Pendahuluan

Transkripsi melibatkan sintesis rantai RNA merupakan salah satu untai DNA dupleks.
RNA identik secara berurutan dengan satu untai DNA, yang disebut coding strand. Hal ini
melengkapi untai lainnya, yang menyediakan template strand untuk sintesisnya. GAMBAR 11.1
merangkum hubungan antara DNA untai ganda dan RNA transkrip single stranded.

Gambar 11.1 Fungsi dari RNA polimerase untuk menyalin satu strand dari duplek DNA kedalam
RNA.

Sintesis RNA dikatalisis oleh enzim RNA polimerase. Transkripsi dimulai ketika RNA
polimerase mengikat wilayah khusus, promotor, startpoint gen. Promotor mengelilingi pasangan
basa pertama yang ditranskripsi menjadi RNA, pada ujung awal tersebut. Dari titik ini, RNA
polimerase bergerak sepanjang template, sintesis RNA, sampai mencapai urutan terminator (t).
Tindakan ini mendefinisikan unit transkripsi yang memanjang dari promotor terminator. Fitur
penting dari unit transkripsi, digambarkan dalam Gambar 11 2, adalah bahwa hal itu merupakan
bentangan DNA diekspresikan melalui produksi dari molekul RNA tunggal. Sebuah unit
transkripsi dapat mencakup lebih dari satu gen.

Gambar 11.2 Unit transkripsi adalah urutan dari transkrip DNA ke dalam RNA tunggal, dimulai
pada promoter dan diakhiri pada terminator.

Urutan sebelum startpoint yang digambarkan sebagai hulu dari itu; setelah stanpoint
(dalam urutan ditranskripsi) yang hilir itu. Urutan secara konvensional ditulis sehingga hasil
transkripsi dari kiri (hulu) ke kanan (hilir). Hal ini sesuai dengan menulis mRNA biasanya dari
arah 5' 3'.
Urutan DNA sering ditulis untuk menunjukkan hanya coding strand, yang memiliki
urutan yang sama seperti RNA. Posisi dasar diberi nomor di kedua arah jauh dari startpoint, yang
ditugaskan nilai 1; angka meningkat saat mereka pergi hilir. Dasar sebelum startpoint yang diberi
nomor -1, dan angka negatif meningkat kearah hulu. (Tidak ada dasar yang menetapkan angka
0.)
Produk langsung dari transkripsi disebut transkrip primer. Ini terdiri dari RNA
memanjang dari promoter ke terminator dan memiliki keaslian yaitu 5 'dan 3'. Transkrip primer,
hampir selalu tidak stabil. Pada prokariota, dengan cepat terdegradasi (mRNA) atau dibelah
untuk memberikan produk dewasa (rRNA dan tRNA). Pada eukariota, hal itu diubah pada ujungujung (mRNA) dan/atau dibelah untuk memberikan produk dewasa (semua RNA).
Transkripsi adalah tahap pertama dalam ekspresi gen dan langkah utama di mana ia
dikendalikan. Protein regulator menentukan apakah gen tertentu yang tersedia untuk disalin oleh
RNA polimerase. Langkah awal dalam peraturan adalah keputusan tentang apakah iya atau tidak
untuk mentranskrip gen. Kebanyakan peristiwa regulasi terjadi pada inisiasi transkripsi,
meskipun tahap berikutnya dalam transkripsi (atau tahap lain dari ekspresi gen) kadang-kadang
diatur.
Dalam konteks ini, ada dua pertanyaan mendasar dalam ekspresi gen:
Bagaimana RNA polimerase menemukan promotor pada DNA? Ini adalah contoh khusus dari
pertanyaan yang lebih umum: Bagaimana protein membedakan tempat untuk mengikat
spesifik dalam DNA dari urutan lain?
Bagaimana protein regulator berinteraksi dengan RNA polimerase (dan dengan satu sama lain)
untuk mengaktifkan atau menekan langkah-langkah spesifik dalam inisiasi, elongasi, atau
penghentian transkripsi?
Transkripsi Terjadi oleh Basis pasangan dalam "bubble" DNA Berpasangan
Konsep kunci:

RNA polimerase memisahkan dua helai DNA dalam "bubble sementara dan menggunakan
satu untai sebagai template untuk sintesis langsung dari urutan komplementer RNA.
Panjang gelembung tersebut -12 sampai 14 bp, dan panjang hibrida RNA-DNA di dalamnya
adalah -8 sampai 9 bp.

Transkripsi berlangsung dengan proses biasa pasangan basa komplementer. Gambar 11.3
mengilustrasikan prinsip umum transkripsi. Sintesis RNA berlangsung dalam "bubble
transkripsi," di mana DNA transien dipisahkan menjadi untai tunggal dan untai cetakan yang
digunakan untuk mengarahkan sintesis untai RNA.

Gambar 11.3 DNA strands terpisah dari bentuk bubble transkripsi.

Rantai RNA disintesis dari 5 'berakhir ke arah ujung 3'. 3'-OH kelompok nukleotida
terakhir ditambahkan ke rantai bereaksi dengan masuk nucleoside 5'-trifosfat. Nukleotida masuk
kehilangan dua kelompok fosfat terminal ( dan ); Contohnya kelompok yang digunakan dalam
ikatan fosfodiester menghubungkan ke rantai. Laju reaksi keseluruhan adalah -40 nukleotida /
detik pada 37 C (untuk RNA polimerase bakteri); ini hampir sama dengan tingkat terjemahan
(15 asam amino/detik), tetapi jauh lebih lambat dibandingkan laju replikasi DNA (800 bp /
detik).
RNA polimerase menciptakan gelembung transkripsi ketika mengikat promotor. Gambar
11.4 menunjukkan bahwa RNA polimerase bergerak sepanjang DNA, bubble bergerak dengan itu
dan rantai RNA tumbuh lagi. Proses dasar pasangan dan penambahan basa dalam gelembung
dikatalisis dan diteliti oleh enzim.

Gambar 11.4 Transkripsi terjadi dalam bubble, yang mana RNA disintesis oeh basis pasangan
dengan satu strand DNA dalam daerah pelepasan sementara.

Struktur dari bubble dalam RNA polimerase ditampilkan dalam tampilan dijelaskan pada
Gambar 11.5. Sebagai RNA polimerase bergerak sepanjang template DNA dan duplex terurai di
depan bubble (titik penguraian), dan menggulung DNA di belakang (titik rewinding). Panjang
gelembung transkripsi adalah -12 sampai 14 bp, tapi panjang dari wilayah hibrida RNA-DNA di
dalamnya lebih pendek.

Gambar 11.5 Selama transkripsi, bubble dipertahankan dengan RNA polymerase bakteri, yang
mana penguraian dan rewinds DNA dan sintesis RNA.

Ada perubahan besar dalam topologi dari DNA memperpanjang lebih dari ~1, tetapi tidak
jelas berapa banyak dari daerah ini sebenarnya mendasarkan dipasangkan dengan RNA pada saat
tertentu. Hibrida RNA-DNA pendek dan sementara. Enzim bergerak, reformasi duplex DNA,
dan RNA yang dipindahkan sebagai rantai polinukleotida. Kira-kira dua puluh lima
ribonucleotides ditambahkan ke rantai perkembangan yang kompleks dengan DNA dan/atau
enzim setiap saat.

Reaksi Transkripsi Memiliki Tiga Tahapan

Konsep kunci:
RNA polimerase memulai transkripsi setelah mengikat ke tempat promotor pada DNA.
Selama elongasi bergerak sepanjang bublle transkripsi DNA dan rantai RNA diperpanjang di
arah 5'-3.
Ketika transkripsi berhenti, reformasi duplek DNA dan RNA polimerase memisahkan di situs
terminator.
Reaksi transkripsi dapat dibagi menjadi tahap diilustrasikan dalam Gambar 11 6, di mana
gelembung yang dibuat, sintesis RNA dimulai, bubble bergerak di sepanjang DNA, dan akhirnya
bubble diakhiri:

Gambar 11.6. 4 Tahapan Transkripsi

Pengenalan Template dimulai dengan pengikatan RNA polimerase DNA beruntai ganda di
promotor untuk membentuk "kompleks tertutup". Untaian DNA yang kemudian dipisahkan
untuk membentuk "kompleks terbuka" yang membuat untai cetakan yang tersedia untuk basis
pasangan dengan ribonukleotida. Bubble transkripsi dibuat oleh penguraian lokal yang
dimulai di lokasi terikat oleh RNA polimerase.

Inisiasi menggambarkan sintesis obligasi nukleotida pertama dalam RNA. Enzim tetap pada
promotor sementara itu mensintesis obligasi pertama -9 nukleotida. Tahap inisiasi
berkepanjangan dengan terjadinya peristiwa yang gagal, di mana enzim membuat transkrip
pendek, melepaskan mereka, dan kemudian mulai sintesis RNA lagi. Tahap inisiasi berakhir
ketika enzim berhasil memperluas rantai dan membersihkan promotor. Urutan DNA yang
diperlukan untuk RNA polimerase untuk berikatan dengan template dan mencapai reaksi
inisiasi mendefinisikan promotor. Inisiasi abortif mungkin melibatkan sintesis rantai RNA itu
mengisi tempat aktif. Jika RNA dilepaskan, inisiasi ini dibatalkan dan harus mulai lagi.
Inisiasi dicapai jika dan ketika enzim berhasil bergerak sepanjang template untuk
memindahkan daerah berikutnya DNA ke dalam situs aktif.
Selama perpanjangan enzim bergerak sepanjang DNA dan memperluas rantai RNA tumbuh.
Sebagai bergerak enzim, itu terurai helix DNA untuk membuka segmen baru dari template
dalam kondisi beruntai tunggal. Nukleotida kovalen ditambahkan ke ujung 3' perkembangan
rantai RNA, membentuk hibrida RNA-DNA diuraikan . Di balik wilayah dibatalkan,
pasangan untai cetakan DNA dengan pasangan aslinya untuk mereformasi helix ganda. RNA
muncul sebagai untai tunggal bebas. Pemanjangan melibatkan gerakan tersebut yang
gelembung transkripsi oleh gangguan struktur DNA, di mana untai cetakan daerah secara
sementara dibatalkan dipasangkan dengan RNA baru lahir pada titik tumbuh.
Penghentian melibatkan pengenalan titik di mana tidak ada basis lebih lanjut harus
ditambahkan ke rantai. Untuk mengakhiri transkripsi, pembentukan ikatan fosfodiester harus
berhenti, dan kompleks transkripsi harus datang terpisah. Ketika basis terakhir ditambahkan
ke rantai RNA, gagasan transkripsi runtuh sebagai hibrida RNA-DNA terganggu, reformasi
DNA dalam keadaan duplex, dan enzim dan RNA keduanya dirilis. Urutan DNA yang
diperlukan untuk reaksi ini mendefinisikan terminator.

Pandangan tradisional elongasi adalah proses monoton, di mana enzim bergerak maju 1
bp sepanjang DNA untuk setiap nukleotida ditambahkan ke rantai RNA. Perubahan pola ini
terjadi pada keadaan tertentu, khususnya ketika RA polimerase berhenti. Salah satu jenis pola
adalah untuk "front end" enzim untuk tetap diam sementara "back end" terus bergerak, sehingga
menekan jejak di DNA. Setelah pergerakan beberapa pasangan basa, "front end" dilepaskan,
memulihkan jejak panjang penuh. Hal ini memunculkan "inch worm" model transkripsi, di mana
enzim hasil terputus-putus, alternatif menekan dan melepaskan jejak DNA. Mungkin,
bagaimanapun, menjadi kasus bahwa peristiwa ini menggambarkan situasi menyimpang daripada
transkripsi normal.
Fag T7 RNA Polymerase Adalah Sistem Model yang berguna
Konsep kunci:

13 dan T7 fag RNA polimerase adalah polipeptida tunggal dengan kegiatan minimal dalam
mengenali sejumlah kecil promotor fag.

Struktur kristal dari T7 RNA polimerase dengan DNA mengidentifikasi wilayah DNAmengikat dan tempat aktif.

Keberadaan RNA polimerase yang sangat kecil, yang terdiri dari rantai polipeptida
tunggal kode oleh fag tertentu, memberikan beberapa ide tentang "minimal" aparatus yang
diperlukan untuk transkripsi. Polimerase RNA ini mengenal hanya beberapa promotor pada fag
DNA, dan mereka tidak memiliki kemampuan untuk mengubah set promotor yang merespon.
Mereka menyediakan sistem model sederhana untuk karakteristik pengikatan RNA polimerase
DNA dan reaksi inisiasi.
Kode RNA Polimerase oleh terkait fag T3 dan T7 adalah rantai polipeptida tunggal
masing-masing <100 kD. Mereka mensintesis RNA dengan tarif -200 nukleotida/detik pada suhu
37 C, tingkat yang lebih cepat daripada bakteri RNA polimerase.
T7 RNA polimerase yang homolog dengan polimerase DNA dan memiliki struktur yang
sama, di mana DNA terletak pada "palm" yang dikelilingi oleh "jari" dan "ibu jari" (lihat Gambar
18.7). Kami sekarang memiliki pandangan langsung dari situs aktif dari struktur kristal
polimerase RNA fag T7 yang terlibat dalam transkripsi.
T7 RNA polimerase mengenal urutan target di DNA dengan mengikat pangkalan di alur
utama di posisi hulu dari startpoint, seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 11.7. Enzim
menggunakan spesifisitas lingkaran yang dibentuk oleh pita . Fitur ini unik untuk polimerase
RNA (tidak ditemukan dalam polimerase DNA). Titik umum dengan semua polimerase RNA
adalah bahwa enzim mengakui basa tertentu pada DNA yang hulu dari urutan yang ditranskrip.

Gambar 11.7. T7 RNA polymerase mempunyai spesifik loop yang mengikat posisi -7 sampai 11 dari
promoter saat posisi -1 sampai 14 masuk tempat aktif

Ketika memulai transkripsi, konformasi enzim pada dasarnya tetap sama, sementara
beberapa nukleotida ditambahkan, dan template untai ditranskripsi adalah " scrunched " dalam
tempat aktif. Tempat aktif dapat memegang transkrip enam sampai sembilan nukleotida. Transisi
dari inisiasi ke perpanjangan didefinisikan sebagai titik ketika enzim mulai bergerak sepanjang
DNA. Hal ini terjadi ketika transkrip baru melampaui tempat aktif dan berinteraksi dengan
kekhususan lingkaran. RNA muncul ke permukaan enzim ketika nukleotida telah disintesis.
Fitur-fitur ini mirip dengan yang ditampilkan oleh bakteri RNA polimerase.

Sebuah Model untuk Gerakan Enzim Apakah Disarankan oleh Struktur Kristal
Konsep kunci:

DNA bergerak melalui alur dalam ragi RNA polimerase yang membuat belokan tajam di sisi
aktif.
Protein perubahan konformasi jembatan untuk mengontrol masuknya nukleotida ke situs aktif.
Bakteri RNA polimerase memiliki dimensi keseluruhan -90x95 x160 ; eukariotik RNA
polimerase lebih besar tapi kurang memanjang. Analisis struktur menunjukkan berbagi jenis
umum dari struktur, di mana ada "saluran" atau alur pada permukaan -25 lebar yang bisa
menjadi jalan untuk DNA. Contoh dari saluran ini di bakteri RNA polimerase diilustrasikan pada
Gambar 11.8. Panjang alur bisa menahan 16 bp dalam enzim bakteri, dan -25 bp enzim
eukariotik, namun ini hanya mewakili sebagian dari total panjang DNA terikat selama
transkripsi. Permukaan enzim sebagian besar bermuatan negatif, tapi alur dipagari dengan
muatan positif, memungkinkan untuk berinteraksi dengan gugus fosfat bermuatan negatif dari
DNA.

Gambar 11.8 Subunit (abu-abu) dan (pink) dari RNA polymerase mempunyai channel dari
template DNA.

Enzim ragi adalah struktur besar dengan dua belas subunit. Sepuluh subunit dari ragi
RNA polimerase II telah terletak pada struktur kristal, seperti yang ditunjukkan pada Gambar
11.9. Situs katalitik dibentuk oleh celah antara dua subunit besar (# 1 dan # 2), yang memahami
DNA hilir "jaws" karena memasuki RNA polimerase. Subunit 4 dan 7 hilang dari struktur ini;
mereka membentuk subkomplek yang memisahkan dari enzim lengkap. Struktur ini umumnya
mirip dengan bakteri RNA polimerase. Hal ini dapat dilihat lebih jelas dalam struktur kristal
Gambar 11.10. RNA polimerase mengelilingi DNA, seperti yang terlihat dalam pandangan
GAMBAR 11.11. Sebuah ion Mg2+ katalitik ditemukan di situs aktif. DNA dijepit dalam posisi di

situs aktif dengan subunit 1, 2, dan 6. Gambar 11.12 menunjukkan bahwa DNA dipaksa untuk
mengambil giliran di pintu masuk ke situs karena dinding yang berdekatan dari protein. Panjang
hibrida RNA dibatasi oleh obstruksi protein lain, yang disebut kemudi. Nukleotida mungkin
masuk ke situs aktif dari bawah, melalui pori-pori melalui struktur.

Gambar 11.9. 10 subunit dari RNA

polymerase terletak dalam posisi dari
struktur kristal

Gambar 11.11 Gambaran akhir dari

struktur Kristal dari RNA polymerase
II

Gambar 11.10 Gambaran dari

struktur Kristal dari RNA polymerase
II dari ragi

Gambar 11.12 Perubahan DNA pada

tempat aktif

Pandangan lebih luas dari tempat aktif dalam Gambar 11.13 menunjukkan bahwa bubble
transkripsi meliputi 9 bp DNA-RNA hybrid. Dimana DNA mengambil gilirannya, basis hilir
membalik keluar dari heliks DNA. Sebagai enzim bergerak sepanjang DNA, dasar dalam untai
cetakan pada awal pergantian akan membalik menghadapi situs entri nukleotida. 5/ akhir RNA
dipaksa untuk meninggalkan DNA ketika menyentuh kemudi protein (lihat Gambar 11.12).

Gambar 11.13 Pandangan lebih luas dari tempat aktif

Setelah DNA dicampur, helai individu memiliki struktur yang fleksibel dalam bubble
transkripsi. Hal ini memungkinkan DNA untuk mengambil giliran di tempat aktif. Sebelum
transkripsi dimulai, meskipun, helix ganda DNA adalah struktur lurus yang relatif kaku.
Bagaimana struktur ini masuk polimerase tanpa diblokir oleh dinding? Jawabannya adalah
bahwa pergeseran konformasi besar harus terjadi pada enzim. Berdekatan dengan dinding adalah
penjepit. Dalam bentuk bebas dari RNA polimerase, penjepit ini ayunan dari dinding untuk
memungkinkan DNA untuk mengikuti jalan lurus melalui enzim. Setelah DNA telah mencampur
untuk membuat bubble transkripsi, clamp harus diayunan kembali ke posisi dinding.
Salah satu dilema setiap polimerase asam nukleat adalah bahwa enzim harus membuat
kontak erat dengan substrat asam nukleat dan produk, tetapi harus istirahat kontak dan membuat
lagi mereka dengan setiap siklus penambahan nukleotida. Mempertimbangkan situasi yang
digambarkan dalam Gambar 11.14. Sebuah polimerase membuat serangkaian kontak tertentu
dengan basis pada posisi tertentu. Misalnya, kontak "1" dibuat dengan basis pada akhir rantai dan
kontak tumbuh "2" dibuat dengan basis di untai template yang melengkapi basis berikutnya yang
akan ditambahkan. Namun, perlu diketahui bahwa dasar yang menempati lokasi tersebut dalam
rantai asam nukleat berubah setiap kali nukleotida ditambahkan!

Gambar 11.14 Perpindahan dari polymerase asam nukleat

Panel atas dan bawah gambar menunjukkan situasi yang sama: basa akan segera
ditambahkan ke rantai tumbuh. Perbedaannya adalah bahwa rantai tumbuh telah diperpanjang
oleh salah satu dasar dalam panel bawah. Geometri dari kedua kompleks persis sama, tapi kontak
"1" dan "2" di panel bawah yang dibuat untuk pangkalan di rantai asam nukleat yang terletak
satu posisi jauh di sepanjang rantai. Panel tengah menunjukkan bahwa ini harus berarti bahwa,
setelah dasar ditambahkan, dan sebelum enzim bergerak relatif terhadap asam nukleat, kontak
dibuat untuk posisi tertentu harus rusak sehingga mereka dapat dibuat lagi ke pangkalan yang
menempati posisi tersebut setelah gerakan.
Struktur RNA polimerase menunjukkan wawasan bagaimana enzim mempertahankan
kontak dengan substrat sementara melanggar dan memperbaharui ikatan. Struktur dalam protein
yang disebut jembatan berdekatan dengan situs aktif (lihat Gambar 11.12). Fitur ini ditemukan di
kedua enzim bakteri dan ragi, tetapi memiliki bentuk yang berbeda dalam struktur kristal yang
berbeda. Dalam satu itu membungkuk, dan yang lain itu lurus. GAMBAR 11.15 menunjukkan
bahwa perubahan konformasi struktur jembatan berkaitan erat dengan translokasi enzim
sepanjang asam nukleat.

Gambar 11.15 Elongasi RNA polimerase

Pada awal siklus translokasi, jembatan memiliki konformasi langsung berdekatan dengan
situs entri nukleotida. Hal ini memungkinkan nukleotida berikutnya untuk mengikat di tempat
entri nukleotida. Jembatan ini berhubungan dengan nukleotida yang baru ditambahkan. Protein
kemudian bergerak satu pasangan basa sepanjang substrat. Perubahan konformasi jembatan,
mebelok untuk menjaga kontak dengan nukleotida yang baru ditambahkan. Dalam konformasi
ini, jembatan mengaburkan situs entri nukleotida. Untuk mengakhiri siklus, kembali jembatan
untuk konformasi lurus, memungkinkan akses lagi ke situs entri nukleotida. Bertindak sebagai
jembatan ratchet yang melepaskan untai DNA dan RNA untuk translokasi sambil berpegangan
pada ujung rantai tumbuh.
Bakteri RNA Polymerase Terdiri dari Beberapa Subunit
Konsep-konsep kunci:
RNA polimerase bakteri inti -500 kompleks multisubunit kD dengan struktur umum 2 '
DNA terikat dalam saluran dan dihubungi oleh kedua dan subunit '.
RNA polimerase terbaik adalah RNA polimerase dari Eubacteria, untuk Escherichia coli
merupakan kasus yang khas. Satu jenis RNA polimerase tampaknya bertanggung jawab untuk
hampir semua sintesis mRNA, dan semua rRNA dan tRNA, dalam Eubacterium. Sekitar 7000

molekul RNA polimerase yang hadir dalam sel E. coli. Banyak dari mereka yang terlibat dalam
transkripsi; mungkin 2000-5000 enzim sintesis RNA pada saat orang, dengan jumlah tergantung
pada kondisi pertumbuhan.
Enzim lengkap atau holoenzyme di E. coli memiliki berat molekul ~ 465 kD. Komposisi
subunit yang diringkas dalam Gambar 11.16.

Gambar 11.16 Eubacterial RNA polymerase mempunyai 4 tipe subunit

Subunit dan 'bersama-sama membentuk pusat katalitik. Urutannya terkait dengan

subunit terbesar RNA polimerase eukariot, menunjukkan bahwa ada fitur umum untuk tindakan
semua polimerase RNA. subunit dapat lintas terkait dengan DNA template yang, RNA produk,
dan ribonucleotides substrat; mutasi pada rpo mempengaruhi semua tahapan transkripsi. Mutasi
pada rpoC menunjukkan bahwa 'juga terlibat pada semua tahap.
Subunit diperlukan untuk perakitan enzim inti. Ketika fag T4 menginfeksi E. coli,
subunit dimodifikasi oleh ADP-ribosylation dari arginin. Modifikasi dikaitkan dengan afinitas
dikurangi untuk promotor yang sebelumnya diakui oleh holoenzyme, menunjukkan bahwa
subunit berperan dalam pengakuan promotor. Subunit juga berperan dalam interaksi RNA
polimerase dengan beberapa faktor regulasi.
Subunit berkaitan khusus dengan pengenalan promoter (lihat Bagian 11.17, RNA
Polymerase Terdiri dari Core Enzim dan Sigma Factor). Struktur kristal enzim bakteri (lihat
Gambar 11.8) menunjukkan bahwa saluran untuk DNA terletak pada antarmuka dari dan
subunit '. DNA tersebut diuraikan pada tempat aktif, di mana rantai RNA sedang disintesis.
Percobaan silang mengidentifikasi titik-titik di mana subunit RNA polimerase menghubungi
DNA. Ini diringkas dalam Gambar 11.17. The dan 'subunit DNA kontak di banyak titik hilir
lokasi aktif. Mereka membuat beberapa kontak dengan coding strand di wilayah gelembung
transkripsi, sehingga menstabilkan alur tunggal terpisah. RNA yang dihubungi sebagian besar di
wilayah bubble transkripsi.

Gambar 11.17 Kedua template dan coding strand dari DNA dihubungkan oleh subunit dan

Obat rifampisin (anggota dari rifamycin antibiotik keluarga) blok transkripsi oleh RNA
polimerase bakteri. Ini adalah obat utama yang digunakan terhadap TBC. Struktur kristal RNA
polimerase terikat rifampisin menjelaskan aksinya: ia mengikat di dalam saku dari subunit ,> 12
jauh dari situs aktif, tapi dalam posisi di mana blok jalur RNA elongating. Dengan mencegah
perpanjangan rantai RNA melebihi 2-3 nukleotida, blok transkripsi ini.
Awalnya didefinisikan hanya dengan kemampuannya untuk menggabungkan nukleotida
dalam RNA di bawah arahan template DNA, RNA polimerase enzim sekarang dipandang
sebagai bagian dari aparat yang lebih kompleks yang terlibat dalam transkripsi. Kemampuan
untuk mengkatalisasi sintesis RNA mendefinisikan komponen minimum yang dapat
digambarkan sebagai RNA polimerase. Ini mengawasi pasangan dasar ribonucleotides substrat
dengan DNA dan mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara mereka.
E. coli RNA polymerase can transcribe any one of many (> 1000) transcription units.
The enzyme therefore requires the ability to interact with a variety of host and phage functions
that modify its intrinsic transcriptional activities. The complexity of the enzyme therefore, at
least in part, reflects its need to interact with regu1atory factors, rather than any demand
inherent in its catalytic activity.
E. coli RNA polimerase dapat menuliskan salah satu dari banyak (> 1000) unit
transkripsi. Enzim karena itu memerlukan kemampuan untuk berinteraksi dengan berbagai host
dan fag fungsi yang memodifikasi kegiatan transkripsi intrinsik. Kompleksitas enzim karena itu,
setidaknya sebagian, mencerminkan kebutuhan untuk berinteraksi dengan faktor pengartur,
bukan karena permintaan yang melekat dalam aktivitas katalitik.
RNA Polymerase Terdiri dari Core Enzim dan Sigma Factor
Konsep-konsep kunci
Bakteri RNA polimerase dapat dibagi menjadi enzim inti 2 'yang mengkatalisis transkripsi
dan sigma subunit yang diperlukan hanya untuk inisiasi.
Faktor Sigma mengubah sifat DNA-pengikatan RNA polimerase sehingga afinitas untuk DNA
umumnya berkurang dan afinitas untuk promotor meningkat.
Konstanta pengikatan RNA polimerase untuk promotor yang berbeda bervariasi lebih dari enam
kali lipat, sesuai dengan frekuensi yang transkripsi dimulai pada setiap promotor.

Holoenzim (2') dapat dipisahkan menjadi dua komponen, enzim inti (2 ') dan
faktor sigma (polipeptida ). Hanya holoenzyme dapat memulai transkripsi. Faktor Sigma
memastikan bahwa bakteri RNA polimerase mengikat secara stabil untuk DNA hanya pada
promotor. Sigma "Faktor" biasanya dilepaskan ketika rantai RNA mencapai delapan sampai
sembilan basis, meninggalkan enzim inti untuk melakukan perpanjangan. Enzim inti memiliki
kemampuan untuk mensintesis RNA pada template DNA, tetapi tidak dapat melakukan
transkripsi di tempat yang tepat.
Enzim inti memiliki afinitas umum untuk DNA, di mana daya tarik elektrostatik antara
protein dasar dan asam nukleat asam memainkan peran utama. Setiap (random) urutan DNA
yang terikat oleh inti polimerase reaksi mengikat umum ini digambarkan sebagai situs mengikat
longgar. Tidak ada perubahan terjadi dalam DNA, yang tetap dupleks. Kompleks di situs tersebut
stabil, dengan waktu paruh untuk pemisahan enzim dari DNA -60 menit. Enzim inti tidak
membedakan antara promotor dan urutan lainnya DNA.
Gambar 11.18 menunjukkan bahwa faktor sigma memperkenalkan perubahan besar
dalam afinitas RNA polimerase DNA. Holoenzim memiliki kemampuan berkurang drastis untuk
mengenali situs mengikat longgar yaitu, mengikat setiap urutan umum DNA. Asosiasi konstan
untuk reaksi berkurang dengan faktor -104, dan kompleks half-life adalah <1 detik. Jadi faktor
sigma mendestabilkan umum kemampuan mengikat sangat jauh.

Gambar 11.18 Core enzim mengikat indiskriminasi untuk DNA

Perhatikan bahwa faktor sigma juga menganugerahkan kemampuan untuk mengenali

situs mengikat tertentu. Holoenzime yang mengikat promotor yang sangat erat, dengan asosiasi
konstan meningkat dari yang enzim inti dengan (rata-rata) 1000 kali dan dengan waktu paruh
beberapa jam.
Kekhasan holoenzime untuk promotor dibandingkan dengan urutan lain adalah -107, tapi
ini hanya rata-rata karena ada variasi yang luas dalam tingkat di mana holoenzime yang

mengikat urutan promotor yang berbeda. Ini merupakan parameter penting dalam menentukan
efisiensi promotor individu dalam memulai transkripsi. Konstanta mengikat berkisar dari -1012
sampai -106. Faktor-faktor lain juga mempengaruhi frekuensi inisiasi, yang bervariasi dari -1 /
sec (rRNAgenes) ke -1 / 30 menit (lacIpromoter).
Asosiasi dengan Sigma Faktor Perubahan di Inisiasi
Konsep-konsep kunci
Ketika RNA polimerase mengikat promotor, memisahkan untaian DNA untuk membentuk
gelembung transkripsi dan menggabungkan hingga sembilan nukleotida dalam RNA.
Mungkin ada siklus inisiasi yang gagal sebelum enzim bergerak ke tahap berikutnya.
Faktor Sigma dapat dilepaskan dari RNA polymerase ketika rantai RNA yang baru lahir
mencapai delapan sampai sembilan basis panjang.
Reaksi inisiasi dapat digambarkan oleh parameter yang dirangkum dalam Gambar 11.19:
Reaksi holoenzim-promotor dimulai dengan membentuk kompleks biner tertutup. "Closed"
berarti bahwa DNA tetap dupleks. Pembentukan kompleks biner tertutup reversibel; sehingga
biasanya digambarkan oleh konstanta kesetimbangan (K B). Ada berbagai nilai dari konstanta
kesetimbangan untuk membentuk kompleks tertutup.
The tertutup kompleks diubah menjadi sebuah kompleks terbuka dengan "mencampur" dari
wilayah pendek DNA dalam urutan terikat oleh enzim. Rangkaian kejadian yang
menyebabkan pembentukan kompleks terbuka disebut ketat mengikat. Untuk promotor yang
kuat, konversi menjadi sebuah kompleks biner terbuka tidak dapat diubah, sehingga reaksi ini
dijelaskan oleh konstanta laju (k2). Reaksi ini cepat. Faktor Sigma terlibat dalam reaksi
peleburan (lihat Bagian 11.16, Substitusi Sigma Faktor Mungkin Kontrol Inisiasi).
Langkah berikutnya adalah untuk menggabungkan dua pertama nukleotida; ikatan fosfodiester
kemudian membentuk antara mereka. Ini menghasilkan kompleks terner yang berisi RNA
serta DNA dan enzim. Pembentukan kompleks terner dijelaskan oleh tingkat ki konstan; ini
bahkan lebih cepat daripada laju k2 konstan. Nukleotida lebih lanjut dapat ditambahkan
tanpa gerakan enzim untuk menghasilkan rantai RNA hingga sembilan basis. Setelah masingmasing basis ditambahkan, ada kemungkinan tertentu yang enzim akan melepaskan rantai.
Ini terdiri dari inisiasi yang gagal, setelah itu enzim dimulai lagi dengan base pertama.
Sebuah siklus inisiasi abortif biasanya terjadi untuk menghasilkan serangkaian
oligonukleotida yang sangat singkat.
Ketika inisiasi berhasil, sigma tidak lagi diperlukan, dan enzim membuat transisi ke
perpanjangan kompleks terner inti RNA polimerase-DNA baru lahir. Parameter penting di
sini adalah berapa lama waktu yang dibutuhkan untuk polimerase untuk meninggalkan
promoter sehingga polymerase lain dapat memulai. Parameter ini adalah waktu izin
promotor; nilai minimum dari 1-2 detik menetapkan frekuensi maksimum inisiasi sebagai <1
acara per detik. Enzim kemudian bergerak sepanjang template, dan rantai RNA melampaui
sepuluh basis.

 Ketika RNA polimerase mengikat DNA, dimensi elongasi protein terbentang sepanjang DNA,
tetapi beberapa perubahan menarik dalam bentuk terjadi selama transkripsi. Transisi dalam
bentuk dan ukuran mengidentifikasi tiga bentuk kompleks, seperti digambarkan pada Gambar
11.20:
Ketika RNA polimerase holoenzim awalnya mengikat DNA, mencakup beberapa 75 sampai 80
bp, membentang dari-55-20. (Dimensi panjang RNA polimerase (160 A) bisa menutupi -50 bp
DNA dalam bentuk diperpanjang, yang menyiratkan bahwa pengikatan bentangan panjang
DNA harus melibatkan beberapa lentur dari asam nukleat.)
Bentuk perubahan RNA polimerase pada transisi dari inisiasi untuk elongasi. Hal ini terkait
dengan hilangnya kontak di - 55 sampai -35 wilayah, hanya menyisakan -60 bp DNA ditutupi
oleh enzim. Hal ini sesuai dengan konsep bahwa bagian yang lebih hulu promotor yang
terlibat dalam pengakuan awal oleh RA polimerase, tetapi tidak diperlukan untuk tahap
selanjutnya dari inisiasi (lihat Bagian 11.13, Promotor Effidencies Bisa ditambah atau
dikurangi dengan Mutasi).
Ketika rantai RNA meluas ke 15 sampai 20 basis, enzim membuat transisi lebih lanjut, untuk
membentuk kompleks yang melakukan perpanjangan; sekarang mencakup 30 sampai 40 bp
(tergantung di atas panggung dalam siklus elongasi).

Gambar 11.20 RNA polymerase menginisiasi hubungan daerah dari -11 ke +20

Ini telah menjadi prinsip transkripsi sejak lama setelah ditemukannya faktor sigma yang
dilepaskan setelah inisiasi. Ini mungkin tidak sepenuhnya benar. Pengukuran langsung
memanjangkan kompleks RNA polimerase menunjukkan bahwa -70% dari mereka
mempertahankan faktor sigma. Sepertiga dari elongating polimerase kekurangan sigma; maka

kesimpulan yang asli tentu benar bahwa tidak perlu untuk perpanjangan. Dalam kasus-kasus di
mana tetap berhubungan dengan enzim inti, sifat asosiasi telah hampir pasti berubah (lihat
Bagian 11,11, Sigma Factor Kontrol Binding DNA).
A Stalled RNA PoLymerase Can Restart
RNA polymerase must be able to handle situations when transcription is blocked. This
can happen, for example, when DNA is damaged. A model system for such situations is
provided by arresting elongation in vitro by omitting one of the necessary precursor nucleotides.
When the missing nucleotide is restored, the enzyme can overcome the block by cleaving the 3'
end of the RNA, to create a new 3' terminus for chain elongation. The cleavage involves
accessory factors in addition to the enzyme itself. In the case of E. coli RNA polymerase, the
proteins GreA and GreB release the RNA polymerase from elongation arrest. In eukaryotic
cells, RNA polymerase II requires an accessory factor (TFIlS), which enables the polymerase
to cleave a few ribonucleotides from the 3' terminus of the RNA product.
Terhentinya RNA polimerase Bisa Restart
RNA polimerase harus dapat menangani situasi ketika transkripsi diblokir. Hal ini dapat
terjadi, misalnya, ketika DNA rusak. Sebuah sistem model untuk situasi seperti itu disediakan
dengan menangkap perpanjangan in vitro dengan menghilangkan salah satu nukleotida prekursor
yang diperlukan. Ketika nukleotida yang hilang dikembalikan, enzim dapat mengatasi blok
dengan membelah 3 'akhir RNA, untuk membuat 3 baru' terminus untuk rantai perpanjangan.
Belahan dada yang melibatkan faktor-faktor aksesori selain enzim itu sendiri. Dalam kasus E.
coli RNA polimerase, protein grea dan GreB melepaskan polimerase RNA dari tahanan
perpanjangan. Pada sel eukariotik, RNA polimerase II membutuhkan faktor aksesori (TFIlS),
yang memungkinkan polimerase untuk membelah beberapa ribonucleotides dari ujung terminus
3 dari produk RNA.
Tempat katalitik RNA polimerase melakukan pembelahan yang sebenarnya dalam setiap
kasus. Peran GreB dan TFN adalah untuk mengubah situs katalitik enzim ke dalam tempat
ribonukleolitik. Meskipun tidak ada urutan homologi antara faktor, struktur kristal kompleks
mereka dengan polimerase RA masing-masing menunjukkan bahwa mereka berfungsi dengan
cara yang sama. Masing-masing faktor menyisipkan domain protein yang sempit (dalam satu
kasus seng pita, yang lain kumparan melingkar) jauh ke RNA polimerase, di mana ia berakhir
dalam situs katalitik. Domain yang dimasukkan posisi dua asam amino asam dekat dengan ion
magnesium katalitik utama dari situs aktif; ini memungkinkan pengenalan ion magnesium kedua,
yang mengubah situs katalitik ke tempat ribonukleolitik.
Alasan untuk reaksi ini mungkin bahwa mengulur-ulur menyebabkan template untuk
salah posisisi, sehingga terminal 3 tidak lagi terletak di sisi aktif. Pembelahan dan backtracking
diperlukan untuk menempatkan ujung di lokasi yang tepat untuk penambahan basa lanjut. RNA
polimerase memiliki fasilitas untuk bersantai dan mundur DNA, untuk memegang untaian

terpisah dari DNA dan RNA produk, untuk mengkatalisis penambahan pasang ribonucleo ke
rantai RNA tumbuh, dan untuk menyesuaikan kesulitan dalam maju dengan membelah produk
RNA dan sintesis RNA restart (dengan bantuan dari beberapa faktor aksesori).
Bagaimana Apakah RNA Polymerase Cari Promotor Urutan?
konsep-konsep kunci
Tingkat di mana RNA polimerase mengikat promotor terlalu cepat untuk dipertanggungjawabkan
oleh difusi acak.
RNA polimerase mungkin mengikat ke situs acak pada DNA dan pertukaran mereka dengan
urutan lain dengan sangat cepat sampai promotor ditemukan.
How is RNA polymerase distributed in the cell? A (somewhat speculative) picture of
the enzyme's situation is depicted in FIGURE 11.21:
Excess core enzyme exists largely as closed loose complexes because the enzyme
enters into them rapidly and leaves them slowly. There is very little, if any, free core enzyme.
There is enough sigma factor for about one third of the polymerases to exist as
holoenzymes, and they are distributed between loose complexes at nonspecific sites and binary
complexes (mostly closed) at promoters.
About half of the RNA polymerases consist
transcription.

of

core

enzymes

engaged in

How much holoenzyme is free? We do not know, but we suspect that the amount is
very small.
Bagaimana RNA polimerase didistribusikan dalam sel? A (agak spekulatif) gambar
situasi enzim digambarkan dalam Gambar 11.21:
enzim inti Kelebihan ada kompleks longgar sebagian besar sebagai ditutup karena enzim masuk
ke mereka dengan cepat dan membuat mereka perlahan-lahan. Ada sangat sedikit, jika ada,
enzim inti bebas.
Ada faktor sigma cukup untuk sekitar sepertiga dari polimerase untuk eksis sebagai
holoenzymes, dan mereka didistribusikan antara kompleks longgar di lokasi spesifik dan
kompleks biner (sebagian besar tertutup) pada promotor.
Sekitar setengah dari polimerase RNA terdiri dari enzim inti yang terlibat dalam transkripsi.
Berapa banyak holoenzyme gratis? Kita tidak tahu, tapi kami menduga bahwa jumlahnya sangat
kecil.

Gambar 11.21 Core enzim dan holoenzim

RNA polimerase harus menemukan promotor dalam konteks genom. Misalkan promotor
adalah hamparan -60 bp. Bagaimana itu dibedakan dari 4 x 106 bp yang terdiri dari E. coli
genom? Tiga angka berikutnya menggambarkan prinsip beberapa model mungkin.
Gambar 11.22 menunjukkan model sederhana untuk promotor yang mengikat, di mana
RNA polimerase bergerak dengan difusi acak. Holoenzim sangat cepat mengaitkan dengan, dan
memisahkan dari, longgar mengikat situs. Sehingga bisa terus membuat dan memecahkan
serangkaian kompleks tertutup sampai (kebetulan) itu pertemuan promotor, dan pengakuan dari
urutan tertentu akan memungkinkan ketat mengikat terjadi dengan pembentukan kompleks
terbuka.

Gambar 11.22 Kecepatan konstan dari RNA polymerase mengikat ke promoter lebih cepat dari
random difusi

Untuk RNA polimerase untuk berpindah dari satu situs mengikat DNA yang lain, itu
harus memisahkan dari situs pertama, menemukan situs kedua, dan kemudian bergaul dengan hal

itu. Gerakan dari satu situs ke situs lainnya dibatasi oleh kecepatan difusi melalui medium.
Difusi menetapkan batas atas untuk tingkat konstan untuk mengasosiasi dengan target 60 bp dari
<108 MI secl. Tingkat maju sebenarnya konstan untuk beberapa promotor in vitro, namun,
tampaknya menjadi -108 M-1 detik l, pada atau di atas batas difusi. Jika nilai ini berlaku in vivo,
waktu yang dibutuhkan untuk siklus acak asosiasi berturut-turut dan disosiasi di tempat longgar
mengikat terlalu besar untuk menjelaskan cara RNA polimerase menemukan promotornya.

Gambar 11.23 RNA polymerase mengikat sangat cepat ke Random urutan DNA dan dapat
ditemukan promoter yang langsung memindahkan ikatan urutan DNA

Jika ide ini benar, RNA polimerase bebas mengikat DNA dan kemudian tetap dalam
kontak dengan itu. Bagaimana enzim bergerak dari (longgar) situs pengikatan acak pada DNA
untuk promotor? Model yang paling mungkin adalah untuk menganggap bahwa urutan terikat
langsung tergeser oleh urutan lain. Setelah terus diambil dari DNA, bursa enzim urutan ini
dengan urutan lain sangat cepat dan terus bertukar urutan sampai promotor ditemukan.
Enzim kemudian membentuk stabil, kompleks terbuka, setelah inisiasi terjadi. Proses
pencarian menjadi lebih cepat karena asosiasi dan disosiasi yang hampir simultan dan waktu
tidak dihabiskan Komuter antara situs. Perpindahan langsung dapat memberikan "berjalan
terarah," di mana enzim bergerak istimewa dari situs lemah untuk situs yang lebih kuat.
Ide lain beranggapan bahwa enzim slide sepanjang DNA dengan acak berjalan satu
dimensi, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 11 24, yang dihentikan hanya ketika bertemu
promotor. Ada, bagaimanapun, tidak ada bukti bahwa RNA polimerase (atau protein DNA
mengikat lainnya) dapat berfungsi dengan cara ini.

Gambar 11.24 RNA polymerase tidak slide selama DNA

Sigma Factor Kontrol Mengikat DNA

Konsep kunci

Mengubah dalam hubungan antara faktor sigma dan perubahan holoenzim mengikat afinitas
untuk DNA sehingga enzim inti dapat bergerak sepanjang DNA.
RNA polimerase bertemu dilema dalam mendamaikan kebutuhan untuk inisiasi dengan
elongasi. Inisiasi membutuhkan ketat mengikat hanya untuk urutan tertentu (promotor),
sedangkan perpanjangan membutuhkan hubungan dekat dengan semua urutan yang enzim
pertemuan selama transkripsi. Gambar 11. 25 menggambarkan bagaimana dilema diselesaikan
oleh asosiasi reversibel antara faktor sigma dan enzim inti. Faktor sigma adalah baik dirilis
inisiasi berikut atau mengubah hubungannya dengan enzim inti sehingga tidak lagi berpartisipasi
dalam DNA mengikat. Ada molekul lebih sedikit daripada sigma enzim inti; sehingga
pemanfaatan enzim inti mengharuskan mendaur ulang sigma. Hal ini terjadi segera setelah
inisiasi (seperti yang ditunjukkan pada gambar) pada sekitar sepertiga dari kasus; mungkin sigma
dan inti memisahkan di beberapa titik kemudian dalam kasus lain.

Gambar 11.25 Faktor sigma dan ezim core mengembalikan pada point berpeda dalam transkripsi.

Terlepas dari waktu yang tepat dari rilis dari enzim inti, faktor sigma terlibat hanya dalam
inisiasi. Hal ini menjadi tidak perlu ketika inisiasi gagal disimpulkan dan sintesis RNA telah
berhasil dimulai. Kita tidak tahu apakah keadaan polimerase berubah sebagai konsekuensi dari
mengatasi inisiasi abortif, atau apakah melainkan adalah perubahan di negara itu berakhir inisiasi
abortif dan memungkinkan perpanjangan untuk memulai.
Ketika faktor sigma dilepaskan dari enzim inti, menjadi segera tersedia untuk digunakan
oleh enzim inti lain. Terlepas dari apakah faktor sigma dilepaskan atau tetap lebih longgar terkait
dengan enzim inti, enzim inti di kompleks terner terikat sangat erat pada DNA. Hal ini pada
dasarnya "terkunci" sampai perpanjangan telah selesai. Ketika transkripsi berakhir, enzim inti
dilepaskan. Hal ini kemudian "disimpan" dengan mengikat ke situs longgar pada DNA. Jika telah
kehilangan faktor sigma, ia harus menemukan faktor sigma lain untuk melakukan siklus lanjut
dari transkripsi.
Enzim inti memiliki afinitas intrinsik tinggi untuk DNA, yang meningkat dengan
kehadiran RNA yang baru lahir. Afinitas untuk situs mengikat longgar, bagaimanapun, terlalu
tinggi untuk memungkinkan enzim untuk membedakan promotor efisien dari urutan lain. Dengan

mengurangi stabilitas kompleks longgar, faktor sigma memungkinkan proses terjadi lebih cepat;
dan dengan menstabilkan asosiasi di situs ketat mengikat, faktor mendorong reaksi ireversibel ke
pembentukan kompleks terbuka. Ketika enzim melepaskan faktor sigma (atau mengubah
hubungannya dengan itu), itu akan beralih ke afinitas umum untuk semua DNA terlepas dari
urutan, yang sesuai untuk melanjutkan transkripsi.
Faktor Sigma memiliki domain yang mengenali DNA promotor. Sebagai polipeptida
independen, faktor sigma tidak mengikat DNA tetapi ketika holoenzim membentuk kompleks
ketat mengikat, kontak DNA di wilayah hulu titik awal. Perbedaan ini disebabkan oleh
perubahan dalam konformasi faktor sigma ketika mengikat enzim inti. Wilayah N-terminal faktor
sigma bebas menekan aktivitas wilayah DNAbinding; ketika sigma mengikat inti, hambatan ini
dilepaskan, dan menjadi mampu mengikat secara khusus untuk promotor urutan (lihat juga
Gambar 11. 35 dalam Bagian 11.17). Ketidakmampuan faktor sigma bebas untuk mengenali
urutan promotor mungkin penting: jika bisa mengikat secara bebas untuk promotor, mungkin
memblokir holoenzyme dari memulai transkripsi.
Pengenalan Promotor Tergantung pada Konsensus Urutan
Konsep-konsep kunci
promotor didefinisikan oleh kehadiran urutan konsensus singkat di lokasi tertentu.
Promotor urutan konsensus terdiri dari purin di startpoint itu, TATAAT heksamer berpusat di -10,
dan heksamer lain berpusat pada -35.
promotor individu biasanya berbeda dari konsensus pada satu atau lebih posisi.
Sebagai urutan DNA yang berfungsi untuk diakui oleh protein, promotor berbeda dari
urutan yang berperan untuk dicatat atau diterjemahkan. Informasi untuk fungsi promotor
disediakan langsung oleh urutan DNA: strukturnya adalah sinyal. Ini adalah exampIe klasik situs
cis-acting, seperti yang didefinisikan sebelumnya pada Gambar 2.16 dan Gambar 2.17.
Sebaliknya, menyatakan daerah memperoleh maknanya hanya setelah informasi tersebut
dipindahkan ke dalam bentuk beberapa asam nukleat atau protein.
Sebuah pertanyaan kunci dalam memeriksa interaksi antara polimerase RNA dan
promotor adalah bagaimana protein mengakui urutan promotor tertentu. Apakah enzim memiliki
situs aktif yang membedakan struktur kimia dari urutan tertentu basa dalam DNA helix ganda?
Bagaimana spesifik persyaratannya?
Salah satu cara untuk merancang sebuah promotor akan untuk urutan tertentu DNA yang
akan diakui oleh RNA polimerase. Setiap promotor akan terdiri dari, atau setidaknya meliputi,
urutan ini. Dalam genom bakteri, panjang minimum yang bisa memberikan sinyal yang memadai
adalah 12 bp. (Setiap urutan yang lebih pendek mungkin terjadi-hanya kebetulan-dalam jumlah
yang memadai kali tambahan untuk memberikan sinyal palsu. Panjang minimum yang
diperlukan untuk pengakuan meningkat unik dengan ukuran genom.) Urutan 12 bp tidak perlu
berdekatan. Jika jumlah tertentu pasangan basa memisahkan dua sekuens pendek konstan,

panjang gabungan mereka bisa kurang dari 12 bp, karena jarak pemisahan itu sendiri
memberikan bagian dari sinyal (bahkan jika urutan menengah itu sendiri tidak relevan).
Upaya untuk mengidentifikasi fitur dalam DNA yang diperlukan untuk RNA polimerase
mengikat dimulai dengan membandingkan urutan promotor yang berbeda. Setiap urutan
nukleotida penting harus hadir di semua promotor. Urutan Seperti dikatakan dilestarikan.
Namun, urutan dilestarikan tidak perlu di dilestarikan di setiap posisi tunggal; beberapa variasi
diperbolehkan.
Tempat yang diduga DNA pengenalan dapat didefinisikan dalam hal urutan ideal yang
mewakili basis paling sering hadir di eachposition. Urutan konsensus didefinisikan dengan
menyelaraskan semua contoh dikenal sehingga memaksimalkan homologi mereka. Untuk urutan
yang akan diterima sebagai konsensus, setiap basis tertentu harus cukup dominan pada posisinya,
dan sebagian besar contoh yang sebenarnya harus berhubungan dengan konsensus dengan hanya
satu atau dua pergantian pemain.
Fitur mencolok di urutan promotor dalam E. coli adalah kurangnya ofany konservasi
yang luas ofsequence selama 60 bp terkait dengan RNA polimerase. Urutan banyak situs
pengikatan tidak relevan. Beberapa peregangan pendek dalam promotor dilestarikan, namun, dan
mereka sangat penting untuk fungsinya. Konservasi urutan konsensus hanya sangat singkat
adalah fitur khas situs regulasi (seperti promotor) di kedua genom prokariotik dan eukariotik.
Ada empat (mungkin lima) dilestarikan fitur dalam promotor bakteri: startpoint, -10 urutan, yang
-35 urutan, pemisahan antara -10 dan -35 urutan, dan (kadang-kadang) elemen UP:

startpoint biasanya (> 90% dari waktu) purin a. Hal ini umum untuk th startpoint menjadi
basis utama dalam CAT urutan, namun konservasi triplet ini tidak cukup besar untuk
menganggapnya sebagai sinyal wajib.
Hanya hulu startpoint, suatu wilayah 6-bp dikenali di hampir semua promotor. Pusat
heksamer umumnya dekat dengan 10 bp hulu dari startpoint tersebut; jarak bervariasi
promotor diketahui dari posisi -18 hingga -9. Dinamakan untuk lokasi, heksamer yang sering
disebut -10 urutan. Konsensus adalah TATAAT dan dapat diringkas dalam bentuk
Tso A95 T45 A60 A50 T96

Dimana subscript yang menunjukkan terjadinya persen dari basis yang paling sering
ditemukan, yang bervariasi dari 45% menjadi 96%. (Posisi A di mana tidak ada preferensi dilihat
untuk dasar apapun akan ditunjukkan oleh N.) Jika frekuensi kejadian menunjukkan
kemungkinan penting dalam mengikat RNA polimerase, kita akan mengharapkan awal yang
sangat dilestarikan TA dan final hampir sepenuhnya dilestarikan T di -10 urutan menjadi basis
paling penting.
heksamer lain dilestarikan berpusat - 35 bp hulu dari startpoint tersebut. Ini disebut -35
urutan. Konsensus adalah ITGACA; dalam bentuk yang lebih rinci, konservasi adalah:

Jarak yang memisahkan -35 dan -10 situs adalah antara 16 dan 18 bp dalam 90% dari
promotor; dalam pengecualian, itu sesedikit 15 bp atau sama besar dengan 20 bp. Meskipun
urutan yang sebenarnya di wilayah intervensi tidak penting, jarak sangat penting dalam
memegang dua lokasi di tepat pemisahan atau polimerase geometri o / RNA.
Beberapa promotor memiliki urutan AT-kaya yang terletak lebih jauh ke hulu. Ini disebut
elemen UP. Berinteraksi dengan subunit dari RNA polimerase. Hal ini biasanya ditemukan
dalam promotor yang sangat dinyatakan, seperti promotor gen rRNA.
Promotor optimal adalah urutan yang terdiri dari -35 heksamer, dipisahkan oleh 17 bp dari
-10 heksamer, berbohong 7 bp hulu dari startpoint tersebut. Struktur promotor, menunjukkan
kisaran diizinkan variasi dari optimum ini, diilustrasikan dalam Gambar 11.26.

Gambar 11.26 Tipe promoter mempunyai 3 komponen terdiri dari consensus untaian dari -35, -10,
dan startpoint

Efisiensi promotor Bisa ditambah atau dikurangi dengan Mutasi

Konsep-konsep kunci

Mutasi Bawah untuk mengurangi efisiensi promotor biasanya menurunkan kesesuaian

dengan urutan konsensus, sedangkan up mutasi memiliki efek sebaliknya.

Mutasi pada -35 urutan biasanya mempengaruhi awal mengikat RNA polimerase.
Mutasi pada -10 urutan biasanya mempengaruhi reaksi peleburan yang mengubah tertutup ke
sebuah kompleks terbuka.

Mutasi adalah sumber utama informasi tentang fungsi promotor. Mutasi pada promotor
mempengaruhi tingkat ekspresi gen (s) mereka mengendalikan tanpa mengubah produk gen itu
sendiri. Kebanyakan diidentifikasi sebagai mutan bakteri yang telah hilang, atau sudah sangat
jauh berkurang, transkripsi gen yang berdekatan. Mereka dikenal sebagai bawah mutasi. Kurang
sering, mutan ditemukan di mana terjadi peningkatan transkripsi dari promotor. Mereka memiliki
hingga mutasi.
Penting untuk diingat bahwa mutasi "atas" dan "bawah" didefinisikan relatif terhadap
efisiensi biasa dengan mana fungsi promotor tertentu. Hal ini sangat bervariasi. Dengan
demikian perubahan yang diakui sebagai mutasi di satu promotor mungkin tidak pernah diisolasi
di tempat lain (yang pada tipe liar negaranya bisa lebih kurang efisien daripada bentuk mutan

dari promotor pertama). Informasi yang diperoleh dari studi in vivo hanya mengidentifikasi arah
keseluruhan dari perubahan yang disebabkan oleh mutasi.
Ini adalah promotor yang paling efektif yang memiliki urutan konsensus yang
sebenarnya? Harapan ini ditanggung oleh aturan sederhana yang up mutasi biasanya meningkat
homologi dengan salah satu urutan konsensus atau membawa jarak antara mereka lebih dekat
dengan 17 bp. Bawah mutasi biasanya menurunkan kemiripan situs baik dengan konsensus atau
membuat jarak antara mereka lebih jauh dari 17 bp. Mutasi cenderung terkonsentrasi menurun
di posisi yang paling sangat kekal, yang menegaskan penting sebagai penentu utama efisiensi
promotor. Namun demikian, pengecualian sesekali aturan ini.
Untuk menentukan efek mutlak mutasi promotor, kita harus mengukur afinitas RNA
polimerase untuk tipe liar dan promotor mutan in vitro. Ada -1 variasi OO kali lipat tingkat di
mana RNA polimerase mengikat promotor yang berbeda in vitro, yang berkorelasi dengan baik
dengan frekuensi transkripsi gen ketika mereka disajikan dalam vivo. Mengambil analisis ini
lebih lanjut, kita dapat menyelidiki tahap di mana mutasi mempengaruhi kapasitas promotor.
Apakah itu mengubah afinitas promotor untuk mengikat RNA polimerase? Apakah itu
meninggalkan enzim mampu mengikat tetapi tidak mampu memulai? Adalah pengaruh faktor
pendukung diubah?
Dengan mengukur konstanta kinetik untuk pembentukan kompleks tertutup dan konversi
ke sebuah kompleks terbuka, seperti yang didefinisikan pada Gambar 11.19, kita dapat
menginisiasi dua tahap reaksi inisiasi:

Bawah mutasi pada urutan -35 mengurangi tingkat pembentukan kompleks tertutup (mereka
mengurangi KB), tetapi mereka tidak menghambat konversi ke sebuah kompleks terbuka.
Bawah mutasi pada urutan -10 tidak mempengaruhi pembentukan awal kompleks tertutup,
tapi mereka memperlambat konversi ke bentuk terbuka (mereka mengurangi k2).

Hasil ini menunjukkan model yang ditampilkan dalam Gambar 11.27. Fungsi dari -35
urutan untuk memberikan sinyal untuk pengakuan oleh RNA polimerase, sedangkan -10 urutan
memungkinkan kompleks untuk mengkonversi dari tertutup untuk membuka formulir. Kita
mungkin melihat -35 urutan sebagai terdiri dari "domain pengakuan," sedangkan -10 urutan
terdiri dari " pelepasan domain " dari promotor.

Gambar 11.27 Urutan -35 digunakan untuk pengenalan awal dan urutan -10 digunakan untuk
mencampur reaksi yang mengkonvert menutup kompleks dan membuka kompleks

Urutan konsensus situs -10 terdiri eksklusif dari AT pasangan basa, konfigurasi yang
membantu pencairan awal DNA menjadi untai tunggal. Semakin rendah energi yang dibutuhkan
untuk mengganggu pasangan A- T dibandingkan dengan pasangan GC berarti hamparan
pasangan AT menuntut jumlah minimum energi untuk pemisahan untai.
Urutan segera di sekitar startpoint yang mempengaruhi acara inisiasi. Wilayah
ditranskripsikan awal (1-30) mempengaruhi tingkat di mana RNA polimerase membersihkan
promotor dan karena itu memiliki efek pada kekuatan promotor. Dengan demikian kekuatan
keseluruhan promotor tidak dapat diprediksi sepenuhnya dari -35 dan -10 urutan konsensus
tersebut.
"Tipikal" promotor bergantung pada -35 dan -10 nya urutan yang akan diakui oleh RNA
polimerase, tapi satu atau yang lain dari urutan ini bisa absen dari beberapa (biasa) promotor.
Dalam setidaknya beberapa kasus, promotor tidak dapat dikenali oleh polimerase RNA saja;
reaksi memerlukan protein tambahan, yang mengatasi kekurangan dalam interaksi intrinsik
antara RNA polimerase dan promotor.

RNA Polymerase Mengikat Satu Wajah DNA

Konsep-konsep kunci

Urutan konsensus pada -35 dan -10 menyediakan sebagian besar titik kontak untuk RNA
polimerase di promotor.
Titik-titik kontak terletak pada satu permukaan DNA.

Kemampuan RNA polimerase untuk mengenali DNA dapat dicirikan oleh footprinting.
Sebuah urutan DNA terikat protein yang dicerna sebagian dengan endonuklease untuk
menyerang ikatan fosfodiester individu dalam asam nukleat. Dalam kondisi yang tepat, setiap
ikatan fosfodiester tertentu rusak dalam beberapa, tapi tidak semua, molekul DNA. Posisi yang
dibelah diakui dengan menggunakan DNA berlabel pada satu untai di salah satu ujung saja.
Prinsipnya adalah sama seperti yang terlibat dalam sequencing DNA: pemecahan sebagian dari
akhir berlabel molekul pada situs rentan menciptakan fragmen panjang yang unik.
GAMBAR 11 8 menunjukkan, setelah pengobatan nuklease, fragmen DNA yang rusak
yang pulih dan dielektroforesis pada gel yang memisahkan mereka sesuai dengan panjangnya.
Setiap fragmen yang mempertahankan ujung berlabel menghasilkan band radioaktif. Posisi band
sesuai dengan jumlah pangkalan di fragmen. Fragmen terpendek bergerak tercepat, sehingga
jarak dari ujung berlabel dihitung dari dasar gel.

Gambar 11. 28 Identifikasi footprinting tempat ikatan DNA untuk protein pelindung melawan
dengan taktik

Dalam DNA bebas, setiap posisi obligasi rentan rusak dalam satu atau molekul lain.
Ketika DNA kompleks dengan protein, meskipun, daerah yang dicakup oleh protein DNAbinding dilindungi dalam setiap molekul. Dengan demikian dua reaksi dijalankan secara paralel:
kontrol DNA saja, dan campuran eksperimental yang mengandung molekul DNA terikat dengan
protein. Ketika blok protein terikat akses dari nuklease DNA, obligasi di urutan terikat gagal
dipatahkan dalam campuran eksperimental.

Pada kontrol, setiap ikatan rusak. Ini menghasilkan serangkaian band, dengan satu band
yang mewakili masing-masing basis. Ada tiga puluh satu band dalam gambar. Dalam fragmen
dilindungi, obligasi tidak dapat dibatalkan di wilayah terikat oleh protein, sehingga band-band
yang mewakili fragmen ukuran yang sesuai tidak dihasilkan. Tidak adanya band 9-18 pada
gambar mengidentifikasi situs pengikatan protein meliputi wilayah yang terletak 9-18 basis dari
ujung berlabel DNA. Dengan membandingkan kontrol dan eksperimen jalur dengan reaksi
sequencing yang dijalankan secara paralel, menjadi mungkin untuk "membacakan" urutan yang
sesuai secara langsung, sehingga mengidentifikasi urutan nukleotida dari situs mengikat.
Seperti dijelaskan sebelumnya (lihat Gambar 11.20), RNA polimerase awalnya mengikat
daerah dari -50 sampai +20. Titik-titik di mana RNA polimerase sebenarnya kontak promotor
dapat diidentifikasi dengan memodifikasi teknik footprinting untuk mengobati RNA polimerase
kompleks-promotor dengan reagen yang mengubah basis tertentu. Kita dapat melakukan
percobaan dengan dua cara:
DNA dapat dimodifikasi sebelum terikat RNA polimerase. Jika modifikasi mencegah RNA
polimerase dari mengikat, kami telah mengidentifikasi posisi dasar di mana kontak sangat
penting.
RNA polimerase kompleks-DNA dapat dimodifikasi. Kami kemudian membandingkan pola pita
dilindungi dengan DNA bebas dan dimodifikasi kompleks.
Beberapa band hilang, sehingga mengidentifikasi situs di mana enzim telah melindungi
promotor terhadap modifikasi. Band lain meningkat intensitasnya, sehingga mengidentifikasi
situs di mana DNA harus dipegang dalam konformasi di mana ia lebih terbuka. Perubahanperubahan dalam sensitivitas mengungkapkan geometri kompleks, seperti yang dirangkum dalam
GAMBAR 11,29 untuk promotor yang khas. Daerah di-35 dan -10 mengandung sebagian
besar titik kontak untuk enzim. Dalam wilayah ini, set yang sama dari posisi cenderung baik
untuk mencegah mengikat jika dimodifikasi sebelumnya, dan untuk menunjukkan peningkatan
atau penurunan kerentanan terhadap modifikasi setelah mengikat. Titik kontak tidak sesuai
sepenuhnya dengan situs mutasi; Namun, mereka terjadi di wilayah yang terbatas yang sama.
Ini adalah catatan yang layak bahwa posisi yang sama dalam promotor yang berbeda
memberikan titik kontak, meskipun dasar yang berbeda hadir. Hal ini menunjukkan bahwa ada
mekanisme umum untuk polimerase RNA mengikat, meskipun reaksi tidak tergantung pada
keberadaan pangkalan tertentu di beberapa titik kontak. Model ini menjelaskan mengapa
beberapa titik kontak tidak situs mutasi. Selain itu, tidak setiap mutasi terletak pada titik kontak;
mutasi dapat mempengaruhi lingkungan tanpa benar-benar disentuh oleh enzim.
Hal ini terutama penting bahwa eksperimen dengan modifikasi sebelumnya
mengidentifikasi situs hanya di wilayah yang sama yang dilindungi oleh enzim terhadap
modifikasi berikutnya. Kedua percobaan mengukur hal yang berbeda. Modifikasi sebelumnya
mengidentifikasi semua situs-situs yang enzim harus mengakui untuk mengikat DNA.

Percobaan perlindungan mengenali semua situs-situs yang benar-benar membuat kontak

dalam kompleks biner. Situs yang dilindungi mencakup semua situs pengakuan dan juga
beberapa posisi tambahan, yang menunjukkan bahwa enzim yang pertama mengakui satu set
dasar yang diperlukan untuk itu untuk "mendarat" dan kemudian meluas titik-titik kontak ke
basis tambahan.
Wilayah DNA yang dibatalkan di kompleks biner dapat diidentifikasi secara langsung
oleh perubahan kimia dalam ketersediaannya. Ketika untai DNA dipisahkan, basis berpasangan
menjadi rentan terhadap reagen yang tidak dapat mencapai mereka dalam double helix.
Percobaan tersebut melibatkan posisi antara -9 dan +3 dalam reaksi peleburan awal. Wilayah
dibatalkan selama inisiasi karena itu termasuk ujung kanan -10 urutan dan meluas hanya
melewati titik awal tersebut.
Dilihat dalam tiga dimensi, titik kontak hulu -10 urutan semua terletak pada satu wajah
DNA. Hal ini dapat dilihat pada gambar bawah pada Gambar 11.29, di mana titik kontak ditandai
pada helix ganda dilihat dari satu sisi. Sebagian berbaring di coding strand.

Gambar 11.29 satu wajah dari promoter terdiri dari kontak point dari RNA

Basis ini mungkin diakui dalam pembentukan awal kompleks biner tertutup. Hal ini akan
memungkinkan bagi RNA polimerase untuk mendekati DNA dari satu sisi dan mengakui bahwa
wajah DNA. Sebagai unwinding DNA dimulai, situs lebih lanjut bahwa awalnya terlihat di wajah
lain dari DNA dapat diakui dan terikat.

Pertanyaan:

1. Bagaimana tahapan pada reaksi transkripsi?

RNA polimerase memulai transkripsi setelah mengikat ke tempat promotor pada DNA.
Selama elongasi bergerak sepanjang bublle transkripsi DNA dan rantai RNA diperpanjang di
arah 5'-3.
Ketika transkripsi berhenti, reformasi duple DNA dan RNA polimerase memisahkan di tempat
terminator.