TCNICAS ESPECTROMTRICAS:

Las tcnicas espectromtricas se basan en la interaccin de las radiaciones

electromagnticas con la materia. Las principales tcnicas espectromtricas empleadas en la
actualidad en los laboratorios de bioqumica clnica son:
La espectrometra de absorcin molecular en el ultravioleta y en el visible
La fluorimetra
La turbidimetra
La nefelometra
La luminometra
La espectrometra de absorcin atmica
La espectrometra de emisin atmica
Naturaleza de la radiacin electromagntica
La radiacin electromagntica es una forma de energa radiante; se representa como un
campo elctrico y otro magntico situados en fase y con oscilaciones sinusoidales en ngulo
recto un campo respecto al otro y, a su vez, con la direccin de propagacin; se propaga por lo
tanto en forma de ondas.
En este fenmeno ondulatorio se definen:
Longitud de onda (): se define como la distancia entre 2 mximos de un ciclo completo del
movimiento ondulatorio; esta distancia se expresa, segn el Sistema Internacional de Unidades
(SI) en nanmetros (nm ,10 m); otras unidades ya obsoletas son: ngstrom (A) y milimicra (m);
la relacin entre estas medidas es:
-9

1nm = 1m = 10 A = 10 m.
-9

Frecuencia (v): es el nmero de oscilaciones (ciclo) que una partcula realiza en una unidad de
tiempo, generalmente un segundo (ciclos por segundo); es la inversa de la longitud de onda.
v = c/

siendo c = velocidad de la luz

Pero es que adems la luz est formada por fotones, o paquetes discontinuos de
energa; la energa de un fotn depende de su frecuencia y de su longitud de onda:
E = h.v
E = h. c/

siendo v = frecuencia y h = constante de Planck

Por lo tanto la relacin entre la longitud de onda y la energa de una radiacin

electromagntica es inversa: cuanto mayor es la longitud de onda, menor es la energa;
por ejemplo, la radiacin UV a 200 nm posee mayor energa que la radiacin infrarroja a
750.
La relacin de la longitud de onda con la frecuencia y con la energa de radiacin es inversa, por
lo que las radiaciones ms energticas, las ms penetrantes, son a su vez las de mayor
frecuencia y menor longitud de onda

Se denomina espectro electromagntico al conjunto de radiaciones electromagnticas, y se ha

dividido en varias regiones o bandas espectrales caracterizadas por determinados
parmetros de longitud de onda, frecuencia etc.
Espectro electromagntico
RADIACIONES EM

Longitud de onda (nm)

Rayos gamma

10 -10
-5

Rayos X

10 -10
-3

Ultravioleta

200-380

Luz Visible

380-780

Infrarrojo

-3

780-50.000

Microondas

10 -10
8

Frecuencias de Radio

>10

El ojo humano responde a la radiacin electromagntica entre los 380 y los 750
aproximadamente, pero actualmente disponemos de instrumentos que suplen nuestra limitacin,
y permiten la medida de radiaciones de longitudes de onda mayores (IR) y menores (UV).
La luz solar, o la luz emitida por un filamento de tungsteno, es una mezcla de radiaciones
de distinta longitud de onda que al ojo humano se reconoce como blanca, es decir, es una
radiacin policromtica.
En la regin visible, la luz se descompone en colores y sus complementarios:
Descomposicin del espectro visible y ultravioleta en colores y sus complementarios

Longitud de onda
(nm)
180-220
220-340

Nombre de la
regin
UV corto
UV

Color
absorbido

Color complementario o de la
solucin
No visible
No visible

---

380-430

Visible

Violeta

430-495

Visible

495-555

Azul

Visible

555-600

Visible

600-650

Visible

650-780

Visible

Amarillo verdoso

Naranja
Rojo

Amarillo
Verde

Rojo

Amarillo

Azul
Azul verdoso
Verde azulado

El color que presentan los distintos objetos o soluciones se debe a la interaccin de la

radiacin policromtica (luz blanca) con ellos. Un objeto o solucin est formada por partculas
que absorben radiaciones de determinada longitud de onda y no absorben otras, que son las que
pueden verse, denominndose color complementario. Por ejemplo, si una solucin absorbe luz
entre 430 y 480 nm (azul), tendr un color amarillo, por tanto, el amarillo es el color
complementario del azul.
En consecuencia, una solucin que se observa de un color determinado al ojo humano,
deber ser iluminada para las mediciones fotomtricas con un haz de luz del color que se
absorbe; por ejemplo una solucin de color rojo se irradia con luz de aproximadamente 500 nm.
Fenmenos de interaccin entre luz y materia
Cuando se produce una interaccin entre un haz de luz y la materia, se producen, entre otros,
fenmenos de absorcin o emisin energtica.
1.- Proceso de absorcin:
Cuando una partcula que se encuentra en estado de reposo o estado fundamental,
interacciona con un haz de luz, absorbe energa, y pasa a lo que se denomina estado excitado.
En la partcula se producen cambios que dependen de las caractersticas de la propia partcula
(tipo de enlaces, etc) y de la energa () de la luz que interacciona.
La partcula en estado excitado tiende a regresar espontneamente a su estado fundamental,
desprendiendo la energa absorbida en forma de calor.
A + h.v

A*

A + calor
0

Siendo: A = absorbente en estado fundamental

A* = absorbente en estado excitado
h.v = energa del fotn absorbido (h = cte de Planck y v = frecuencia de la radiacin)
0

Cada especie absorbente (cromgeno) tiene lo que se llama un espectro de absorcin

caracterstico, Este espectro representa la relacin entre la longitud de onda incidente y la
absorbancia que representa una solucin de la especie, en condiciones definidas de trabajo. Al
grfico que resulta de representar en un eje de coordenadas absorbancia (ordenadas) frente a la
(abscisas), es a lo que llamamos espectro de absorcin
Los espectros de absorcin son de utilidad para:

Seleccionar la ms adecuada para una medida cuantitativa ( a la que la absorcin es

mxima).
Fines de identificacin cualitativa.
La medida de la cantidad de luz absorbida por una solucin de una especie absorbente, es el
fundamento en que se basan las tcnicas de espectrofotometra de absorcin.
2.- Proceso de emisin:
Algunos compuestos tienen la propiedad, tras ser excitados, de retornar a su estado
fundamental, produciendo una emisin de energa radiante.
La luz emitida se puede medir, y ello constituye el principio de algunas tcnicas, como la
fotometra de llama (emisin atmica) o la Fluorescencia.
A + h.v
0

--------> A* -------> A + h.v

0

Siendo: A = absorbente en estado fundamental

A* = absorbente en estado excitado
h.v = energa de excitacin
h.v = energa de emisin.
0

1
2

Explicacin:
En los tomos, los electrones ocupan alrededor del ncleo determinados niveles
energticos, que definen orbitales caractersticos para cada tipo de tomo. Un tomo en estas
condiciones, se encuentra en su estado fundamental o de menor energa, su configuracin
electrnica es estable y tiende a mantenerla o a recuperarla si esta ha sido alterada.
En el caso de la radiacin correspondiente a la banda espectral del UV y/o del visible, la
radiacin absorbida tiene la energa suficiente como para producir el desplazamiento de los
electrones de enlace a posiciones ms energticas y por tanto, menos estables, denominados
estados excitados. Los tomos tienden a estar en el estado de mayor estabilidad que coincide
con el estado fundamental o menos energtico, por lo que los electrones al volver total o
parcialmente a este estado en el proceso denominado relajacin, la energa que fue
previamente absorbida, es reemitida en forma de radiacin electromagntica, cuya est
ntimamente ligada a la cantidad de energa incidente.
Este fenmeno es la base de tcnicas espectroscpicas de anlisis como la absorcin,
la absorcin atmica, la emisin, la fotometra de llama (emisin atmica), la fotoluminiscencia
(fluorescencia y fosforescencia), la nefelometra, la turbidimetra, etc.
ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORCIN MOLECULAR:
La espectrofotometra de absorcin consiste en la medicin de la radiacin que llega a
un detector tras producirse un fenmeno de absorcin de luz por parte de una sustancia
absorbente.
En qumica clnica, el material en estudio es generalmente una solucin, y las medidas
se hacen ordinariamente dentro del espectro comprendido entre los 220 y 800 nm.
Es aplicable tanto para anlisis cualitativos como cuantitativos.
Leyes de absorcin

Cuando un haz de luz de intensidad I incide sobre una cubeta cuadrada que contiene
una solucin coloreada que absorbe luz a una determinada , se produce en la solucin un
proceso de absorcin, y el haz de luz que sale despus de atravesar la cubeta tiene una
intensidad menor, I
0

Para evitar interacciones por parte del solvente o de la cubeta y considerar as slo la
absorcin del compuesto de inters, hay que hacer una primera medida con una solucin de
referencia o blanco, que contiene todos los posibles compuestos que participan en la lectura,
menos el compuesto a medir. Todas las medidas que se hagan a continuacin sern referidas a
esta medida inicial.
Se define transmitancia a la relacin entre la luz incidente y la luz transmitida:
T = I /I
s

Y el porcentaje de transmitancia:
%T = I /I . 100
s

En la prctica se emplea, en lugar del valor de transmitancia, el de absorbancia (A), ya

que la relacin entre la concentracin de una solucin y su transmitancia es inversa y
logartmica, mientras que la relacin entre la absorbancia y concentracin es directamente
proporcional.
A = - log I /I = - log T = log 1/T = log 100/%T = log 100-logT A = 2 log %T
s

Si representamos grficamente en un eje de coordenadas la relacin entre la

absorbancia y concentracin y el %T y la concentracin observamos que al aumentar la
concentracin del compuesto absorbente en solucin, ms luz es absorbida y menos transmitida.
En los aparatos que se usan hoy en da, las lecturas de %T son transformadas en
absorbancias y presentadas as al operador, pero no hay que olvidar que la absorbancia no es
en s misma medible, sino que se obtiene por un clculo matemtico a partir de los datos de
transmitancia que mide el sistema fotomtrico.
La relacin entre las cantidades de absorbente en una solucin y el grado en que esta
solucin absorbe la luz, se encuentra regida por las Leyes de absorcin.
La Ley de Beer indica que la concentracin de la sustancia es directamente proporcional
a la cantidad de luz absorbida o inversamente proporcional al logaritmo de la luz transmitida.
La frmula matemtica establece la relacin entre el grado de absorbancia de una solucin y
otras 2 variables: la concentracin del absorbente y la longitud del trayecto que el haz de luz
recorre a travs de la solucin. Segn esta ley, la absorbancia de una solucin es directamente
proporcional a la concentracin y a la longitud del paso de luz:
A = a.b.c
Siendo: A = absorbancia
a = coeficiente de absorcin (es una cte relacionada con la naturaleza del soluto)
b = longitud del paso de la luz en centmetros (en la cubeta); su valor est estandarizado
en 1 cm para todos los espectrofotmetros
c = concentracin del absorbente

El coeficiente de absorcin (a) se denomina coeficiente de extincin molar,

representado con el smbolo cuando las unidades de b son centmetros y las de c son
moles/litro; es constante para un compuesto dado cuando se fijan condiciones de , pH,
solvente, temperatura, y otros factores; sus unidades son 1 / mol . cm.
En la prctica el significado del coeficiente de extincin molar es el siguiente: cuanto
mayor sea en una sustancia, mayor ser la absorbancia de ese compuesto y por tanto, mayor
ser la sensibilidad del mtodo que lo emplea.
Clculo de concentraciones
La Ley de Beer tiene una aplicacin prctica para averiguar la concentracin de una
sustancia de inters en una solucin basndose en la relacin lineal entre absorbancia y
concentracin; as podemos conocer la concentracin de una sustancia de 2 maneras:
Por comparacin con una solucin conocida
Por la curva de calibracin
Por comparacin con una solucin conocida:
Si tenemos 2 soluciones, P (problema) y S (estndar de concentracin conocida), podemos
establecer la siguiente relacin matemtica entre ellas:
A/A = C/ C
S

C =C .A /A

Siendo: A = absorbancia de la solucin estndar

A=

problema
C = concentracin de la solucin estndar
C =

problema
Conocemos el valor de C y por la analtica los valores de A y A ; con estos datos
calculamos el cociente C /A estableciendo as el valor de un factor, que es constante, y que
multiplicado por las absorbancias de sucesivos problemas que se ensayen en la misma serie,
nos dar el valor de las concentraciones de estas soluciones problema.
s

C =C /A .A =F.A
p

siendo F = factor de calibracin

b) Curva de calibracin:
Es la representacin grfica en un eje de coordenadas de absorbancia (ordenadas) frente a
concentracin (abscisas).
El mtodo de trabajo con curva de calibracin consiste en ensayar varias soluciones de
concentraciones conocidas, determinar sus absorbancias y a continuacin construir la curva
de calibracin (que debe ser una recta), representando las concentraciones frente a
absorbancias grficamente; en la construccin de la curva se emplean un mnimo de 3 puntos y
a continuacin se traza una lnea recta que se aproxime a ellos lo ms posible.
Una vez ensayadas las soluciones problema, su concentracin se averigua por
interpolacin de las absorbancias de las soluciones problema en la recta de calibracin.
Estas 2 formas de trabajo slo son vlidas si el cromgeno obedece la Ley de Beer, y tanto
las soluciones estndar como los problemas son ledas en idnticas condiciones.

En toda determinacin fotomtrica se debe conocer la linealidad, que es el intervalo de

concentraciones del cromgeno entre las cuales existe una relacin lineal entre la
concentracin y la absorbancia, es decir, se cumple la Ley de Beer. Cuando la concentracin
del cromgeno en la solucin sobrepasa los lmites de linealidad, la Ley de Beer deja de
cumplirse, convirtindose la recta de la grfica en una curva a partir de ese punto de
concentracin; la lectura de una absorbancia fuera de los lmites de linealidad, se traduce en una
concentracin falsamente baja de cromgeno; ante esta situacin, hay que diluir la muestra
para que su concentracin entre dentro de los lmites de linealidad.
Desviaciones de la Ley de Beer
Son desviaciones producidas en la linealidad de la relacin entre concentracin y
absorbancias; la recta se curva antes de su lmite de linealidad. Pueden causarlas diversos
factores:
Se miden concentraciones muy elevadas de cromgeno
La radiacin incidente no es monocromtica
La absorbancia del solvente es significativa comparada con la del soluto
La luz es transmitida por otros mecanismos (luz errtica, o luz monocromtica que llega al
detector)
Los lados de la cubeta no son paralelos
Si hay interferentes (otros cromgenos absorben tambin a esa longitud de onda)
Si existe fenmeno de fluorescencia
Longitud de onda nominal de un haz de luz: es la en la que se halla el mximo de intensidad
de luz. Se emplea para definir los filtros.
El grado de monocromaticidad de un monocromador puede variar. En los monocromadores,
la rendija de entrada enfoca la luz sobre el prisma o red de difraccin sobre el cual ser
dispersada y la rendija de salida determina el ancho de banda de la luz que ser
seleccionada del espectro de dispersin; aumentando el ancho de la rendija de salida, el
ancho de la banda de la luz emergente se hace ms amplio, con lo cual aumenta la
intensidad de la energa, pero disminuye la pureza espectral.

Curvas de calibracin: se construyen ensayando soluciones de distintas concentraciones

conocidas (patrn o estndar) y estableciendo para cada una de ellas su absorbancia a una
determinada .
Cuando se trabaje con una curva de calibracin, cualquier cambio en el aparato, o en los
reactivos con que se fabric, requieren la construccin de una nueva curva.
Empleo de factores de calibracin: otra forma de trabajo es emplear factores de calibracin;
se hallan comparando concentraciones y absorbancias de estndar y problema.
A estndar = a . b . c estndar
A problema = a . b . c problema
C problema = A problema . C estndar
A estndar

A estndar
C estndar
A problema
C problema

C estndar/A estndar es constante, es el factor de calibracin

Cualquier cambio en las condiciones de trabajo (reactivos, ajustes del aparato, etc)
requiere el clculo de un nuevo factor de calibracin.
Tipos de anlisis espectrofotomtricos
En el laboratorio de anlisis clnicos al unirse la muestra biolgica con los reactivos
comerciales, se desencadenan una serie de reacciones que dan lugar a un cambio apreciable y
mesurable por el equipo instrumental gracias al cual, se puede obtener informacin sobre la
presencia, ausencia, concentracin, cantidad y/o actividad del analito.
A+B+C
D+E
Siendo A = muestra
B y C = reactivos comerciales
Colorimtricos:
Se denominan as las reacciones analticas que se miden empleando
longitudes de onda dentro del visible.
La mayora de las sustancias no son coloreadas y por tanto no absorben luz en
la regin UV-visible, debido a que no tienen grupos cromforos en su estructura qumica;
entonces, debe realizarse alguna estrategia con tal de poder analizar
espectrofotomtricamente estas sustancias. La estrategia consiste en introducir
estructuralmente a estas sustancias no coloreadas los grupos cromforos que no
poseen; de esta forma estas sustancias se transformarn en otras, coloreadas, que
absorbern luz y podremos analizarlas en el UV-visible por espectrofotometra: una
forma de hacerlo consiste en hacer reaccionar la sustancia no coloreada con un reactivo
especfico, de forma que el producto que se obtenga sea coloreado y ahora s absorba
en el UV-visible, de esta forma podr ser ledo en el espectrofotmetro:
Muestra
+ Reactivo
(Sustancia no coloreada)
especfico
[ ? ] Mg/dl

Producto coloreado

Concentracin

lectura Absorbancia
(Espectrofotmetro)

Esta tcnica se denomina tcnica colorimtrica y consiste en la determinacin

por colorimetra de la concentracin de una sustancia o bien el producto de su reaccin
con un reactivo especfico.
La absorbancia del producto obtenido es proporcional a la concentracin de la sustancia
en la muestra.
Para determinar la concentracin se pueden emplear patrones acuosos y la
siguiente expresin:
C
= C . A
A
problema

patrn

problema

patrn

ya que suelen ser, por lo general, reacciones colorimtricas a punto final, pero
tambin pueden ser colorimtricas y cinticas, por lo que se empleara la siguiente
expresin:

problema

= C

patrn

. DO
DO

problema
patrn

https://docs.google.com/document/d/1IStRYXgU2LMyemg7GI0enZuSYGqecjBfocWL_LfYeI/edit?pli=1
Curso 2012-13. Ciclo Superior de Laboratorio de Diagnstico Clnico. Fundamentos y tcnicas de anlisis bioqumico.
Tema 2. Tcnicas espectromtricas