PRCTICA N 05

Introduccin

Existen diversos mtodos para cuantificar el nmero de microorganismos presentes en muestras lquidas y
slidas. Dentro de las tcnicas ms comunes se encuentra el recuento directo por microscopia de
fluorescencia, as como los procedimientos basados en diluciones en serie, haciendo crecer microorganismos
en medios de cultivo sintticos slidos o lquidos, como el recuento en placa de Unidades Formadoras de
Colonias
(UFC) o la estimacin por el mtodo del Nmero Ms Probable (NMP).
El mtodo del nmero ms probable fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente sigue siendo
ampliamente utilizado. En un principio este mtodo fue empleado para estimar el nmero de microorganismos
en muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que tambin puede ser aplicado para la
determinacin de microorganismos aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos
y suelos contaminados, por tanto este mtodo es aplicable para estimar el nmero de microorganismos en
muestras de suelo y agua, tanto para bacterias aerobias como anaerobias.
Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, capaces de fermentar la lactosa a 44 C
en vez de 37 C como lo hacen los totales.
Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en heces estn formados por Escherichia
coli y ciertas especies de Klebsiella. Ya que los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las
heces de los animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor la presencia
de contaminacin fecal. stos ltimos se denominan termotolerantes por su capacidad de soportar
temperaturas ms elevadas. Esta es la caracterstica que diferencia a Coliformes Totales y Fecales. La
capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotrmicos es
favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de materia orgnica, pH, humedad. Desde hace
muchotiempo se han utilizado como indicador ideal de contaminacin fecal. Su presencia se interpreta como
una indicacin de que los organismos patgenos pueden estar presentes y su ausencia indica que el agua o
el alimento estudiado se hallan exentos de organismos productores de enfermedades.
I. Objetivos:
Familiarizarse con los mtodos de recuento, especialmente con el de NMP.
Detectar bacterias coliformes totales y fecales.
Detectar si la muestra trada es apta para el consumo humano.

Materiales

Muestra: Leche
Medios de cultivo: Caldo Brilla (presuntivo), agar MacConkey, agar Endo, EMB, CB.
Caldo EC
Tubos de dilucin
Pipetas
Bombilla de aspiracin
Placas de Petri
Mechero Bunsen
Bao Mara
Estufa
Gradillas
Anzas microbiolgicas calibradas

Procedimiento

a. Mtodo para coliformes totales:

Preparamos diluciones hasta 10-3.
Sembramos dos, tres o cinco tubos por cada dilucin, segn sea el caso.

o
o
o
o
o
o
o
o

Los resultados se dan en por gr o mL

En el caso de agua se sigue de la otra forma:

Cuando se trate de aguas, los resultados se darn por 100 mL.
Luego, incubar a 35 C 1 por 24 h.
Realizar la 1ra lectura (determinar la presencia de gas). sta se observa en las campanas.
Los tubos que no sean positivos se incuban por otras 24 h ms.
b. Mtodos para coliformes fecales:
Para coliformes fecales se utilizan dos mtodos:
En el Primer Mtodo se cogen los tubos positivos del caldo Lauril Sulfato Triptosa y se lleva
una asada al caldo EC utilizando una asa que tenga 3 mm de dimetro.

Luego, estos tubos se incuban a 45.5 C 0.2, en bao Mara con agitacin constante por

o
24 h.
o
o
o
o

Si hay gas a las 24 o 48 h. es positivo para coliformes fecales.

El Segundo Mtodo es la llamada prueba de Mackenzie.
En esta se usa el caldo Brila mas agua Peptonada.
Se parte del caldo MacConkey, los tubos positivos de la prueba de coliformes totales se
siembran en este caldo, si aqu vuelve a salir positivo se le realizan las dos pruebas sgtes:

Slo se tomar esta prueba como positiva si los dos tubos (caldo Brilla y caldo
Peptonado) resultan positivos.
Al tubo con caldo peptonado se le agrega el reactivo de Kovacs para hacer la
prueba de Indol.
Para ver coliformes termorresistentes, de los tubos que hayan salido positivos se
siembra una asada en agar MacConkey y se aslan las colonias caractersticas.
De los tubos positivos se los siembra en otros tubos en caldo EC con campana de
Durham.

Resultados

De los tubos sembrados en el caldo Brilla (prueba presuntiva), se obtuvo los sgtes.
resultados (a las 24 horas) para coliformes totales:

Para realizar la prueba confirmativa se sembr en agar MacConkey, luego de la

incubacin por 24 horas, se obtuvo los sgtes. resultados:

Por lo tanto, se puede decir que el resultado del nmero ms probable es: 222.
Para este resultado las tabla de NMP con un lmite de confianza de 95% para la
prueba de fermentacin utilizando 3 diluciones con dos repeticiones (2 tubos), nos da un valor de >1100
bacterias/mL de leche.

Conclusiones

Los valores mnimos permisibles usados en Mxico, por ejemplo, nos dan los
sgtes. valores de referencia para diversos alimentos:
Especificaciones microbiolgicas establecidas para diversos alimentos.

*NOM-093-SSA1-1994 ; ** NOM-121-SSA1-1994; *** Lmites microbiolgicos de la ICMSF (International

Commission on Microbiological Specifications for Foods).
La muestra trada por nuestro grupo fue de leche cruda. Al hacer un comparativo
de nuestros resultados vemos, por ejemplo, que "La Norma Venezolana para Lcteos" da como valores lmites
los sgtes. valores:

Vemos que el lmite dado para Coliformes Totales en leche cruda est dada
en UFC/ml, entonces, comparando nuestra muestra de leche, trada de un puesto lechero del sector Santa
Rosa Chiclayo con las muestras dadas en el cuadro, la podemos calificar como una leche DE TERCERA.

RESULTADOS COLIFORMES FECALES

Para la prueba de coliformes fecales se utiliz como mtodo la prueba de
Mackenzie, aunque, al no tener todos los medios necesarios, se hicieron algunas modificaciones.
De los tubos positivos del Caldo Brilla si inocul, de cada uno, a tubos con Caldo
E-C.
Luego se incub los tubos a 44 C 0.1 por 24 h.
Pasado el tiempo se ley los resultados.
De los tubos positivos se pas a placas con agar MacConkey, estas se incubaron
por 24 h a 37 C (se debi pasar a dos tubos uno con caldo peptona y otro con caldo Brilla).
Pasado el tiempo, se leen las placas y se realizan las pruebas bioqumicas para las
colonias lactosa positivas (L+).
RESULTADOS:
Como todos los tubos del caldo Brilla salieron positivos, se sembraron en tubos con
caldo EC (seis tubos).
Despus de la incubacin de los tubos con caldo EC se obtuvieron los sgtes.
resultados:

De los tubos positivos se sembr en agar MacConkey, de ellas todas salieron

lactosa positivas:

De las colonias lactosa positivas se escogi una y se le realiz las sgtes. pruebas
bioqumicas: IMViC + descarboxilacin de la lisina (LIA) + prueba de fermentacin de carbohidratos (TSI).
Se obtuvieron los sgtes. resultados:

De los resultados obtenidos se puedo identificar a Klebsiella azaenae.

Entonces, como Klebsiella pertenece al grupo de las coliformes fecales, podemos
decir que la muestra tratada (leche cruda) tenia presencia de estas en un nmero de (resultado NMP 2-2-0):
NMP de coliformes fecales = 210 bacterias/ mL.
Algunas sp. del gnero Klebsiella junto con otras de los gneros Citrobacter y Enterobarter se cree que son
las causantes de enfermedades gastrointestinales agudas y crnicas. Estos microorganismos pueden ser
recolectados de ambientes naturales tales como los bosques, el agua fresca as como tambin de
los productos provenientes de la agricultura(vegetales) donde residen normalmente como microflora.
Tambin pueden ser recolectados de las heces de individuos saludables que no presentan sntomas de la
enfermedad. Tambin pueden ser recolectadas a partir de los productos lcteos, los mariscos crudos y
los vegetales frescos y crudos. Estos organismos al contaminar las aguas pueden estar presentes en el suelo
usado para la produccin de cultivos y en las aguas de pesca de mariscos; como resultado stos pueden
constituir un peligro para la salud.

Preguntas

Cules son los diferentes mtodos para coliformes totales?

Para el conteo de coliformes totales se tienen tres mtodos principalmente.
El primero se basa en la tcnica del nmero ms probable (NMP), utilizando caldo
Lauril Sulfato Triptosa seguido de la confirmacin de los tubos positivos de formacin de gas en caldo Lactosa
Bilis Verde Brillante. La incubacin es a 35 C.
El segundo mtodo emplea nicamente el caldo McConkey. La incubacin es a 37
C.
El tercer mtodo usa el caldo Lactosa Bilis Verde Brillante a 35 37 C, seguido de
confirmacin en agar Bilis Rojo-Violeta o en agar Endo.

Qu caractersticas tienen las colonias de coliformes en agar Endo y en agar

Eosina Azul de Metileno?

El medio Eosina Azul de Metileno (EMB) es un medio de plaqueo diferencial que

puede usarse en lugar del agar MacConkey en el aislamiento y deteccin de Enterobacteriaceae o de bacilos
coliformes de muestras con bacterias mixtas. Los colorantes anilnicos (eosina y azul de metileno) inhiben a
las bacterias Gram positivas y a las Gram negativas exigentes. Se combinan para formar un precipitado a pH
cido y, de este modo, sirven tambin como indicadores de la produccin de cido. Las colonias lactosa (+)
dan colonias de color violeta, las de E. coli presentan un caracterstico brillo verde metlico, las
de Enterobacter presentan un color violeta sin brillo metlico (ojo de buey). Las colonias deKlebsiella son
siempre mucosas, grande y ligeramente rosadas.
El medio Endo es un medio selectivo para demostracin de E. coli fecal y
coliformes en los ms diversos materiales. El sodio sulfito y la fucsina inhiben a las bacterias Gram (+). E.
coli y coliformes utilizan lactosa con formacin de aldehdo y cido. Por otra parte, el aldehdo libera fucsina a
partir de la combinacin: fucsina sulfito, lo que da lugar a la coloracin roja de las colonias. En este medio las
colonias lactosa (+) presentan una coloracin roja, p.ej. E. coli es de color rojo con brillo metlico
estable. Enterobacter aerogenes y otros presentan colonias rojas hasta rojizas, semiesfricas y mucosas.

Referencias

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THATCHER, F. S. y D. S., CLARK (1993) Anlisis Microbiolgico de los Alimentos.
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Leer ms: http://www.monografias.com/trabajos89/determinacion-coliformes-totales-fecales/determinacioncoliformes-totales-fecales.shtml#ixzz3LCIFFRi4