin por 3 por revisin N
4 y el total de pginas.
3

En el punto 1 se agreg ... en muestras de

alimentos y agua.

27/05/2008

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Revisin N
3
3
3
3
3
3

3
3
3
3
3
3

3
3

PRT-712.02-024

Fecha emisin:
Octubre 2002
Revisin: 4
Fecha revisin:
27-05-2008
Pgina 7 de 13

Pg.
Motivo del cambio
Modificada
1
En la frase del punto 2.1 se agreg: ...y agua...se
espera un recuento....
1
Se deja pie de pgina slo en pgina 1 y se
actualizan los cargos.
1
En el punto 3. se corrigi staphylococcus por
Staphylococcus
2
En el punto 4.2. se corrigi PRT-702.02-026 por
PRT-712.02-026.
3
En el punto 4.3 se corrigi PRT-702.02-027 por
PRT-712.02-027.
3
En el punto 6.0 se agreg al listado : solucin de
yema de huevo al 50%, solucin telurito de potasio
1%,( se puede utilizar solucin yema de huevo
comercial con telurito de potasio),Solucin de
sulfametazina 0,1% (opcional para inhibir el
desarrollo de Proteus), lisostafina y aceite mineral
estril.
En el punto plasma s eagreg ...(usar
preferentemente comercial).
En el punto Baird Parker se agreg ...(o medio
completo plaqueado).
4
En el punto 7.1.1 se cambi PRT-702.01-002 por
PRT-712.01-002.
4
En los puntos 7.1.2 y 7.1.3 se agreg ...y clave
interna.
4
En el punto 7.1.4 se corrigi ml por mL.
4
En el punto 7.1.5 se elimin la palabra plaqueada
4
En el punto 7.1.6 se agreg la frase:.. el inculo..
4
En el punto 7.2.1.2 se agreg : en varios alimentos y
productos lcteos pueden encontrarse cepas de
apariencia similar a S. aureus no lipolticas, salvo
que las zonas claras y opacas alrededor de la
colonia estn ausentes.
4
En el punto 7.2.1.3 se cambi RG-702.00-023 por
RG-712.00-023.
5
Se agreg el punto 7.2.2 Registros y lo temes

Fecha
Aprobacin
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008

27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
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27/05/2008
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Revisin N

Pg.
Modificada
5

10

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Revisin: 4
Fecha revisin:
27-05-2008
Pgina 8 de 13

Motivo del cambio

7.2.2.1 al 7.2.2.4.
En el punto 7.3.1 se agreg:
El test de produccin de coagulasa es especfico
para la especie....
...sensibilidad a la lisostafina. La termonuclesa es
tan especfica como la coagulasa pero menos
subjetiva y es muy til para complementar y
confirmar los test de coagulasa registrados con
lecturas de 3+, 2+ y 1+.
En los puntos 7.2.2 y 7.2.3 se cambo por PRT702.02-026 y PRT-702.02-027 por PRT-712.02-026
y PRT-712.02-027 respectivamente.
Se cambi el punto 8. 0 RESPONSABLES por
REGISTROS.
Se cambio el punto 9.0 DISTRIBUCION por
TABLA DE MODIFICCAIONES
En el punto 10.1 se cambi RG-702.00-009 por RG712.00-009
En el punto 10.2 se cambi RG-702.00-010 por RG712.00-010.
En el punto 10.3 se cambi RG-702.00-023 por
RG-712.00-023.
En el punto 10.4 se cambi RG-702.00-037 por RG712.00-037.
Se agreg tabla de registros
El punto 10.0 REGISTROS se cambi a ANEXOS
y sus temes.
Se modific anexo N 3 en
Primera vieta: ....almacenado hasta 1 mes en
refrigeracin.
Segunda vieta:
- si se ha almacenado a temperatura ambiente

Fecha
Aprobacin
27/05/2008

27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008

27/05/2008
27/05/2008

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Revisin N

10.

Pg.
Modificada

10

10

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Revisin: 4
Fecha revisin:
27-05-2008
Pgina 9 de 13

Motivo del cambio

(20C a 25 C ) por ms de 5 das.
-si el medio plaqueado ha perdido la opalescencia
inicial.
Se agreg hoja anexo N5 RG-712.00-023
En tem solucin stock sulfametazina se corrigi
Proteus por Proteus sp.

Fecha
Aprobacin

27/05/2008
27/05/2008

ANEXOS

Anexo N1 Esquema recuento S. aureus Tcnica Recuento en placa por siembra en superficie.
Anexo N2 Caracterizacin de los diferentes medios de cultivo utilizados para la deteccin de
S. aureus en alimentos.
Anexo N3 Precauciones en la preparacin del medio Baird Parker.
Anexo N4 Secado de placas con agar Baird Parker.
Anexo N5 Hoja Registro anlisis de muestras de alimentos y agua Laboratorio de Recuentos
cdigo RG-712.00-023.

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ANEXO N 1
RECUENTO S. AUREUS
TECNICA RECUENTO EN PLACA POR SIEMBRA EN SUPERFICIE
1 mL
HOMOGENEIZADO:

9 mL AP

10 g muestra
90 mL Agua peptonada 0.1%

Dil 10 -1

10 -2

10 -3

SIEMBRA :

0,3 mL

0,3 mL

0,4 mL

0,3 mL

0,3 mL

0,4 mL

0,3 mL

0,3 mL

Agar Baird Parker

INCUBACION:

35 C por 48 horas

LECTURA PLACAS :

Lectura de placas que contengan entre 20 a 200 ufc

Colonia , negra con caractersticas de S. aureus

REAISLAMIENTO :
Pruebas bioqumicas
o toxinas
caldo cerebro corazn
Incubar a 35 C por 24 hrs

Agar estra

Prueba coagulasa en tubo

Plasma de conejo

Prueba de termonucleasa
Agar TB-DNA

CONFIRMACION :

0,4 mL

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INCUBACION:

Incubar a 35 C por
4-18 horas

Incubar en cmara hmeda

a 35 C por 4 hrs

LECTURA PRUEBAS
CONFIRMATIVAS

Leer a las 4hrs, los tubos

negativos incubar hasta 18 hrs

Leer a las 4hrs

CLCULO

Contar el N de tubos positivos de cada dilucin, hacer el clculo

segn tubos confirmados

INFORME

Informar como N de UFC/g o mL de producto

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ANEXO N 2
CARACTERIZACION DE LOS DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO
UTILIZADOS PARA LA DETECCION DE S. AUREUS EN ALIMENTOS
Medios de cultivo

Incubacin

KRANEP

Tiempo
hrs
48

Temp
C
35

BAIRD PARKER

48

35

TPEY

48

35

AGAR
SANGRE 24
POLIMIXINA

35

P-CSTS *

35

48

Agentes
selectivos Lectura
diferenciales y estimulantes

Cloruro de sodio
cloruro de Litio
Rodanuro de potasio
Azida de sodio
Cicloheximida
Manitol
Piruvato de sodio
Yema de huevo
Cloruro de litio
Telurito de potasio
Glicina
Piruvato de sodio
Yema de huevo
Cloruro de sodio
Cloruro de Litio
Telurito de potasio
Polimixina B
Yema de huevo
Polimixina B
Sangre de cordero
Cloruro de sodio
Piruvato de sodio

* P-CSTS: Caldo soya tripticasa con 10% NaCl y 1 % piruvato de sodio

Colonias
amarillas
que degradan la yema
de huevo

Colonias negras o
grises
brillantes,
convexas
rodeadas
por un halo de
precipitacin o reas
claras.
Colonias negras o
grises
brillantes,
convexos, rodeadas
por la reaccin yema
de huevo.
Colonias
que
presentan halos de
hemlisis tipo
Turbidez

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ANEXO N 3
PRECAUCIONES EN LA PREPARACION DEL MEDIO BAIRD PARKER
El medio base puede ser almacenado hasta 1 mes en refrigeracin.
El medio completo no debe usarse:
- si se ha almacenado a temperatura ambiente (20C a 25 C ) por ms de 5 das.
- si el medio plaqueado ha perdido la opalescencia inicial.
En perodos prolongados de almacenamiento del medio deshidratado se reduce la
selectividad. Este efecto puede ser revertido por adicin de 0,5 mL de piruvato de sodio al
20% p/v en la superficie del medio de cultivo plaqueado y dejar secar a 50C por 1/2 hora
o hasta que la superficie de la placa est seca.
Realizar control de calidad utilizando el mtodo ecomtrico a cada partida de medio
preparado (IT-712.00- 008).
Solucin stock de sulfametazina
Disolver 0,5 g de sulfametazina en 25 mL de Hidrxido de sodio 0,1 N.
Enrasar a 250 mL con agua destilada. 27,5 mL de esta solucin aportan 0,055 g.
Adicionar la solucin de sulfametazina para reprimir el crecimiento de Proteus.
ANEXO N 4
SECADO DE PLACAS CON AGAR BAIRD PARKER
Las placas a usar deben estar secas a fin de prevenir la extensin y mezcla de colonias.
El secado de las placas se puede efectuar colocando las placas:
En un horno o incubadora a 50 C por 30 minutos, quitando la tapa y colocando la
superficie del agar hacia abajo.
En un horno o incubadora a 50 C por 2 horas con la tapa puesta y la superficie del agar
hacia arriba.
En una incubadora a 37 C por 4 horas con la tapa puesta y la superficie del agar hacia
arriba.
En la mesa del laboratorio por cerca de 16 horas a la temperatura ambiente, con las tapas
puestas y la superficie del agar hacia arriba.