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Reduca (Biologa). Serie Tcnicas y Mtodos. 4 (3): 48-78, 2011.

ISSN: 1989-3620

Curso de cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC):


Prcticas de laboratorio y cuestiones terico-prcticas.
Parte III.
Prctica de laboratorio: optimizacin en la separacin de
compuestos semejantes mediante modificacin de la fase mvil
Mara Sacristn San Cristbal. Eva Mara Daz Pea.
Borja Alarcn Aguareles. Carlos Vicente Crdoba.
Mara Estrella Legaz Gonzlez.
Departamento de Biologa Vegetal I (Fisiologa Vegetal). Facultad de Biologa.
Universidad Complutense de Madrid. Avenida Jos Antonio Novais, 2. 28040 Madrid. Espaa.
marasacristan@bio.ucm.es
evam.diaz@bio.ucm.es
borjaestremera@hotmail.com
cvicente@bio.ucm.es
melegaz@bio.ucm.es

Resumen: En la prctica que se plantea, el alumno debe resolver la separacin de una


mezcla de seis analitos en sus componentes individuales. Para ello se utilizan mezclas
de fase mvil con eluciones isocrticas o en gradiente. El anlisis de los resultados
sobre factor de capacidad, eficiencia, selectividad y resolucin, obtenidos en cada una
de las condiciones de anlisis, permite concluir las condiciones ptimas de la
separacin. Una vez elegida la mejor condicin de anlisis, se predice el orden de
elucin de los compuestos en funcin de sus caractersticas estructurales, masa
molecular y polaridad, principalmente.
Palabras clave: Analito. Eficiencia. Elucin isocrtica. Elucin en gradiente. Fase
estacionaria. Fase mvil. HPLC. Polaridad. Resolucin. Selectividad. Separacin. Tiempo
de retencin.

INTRODUCCIN

El objetivo primario que se persigue en la separacin de componentes de una


mezcla es la adecuada resolucin (Rs) entre los picos, con la mayor pureza y en el
menor tiempo posible. El sistema de HPLC debe ser seleccionado sobre la base de las
separaciones que interesa realizar, escogiendo fases estacionarias, fases mviles y
detectores adecuados y compatibles con la mezcla objeto de estudio. Normalmente, el
analito de inters tarda entre 5 y 10 veces ms tiempo en recorrer la columna que un
analito no retenido, de tiempo muerto (tM). El tM o VM (volumen muerto) puede ser
estimado como se indica a continuacin:
VM Ldc2/2;

tM Ldc2/2F
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donde, F, es el flujo de fase mvil, en (mLmin-1) y dc, el dimetro de la columna,


en (cm).
Bajo condiciones ptimas (cerca de Hmin), el nmero de platos tericos de una
columna de longitud L es:
N 3.500 L (cm)/dp ( m)
donde, dp, es el dimetro de partcula. Las partculas pequeas reducen la
difusin de Eddy (trmino A) y la distancia que el soluto debe difundir en la fase mvil
(trmino C), (ver Introduccin de la Parte I).
Una vez seleccionada la fase estacionaria, la optimizacin de la separacin queda
restringida a variar la temperatura o la fase mvil. En la presente prctica se discutir
exclusivamente el efecto de la fase mvil.
En el mecanismo de separacin mediante reparto en fase reversa (RP-HPLC o
RPC), la fase estacionaria es apolar y la fase mvil, moderadamente acuosa y polar. La
fase estacionaria es slice tratada con metil clorosilano de longitud de cadena variable
(RMeSiCl), donde R, es una cadena lineal de grupos alquilo (C18H37). En este tipo de
fase estacionaria, las molculas polares eluyen antes que las menos polares o apolares.
Una buena separacin cromatogrfica requiere un equilibrio adecuado entre las
fuerzas intermoleculares existentes entre soluto, fase mvil y fase estacionaria. Estas
fuerzas intermoleculares se describen cualitativamente en trminos de polaridad
relativa de cada uno de los reactivos. Las polaridades en orden creciente para varios
grupos funcionales del analito son: hidrocarburos < teres < steres < cetonas <
aldehdos < amidas < aminas < alcoholes. La polaridad de los distintos grupos
funcionales se muestra en la Tabla 1.
El agua es ms polar que cualquier compuesto que contenga alguno de los
anteriores grupos funcionales. La retencin se puede incrementar aadiendo ms agua
a la fase mvil; haciendo la afinidad del analito hidrofbico por la fase estacionaria
hidrofbica, ms afn que por la fase mvil, ahora ms hidroflica. De igual manera, la
retencin puede disminuir aadiendo mayor cantidad de disolvente orgnico a la fase
mvil. El mecanismo de fase reversa opera con el principio de fuerzas hidrofbicas de
tal manera que el ligamiento del analito a la fase estacionaria es proporcional a la
superficie de contacto alrededor del segmento apolar del analito en asociacin con el
ligando en la fase mvil acuosa. Este efecto se denomina solvfobo (Fig. 1). La teora
del efecto solvfobo, propuesta por Horvath et al. (1976), propone que el soluto,
debido a la alta tensin superficial de la fase mvil y a su propia hidrofobicidad, es
expulsado de la fase mvil contra las cadenas hidrocarbonadas de la fase estacionaria.

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Momento Dipolar,
(debyes)

Grupo Funcional
Amina

-N=

0,8 a 1,4

ter

-O-

1,2

Sulfuro

-S-

1,4

Tiol

-SH

1,4

cido Carboxlico

-COOH

1,7

Hidroxilo

-OH

1,7

Halgenos

-F
-Cl

1,6 a 1,8

-Br
-I
ster

-COO-

2,3

Aldehdo

-CHO-

2,5

Cetona

-CO-

2,7

Nitro

-NO2-

3,2

Nitrilo

-C=N-

3,5

Sulfxido

-SO-

3,5

Tabla 1. Polaridad de los diferentes grupos funcionales. Tomado de Smyth (1955).


REDUCCIN EN EL VOLUMEN LIBRE

CADENA HIDROCARBONADA
DE LA FASE ESTACIONARIA

FUERZAS DE VAN DER WAALS


ENTRE ESPECIES QUMICAS
PARTE
NO
POLAR

SOLUTO CON UNA PARTE NO POLAR


Y OTRA POLAR
INTERACCIN ELECTROSTTICA
CON EL DISOLVENTE

INTERACCIN DE VAN DER WAALS


CON EL DISOLVENTE

PARTE POLAR

REDUCCIN DE CAVIDAD
EN EL DISOLVENTE

Figura 1. Ilustracin esquemtica de la asociacin entre una molcula de un soluto que contiene una
parte polar y otra apolar con una cadena hidrocarbonada de la fase estacionaria, efecto solvfobo. Las
flechas rellenas en color gris indican las fuerzas que tienden a unir y las flechas vacas, las fuerzas que
tienden a separar.

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Al elegir una columna para una separacin cromatogrfica mediante mecanismo


de reparto, la polaridad de la fase estacionaria ha de ser bastante similar a la de los
analitos y, para la elucin, se utiliza entonces una fase mvil con polaridad
considerablemente distinta. Este procedimiento por lo general resulta ms adecuado
que si las polaridades del soluto y de la fase mvil son parecidas, pero difieren mucho
con respecto a la fase estacionaria. En resumen, para obtener buenas separaciones en
un tiempo razonable, tienen que armonizarse las polaridades del soluto, la fase mvil
y la fase estacionaria.
Seleccin de la fase mvil en cromatografa de reparto
De los tres mtodos para mejorar la resolucin de una columna basados en la
variacin del nmero de platos tericos (N), factor de capacidad (k) y selectividad (),
en cromatografa de lquidos, k es el ms fcilmente manipulable de los tres debido a
que este parmetro depende considerablemente de la composicin de la fase mvil.
Para una separacin adecuada:
-

0,5 k 20
Rs 2
P 15 MPa (150 bar)
0,9 factor asimetra (As)

1,5

En algunos casos, el ajuste de k no es suficiente para obtener picos individuales


sin superposicin y entonces se debe recurrir a la variacin de . La forma ms fcil de
producir variaciones en es modificando la composicin de la fase mvil, procurando
mantener k dentro de un intervalo razonable. La optimizacin de la fase mvil puede
realizarse con dos mtodos diferentes:
1. Mtodo de elucin isocrtica (= composicin constante), palabra acuada por
Csaba Horvath de la Yale University, uno de los pioneros en HPLC. Se lleva a
cabo con un solo disolvente o con una mezcla de disolventes, constante, en el
tiempo de anlisis.
2. Mtodo de elucin en gradiente. Se lleva a cabo variando de forma continua la
composicin de los disolventes de forma que su fuerza vaya incrementando
durante el tiempo de anlisis (Fig. 2). Normalmente se procede de esta forma,
utilizando una fuerza de fase mvil ms dbil al principio para ir
incrementndola despus. Existe dos tipos de gradientes:
Lineales (curva 5). La velocidad de cambio del disolvente fuerte es lineal en
el tiempo.
Exponenciales. (curvas 1 a 4 y 6 a 9). stos a su vez pueden ser:
- Convexos (curvas 1-4). Rpidas en alcanzar la composicin final de la
fase mvil. Se utilizan para picos superpuestos al final del
cromatograma.

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- Cncavos (curvas 6-9). Lentas en alcanzar la composicin final de la fase


mvil. Se utilizan para picos superpuestos al principio del
cromatograma.
Los diferentes tipos de gradientes se muestran en la Fig. 2.
CONCENTRACIN
FINAL DE
A EN (A+B)

1
2
3
4
5
6
7
8
9

CONCENTRACIN
INICIAL DE
A EN (A+B)

TIEMPO

Figura 2. Diferentes tipos de gradientes de fase mvil. A, representa el disolvente ms fuerte y B, el


disolvente ms dbil en trminos de fuerza extractiva de los solutos.

Efecto de la fuerza del disolvente sobre k


A los disolventes que interaccionan fuertemente con los solutos, a menudo se les
denomina disolventes fuertes. Para descubrir cuantitativamente la polaridad de los
disolventes se han desarrollado varios ndices. El ms til en cromatografa de reparto
es el ndice de polaridad, desarrollado por Snyder (P). Tambin se utilizan el
parmetro de solubilidad de Hildebrand ( ), (Hildebrand y Scott, 1962) y la fuerza
eluotrpica como disolvente ( o). A continuacin se describe brevemente cada uno de
ellos.
a) ndice de polaridad (P)
Utilizando los datos de Rohrschneider (1969), Snyder en 1978, calcul los nuevos
coeficientes de reparto corregidos (Kg) para interacciones dispersivas y efectos de la
masa molecular. Sabiendo que:
Ks = ss / sm
log Kg= log Kg log Kv
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donde, Kg = Kg Vs y, Kv, es un valor de Kg para un hipottico n-alcano con el


mismo volumen molar del soluto. Asumiendo que hay tres interacciones moleculares
aditivas donacin de protones (d), aceptacin de protones (e) y dipolos fuertes (n) , el
coeficiente de reparto corregido para cada efecto contribuira al total del ndice de
polaridad (P), de manera que:
P= log (Kg)d + log (Kg)e + log (Kg)n
donde los subndices d, e y n se refieren a las tres fuerzas. Este ndice de
polaridad mide la atraccin intermolecular entre un soluto y un disolvente y, en
resumen, se basa en las medidas de solubilidad para la sustancia en cuestin en tres
disolventes: dioxano (un aceptor de protones de dipolo dbil), nitrometano (un
aceptor de protones de dipolo intenso) y etanol (un donador de protones de dipolo
intenso). P, por tanto, es una medida numrica de la polaridad relativa de varios
disolventes. El ndice vara entre 10,2 para un compuesto muy polar como el agua
hasta 2 para fluoroalcanos muy poco polares. En la Tabla 2 se muestran los valores de
ste y otros ndices que ahora comentaremos, as como alguna de las propiedades de
los disolventes ms comnmente utilizados como fases mviles en HPLC.
Snyder fue ms all y calcul tambin tres parmetros de selectividad
representativas de las tres fuerzas ( d), ( e) y ( n) que no son objeto de estudio en este
momento.
b) Parmetro de solubilidad de Hildebrand ( )
Este parmetro, a diferencia de P, se define para un disolvente puro y fue
introducido para predecir la solubilidad de unos lquidos en otros. El ndice es una
medida de las fuerzas entre molculas o, de la presin interna de una substancia. En la
prctica se define como funcin de polaridades y se expresa como:
= ( Evap/ V)1/2
donde, E vap, es la energa molar de evaporacin, en (Jcm-3) y V, el volumen
molal del lquido. A bajas tensiones de vapor, esta igualdad se corresponde con la
energa de vaporizacin por cm3. Los valores de incrementan con la polaridad, desde
un valor 6 para los alcanos fluorosubstituidos a 21 para el agua (Tabla 2). En la
actualidad, se tienden a utilizar con ms frecuencia las series eluotrpicas.

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ndice de
refraccin

Lmite
inferior de
transparencia
en el UV

Punto de
ebullicin
( C)

Viscosidad a
20 C (cP)

Parmetro
de
Hildebrand

iso-octano
n-hexano
ciclohexano
n-decano
tetracloruro de
carbono
iso-propil ter
tolueno
benceno
cloroformo
diclorometano
cloruro de
metileno
tetrahidrofurano
dicloruro de
etileno
metil etil cetona
Acetona
Acetonitrilo
Acetato de etilo

1,404
1,375
1,427
1,412

197-210
195
200
210

99,2
68,9
80,7
174,1

()
0,5
0.313
0,98
0,92

( )
7
7,3
8,2
7,8

0,4
0
0
0,3

0,01
0,01
0,04
0,04

0,01
0,03
0,04

1,466

265

76,5

0,97

8,6

1,7

0,18

0,12

1,368
1,496
1,501
1,443
1,424

220
285
280
245
232

68,3
101,6
80,1
61,2
40

0,33-0,37
0,59
0,65
0,57
0,44

7,3
8,9
9,2
9,2
9,6

2,2
2,3
3
3,4-4,4
3,4

0,28
0,29
0,32
0,36-0,4
0,4

0,22
0,23
0,25
0,26
0,32

1,424

233

39,8

0,44

9,7

3,4

0,42

0,32

1,408

212-230

66

0,55

9,1

4,2

0,45

0,35

1,445

230

83,5

0,79

9,7

3,7

0,49

0,38

1,379
1,359
1,344
1,37

330
330
190
256

80
56,3
81,6
77,1

0,43
0,32
0,37
0,46-0,47

9,3
9,6
11,7
9,1

4,5
5,4
6,2
4,3

0,51
0,56-0,58
0,55-0,65
0,58

0,39
0,47-0,53
0,46
0,41

Acetato de metilo

1,362

260

56,3

0,37-0,45

9,2

4,4

0,6

Dimetil sulfxido
Piridina
2-metoxietanol
2-propanol
Etanol
Metanol
cido actico
agua

1,478
1,51
1,401
1,38
1,361
1,329
1,372
1,333

305-330
220
210+
205-210
205
210
180

189
115,3
124,6
82,4
117,7
78,3
64,7
117,9

2,24
0,94
1,72
2,35
1,2
0,6
1,1-1,26
1

12,8
10,7

6,5
5,3
5,7
4,3
5,2
6,6
6,2
9

0,62
0,71
0,74
0,82
0,88
0,95
alto
alto

Disolvente

12
13,7
12,4
21

Fuerza
ndice de
eluotrpica
polaridad (P)
( oenAl2O 3)

Fuerza
eluotrpica
( o en SiO 2)

0,68
0,73

Tabla 2. Algunas propiedades de los disolventes ms utilizados en HPLC. Los parmetros , , P y


definidos
en
el
texto.
Tomada
de
http://www.sanderkok.com/techniques/hplc/
eluotropic_series_extended.html.

c) Fuerza eleutrpica o fuerza como disolvente ( o)


Este parmetro define la energa de adsorcin de cada disolvente por unidad de
superficie de slice respecto al valor de o del pentano, que es igual a zero. Cuanto
mayor es la polaridad del disolvente, mayor es su valor de o. En la Tabla 2 aparecen
representados estos valores para los disolventes ms utilizados. Los valores de o para
otros adsorbentes como almina fueron calculados por Snyder (1968), quien demostr
la siguiente relacin:
o

(slice)= 0,77

(almina)

Siempre y cuando los disolventes sean miscibles (ver Tabla. 3), se pueden hacer
combinaciones binarias, ternarias o incluso cuaternarias variando las proporciones de
cada uno de ellos con objeto de obtener una amplia gama de valores de o. Aunque

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depende del sistema cromatogrfico empleado y el valor de o no vara linealmente


con la composicin de una mezcla, en la prctica resulta til la siguiente aproximacin:
o
mezcla

%mezcla=

o
1

%1 +

o
2

%2

Queda lo suficientemente claro que a mayor valor de


del disolvente pero conviene recordar que:

, mayor es la polaridad

En cromatografa de reparto en fase normal, la fuerza de arrastre de la fase


mvil es mayor cuanto mayor sea su valor de o. Por ejemplo, una fase mvil de
n-hexano puro ( o= 0,01) tiene menor fuerza de arrastre que una mezcla de nhexano:cloroformo (50:50, v/v) ( o= 0,205).
En cromatografa de reparto en fase reversa, la fuerza de arrastre de la fase
mvil es menor cuanto mayor sea su valor de o. Por ejemplo, una fase mvil de
acetonitrilo puro ( o= 0,65) tiene menor fuerza de arrastre que una mezcla de
acetonitrilo:acetona (50:50, v/v) ( o= 0,605).
Se haba subrayado que la forma ms fcil de mejorar RS de dos especies es
manipular el valor de k, el cual puede a su vez modificarse cambiando el valor de la
polaridad. Normalmente, un cambio de 2 unidades en el valor de P origina una
variacin de unas 10 veces en k. La elucin en gradiente disminuye la retencin de los
ltimos solutos haciendo que eluyan antes y sean ms estrechos. Tambin incrementa
la altura del pico, lo cual es importante en anlisis de trazas. El programa de gradiente
puede incluir pasos de incremento rpido en la concentracin del componente
orgnico (el disolvente de mayor fuerza de arrastre, esto es, el menos polar en fase
reversa) o pendientes a diferentes tiempos, de acuerdo a la separacin ptima
deseada. A continuacin, se enumeran una serie de reglas generales para las
operaciones en gradiente:
a) La utilizacin de gradiente est justificada cuando se trata de mezclas de
componentes con un amplio rango de polaridad.
b) Es conveniente hacer primero un gradiente amplio (entre el 5% y el 100% de
disolvente fuerte, en 40-60 minutos), para decidir si se utiliza una elucin
isocrtica o en gradiente.
Si tR / tG > 0,25, utilizar elucin en gradiente.
Si tR / tG < 0,25, utilizar elucin isocrtica.
donde, tR, es la diferencia en tR entre el primero y el ltimo pico del
cromatograma y tG, el tiempo de gradiente: el tiempo en el que cambia la composicin
de la fase mvil.

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c) Si una vez realizado el paso anterior, se elige hacer un gradiente, eliminar las
porciones de ste, anterior a la elucin del primer pico y posterior a la elucin
del ltimo pico. Hacer entonces el mismo gradiente mencionado en b).
d) Si la separacin que se obtiene es aceptable, hay que intentar reducir el tiempo
del gradiente para reducir el tiempo de anlisis. Si la separacin no es aceptable
intentar otro tipo de gradiente no lineal.
Una vez terminado el anlisis en gradiente, la columna debe ser equilibrada de
nuevo antes de hacer la siguiente inyeccin. Para ello se realiza un re-equilibrado
que consiste en volver a las condiciones iniciales de composicin de la fase mvil.
Normalmente se realiza en unos 20 minutos pero es el cromatografista quien lo decide
en funcin de las propiedades de la muestra y el sistema cromatogrfico.
En la prctica que se plantea a continuacin, se realizarn eluciones con fases
mviles isocrticas y en gradiente, sin modificaciones de la fase estacionaria ni
variacin de la temperatura con objeto de obtener los valores ms indicados de k.

Tabla 3. Tabla de miscibilidad de algunos disolventes empleados en HPLC. Tomada de


http://www.cienytech.com/tablas/Tabla-miscibilidades-cruzada.pdf.

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OBJETIVO DE LA PRCTICA

El objetivo que se plantea es la separacin de seis substancias de estructura


molecular semejante en el menor tiempo posible, con la mejor Rs y los valores ms
adecuados de k. Para ello, se realizarn separaciones cromatogrficas en distintas
condiciones de fase mvil, sin variar la fase estacionaria ni la temperatura. En primer
lugar, se trabajar en condiciones isocrticas y despus en gradiente de fase mvil.
Se calcularn los siguientes parmetros: k, Rs, y N para cada pico (o pareja de
picos contiguos) obtenido y se discutir cul de los gradientes planteados por los
alumnos es mejor y por qu. Por ltimo, deber discutirse y justificarse el orden de
elucin de las seis substancias separadas.
En esta prctica, es el alumno el que debe plantear, en discusin con sus
compaeros y el profesor, las condiciones de fase mvil que resultaran oportunas
para la mejor separacin cromatogrfica. El profesor debe ir discutiendo con ellos las
condiciones ms adecuadas y evitar, en la medida de lo posible, que se pierda tiempo
en pruebas que no conduzcan a resultados plausibles.

MATERIAL Y MTODOS
Equipo cromatogrfico. Cromatgrafo de Lquidos de Alta Resolucin
Cromatgrafo lquido. Spectra Physics 8810 (Thermo Electron Corporation, Asheville,
NC, USA), con un loop de inyeccin de 20 L.
Bomba. SP 8810 LC (Thermo Electron Corporation, Asheville, NC, USA), elctrica
alternante de pistn recproco.
Fase estacionaria.
Columna: Mediterranea sea C18 (Teknokroma, S.C.L. Spain).
Tipo: Fase Reversa.
Longitud (L): 120 mm.
Dimetro de partcula (dp): 5m.
Dimetro interno (di): 4,6 mm.
Temperatura. 25oC.
Fase mvil.
Reservorio A: Acetonitrilo (ACN).
Reservorio B: 4% de cido actico en agua Milli-Q.
Fase mvil: Segn se especifique en cada condicin.
Flujo de fase mvil: Segn se especifique en cada condicin, en (mLmin 1).

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Detector SP 8490 UV-Visible (Thermo Electron Corporation, Asheville, NC, USA).


Longitud de onda de anlisis: 280 nm (segn los mximos de absorbancia
obtenidos en los diferentes espectros de absorbancia de los seis analitos objeto
de estudio, (ver Figs. 4 a 9).
Rango (UAFE): 0,005 unidades.
Sistema de integracin. DataApex Clarity LiteTM software para Windows (DataApex
Ltd., Praha, Czech Republic).
Muestras empleadas y composicin de la mezcla
Se trata de seis fenoles de diversa naturaleza, de masa molecular (M.M.) distinta.
La estructura de cinco de ellos es similar y la de otro, cido clorognico, diferente. La
frmula estructural de cada uno de ellos se muestra a continuacin (Fig. 3).
OH

O
HO

O
OH
O

HO
OH

OH

cido clorognico
(M.M.=354,31)

COOH

CH=CH-COOH

CH3 O

CH3 O

OCH3

OH

OH

cido ferlico
(M.M.=194,2)

cido sirngico
(M.M.=198,2)

CH=CH-COOH

COOH

CH=CH-COOH

HO
OH

cido p-hidroxibenzoico
(M.M.=138,1)

OH

cido cafeico
(M.M.=180,2)

OH

cido p-cumrico
(M.M.=164,2)

Figura 3. Estructura molecular de los cidos clorognico, ferlico, sirngico, p-hidroxibenzoico, cafeico
y p-cumrico.

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Composicin cuantitativa
La concentracin de todos ellos, excepto la de cido clorognico, es igual, 0,16
mgmL-1, lo que da una masa inyectada de 3,3 ng. El cido clorognico se prepara a una
concentracin casi tres veces mayor, 0,5 mgmL-1, que da una masa inyectada de 10 ng.
La composicin cuantitativa de la muestra se muestra en la Tabla 4.
Sustancia

Concentracin
(mgmL-1)

Masa inyectada
(ng)

cido cafeico
cido clorognico
cido ferlico
cido p-cumrico
cido p-hidroxibenzoico
cido sirngico

0,16
0,5
0,16
0,16
0,16
0,16

3,3
10
3,3
3,3
3,3
3,3

Tabla 4. Composicin cuantitativa del contenido de la mezcla de anlisis.

RESULTADOS Y DISCUSIN
Lo primero que debe realizarse, como en los casos anteriores, es un espectro de
absorbancia de cada uno de los analitos disueltos en 4% cido actico en agua MilliQ:ACN (80:20, v/v). En las Figs. 4 a 9 se muestran estos espectros. Excepto los cidos
sirngico y p-hidroxibenzoico que slo muestran un mximo principal de absorbancia,
todos tienen dos mximos, uno en el entorno de 235-240 nm y el otro a 325-330 nm.
Sobre esta base, se elige una longitud de onda de anlisis a la que todos los analitos
muestren una cierta absorbancia. La situacin de compromiso que se acepta es 280
nm, aunque podra haberse escogido otra longitud de onda en el entorno, siempre
teniendo en cuenta los criterios de absortividad de todos los analitos presentes en la
muestra problema.

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ISSN: 1989-3620

-1

Figura 4. Espectro de absorcin del cido clorognico a una concentracin de 5 gmL disuelto en 4%
cido actico en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v). Sobre la curva, los nmeros 1 y 2 representan los
mximos de absorcin a 235 nm y 330 nm respectivamente.

-1

Figura 5. Espectro de absorcin del cido ferlico a una concentracin de 5 gmL disuelto en 4%
cido actico en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v). Sobre la curva, los nmeros 1 y 2 representan los
mximos de absorcin a 240 nm y 325 nm respectivamente.

60

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ISSN: 1989-3620

-1

Figura 6. Espectro de absorcin del cido sirngico a una concentracin de 5 gmL disuelto en 4%
cido actico en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v). Sobre la curva, el nmero 1 representa el mximo
principal de absorcin a 280 nm.

-1

Figura 7. Espectro de absorcin del cido p-hidroxibenzoico a una concentracin de 5 gmL disuelto
en 4% cido actico en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v). Sobre la curva, el nmero 1 representa el
mximo principal de absorcin a 256 nm.

61

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ISSN: 1989-3620

-1

Figura 8. Espectro de absorcin del cido cafeico a una concentracin de 5 gmL disuelto en 4%
cido actico en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v). Sobre la curva, los nmeros 1 y 2 representan los
mximos de absorcin a 235 nm y 325 nm respectivamente.

-1

Figura 9. Espectro de absorcin del cido p-cumrico a una concentracin de 5 gmL disuelto en 4%
cido actico en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v). Sobre la curva, los nmeros 1 y 2 representan los
mximos de absorcin a 235 nm y 310 nm respectivamente.

62

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ISSN: 1989-3620

Una vez escogida la longitud de onda de anlisis, 280 nm, sin modificar la fase
estacionaria, se procede a trabajar con diferentes fases mviles. Segn se coment,
estas fases pueden ser constantes en su composicin a lo largo del tiempo de anlisis
(procedimiento isocrtico) o variar a lo largo del tiempo (procedimiento en gradiente).
Si vamos de lo ms sencillo a lo ms complejo, debemos empezar por los anlisis
isocrticos.
1. Anlisis isocrticos
Se plantean tres tipos de anlisis isocrticos, segn se muestra a continuacin en
la Tabla 5.
Anlisis
Reservorio Reservorio
Flujo
isocrtico (n)
A (%)
B (%)
(mLmin-1)
1
2
3

70
30
20

30
70
80

0,7
0,7
0,7

Tabla 5. Anlisis isocrticos planteados. A: Acetonitrilo (ACN) y B: 4% de cido actico en agua Milli-Q.

En los tres tipos de anlisis se mantiene constante, tanto la composicin de la


fase mvil como la velocidad de flujo de sta.
El anlisis isocrtico n 1 tiene una fase mvil con una fuerza de arrastre muy
grande, pues el acetonitrilo (ACN) est en una alta proporcin. Los anlisis isocrticos
n 2 y n 3 tienen menor proporcin de ACN en la mezcla y, por tanto, la fuerza
eluotrpica de la fase mvil es menor. La diferencia de proporcin de ACN entre el
70% y el 80% puede ser importante a la hora de la separacin.
Se procede entonces a inyectar la muestra problema, preparada a la
concentracin que se especific en la Tabla 4, en cada una de estas condiciones de
anlisis. En las Figs. 10-12 y en las Tablas 6-8 se muestran los cromatogramas
obtenidos en cada uno de estos anlisis, as como los resultados de la respuesta del
detector, en cuentas de rea y en porcentaje de cada pico.
Cromatograma obtenido mediante las condiciones del anlisis isocrtico n1
En las condiciones de anlisis isocrtico n 1 (Fig.10 y Tabla 6) slo se obtiene un
pico aun habiendo inyectado una muestra que estaba compuesta por seis substancias.
Todos los analitos eluyen juntos porque no da tiempo suficiente a que se produzca el
correspondiente equilibrio de cada uno de ellos entre las fases estacionaria y mvil.

63

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Unidades de Absorbancia

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Tiempo (minutos)

Figura 10. Cromatograma de la mezcla de los seis fenoles, realizado segn las condiciones del anlisis
isocrtico n 1, con una composicin de fase mvil: ACN: 4% cido actico en agua Milli-Q) (70:30, v/v)
-1
y una velocidad de flujo 0,7 mLmin .

Pico (nmero)

Resultado (%)

tR (min)

Cuentas de rea ( 106)

99,5

3,17

318,07

Tabla 6. Tabla del cromatograma de la mezcla de los seis fenoles, realizado segn las condiciones del
anlisis isocrtico n 1, con una composicin de fase mvil: ACN: 4% cido actico en agua Milli-Q
-1
(70:30, v/v) y una velocidad de flujo 0,7 mLmin .

Cromatograma obtenido mediante las condiciones del anlisis isocrtico n2

En las condiciones de anlisis isocrtico n 2 aparecen cuatro picos claros y


resueltos (Fig. 11) con los tiempos de retencin especificados en la Tabla 7. Existe un
quinto pico, de tR=4,18 min que no queda resuelto del siguiente (del pico de 4,36 min
que llamamos n 3 en la Tabla 7) pero que comienza a aparecer.

64

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Unidades de Absorbancia

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Tiempo (minutos)

Figura 11. Cromatograma de la mezcla de los seis fenoles, realizado segn las condiciones del anlisis
isocrtico n 2, con una composicin de fase mvil: ACN: 4% cido actico en agua Milli-Q (30:70, v/v)
-1
y una velocidad de flujo 0,7 mLmin .

Pico (nmero) Resultado (%)


1
2
3
4
5

16,17
8,38
44,31
20,96
10,18

tR (min)

Cuentas de rea ( 106)

3,39
4,18
4,36
5,39
5,71

57,66
29,89
158,03
74,74
36,3

Tabla 7. Tabla del cromatograma de la mezcla de los seis fenoles, realizado segn las condiciones del
anlisis isocrtico n 2, con una composicin de fase mvil: ACN: 4% cido actico en agua Milli-Q
-1
(30:70, v/v) y un flujo 0,7 mLmin .

Cromatograma obtenido mediante las condiciones del anlisis isocrtico n3


En las condiciones del anlisis isocrtico n 3 (Fig. 12 y Tabla 8), aparecen cinco
picos, aunque la resolucin entre el segundo y el tercero no es buena. Al haber
disminuido la fuerza eluotrpica de la fase mvil, los solutos son capaces de
interaccionar ms tiempo con la fase estacionaria y retenerse ms en ella, logrando as
una mejor separacin.
La Tabla 9 muestra un resumen de los picos obtenidos en cada condicin de
anlisis isocrtico.

65

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Unidades de Absorbancia

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Tiempo (minutos)

Figura 12. Cromatograma de la mezcla de los seis fenoles, realizado segn las condiciones del anlisis
isocrtico n 3, con una composicin de fase mvil: ACN: 4% cido actico en agua Milli-Q (20:80, v/v)
-1
y una velocidad de flujo 0,7 mLmin .

Pico (nmero)

Resultado (%)

tR (min)

Cuentas de rea ( 106)

1
2
3
4
5

20,9
8,21
54,48
9,7
6,72

4,88
5,66
5,96
8,47
9,44

59,8
23,49
155,9
27,76
19,22

Tabla 8. Tabla del cromatograma de la mezcla de los seis fenoles, realizado segn las condiciones del
anlisis isocrtico n 3, con una composicin de fase mvil: ACN: 4% cido actico en agua Milli-Q
-1
(20:80, v/v) y un flujo 0,7 mLmin .
Anlisis Isocrtico
(n)
1

Reservorio A
(%)
70

Reservorio B
(%)
30

30

70

20

80

Flujo
Tiempos de
n de picos
retencin (min)
(mLmin-1)
0,7
1
tR1=3,17
tR1=3,39
tR2=4,18
tR3=4,36
0,7
5
tR4=5,39
tR5=5,71
tR1=4,88
tR2=5,66
tR3=5,96
0,7
5
tR4=8,47
tR5=9,44

Tabla 9. Resultados de los anlisis isocrticos. A: Acetonitrilo (ACN) y B: 4% de cido actico en agua
Milli-Q.

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2. Anlisis en gradiente
A la vista de los resultados obtenidos mediante procedimientos isocrticos, se
plantea la posibilidad de realizar un gradiente con objeto de obtener la separacin
completa de los seis solutos componentes de la muestra. El primer gradiente que se
plantea es el que se refleja en la Tabla 10. Se trata de un gradiente lineal con dos
pendientes diferentes; en los primeros 15 min ms suave y algo ms pronunciada
entre los 15 y los 30 min, de forma tambin lineal. En la Fig. 13 se representa de forma
grfica, explicando tambin el re-equilibrado programado para la recuperacin de la
columna y la vuelta a las condiciones iniciales de fase mvil.

50

% A en (A+B)

40
30

Gradiente 1

re-equilibrado

Gradiente 2
20

Gradiente 3
re-equilibrado

10
0
0

10

20

30

40

50

60

Tiempo (minutos)

Figura 13. Representacin grfica de los gradientes empleados y su correspondiente re-equilibrado.


A: Acetonitrilo (ACN) y B: 4% de cido actico en agua Milli-Q.

TIEMPO
(min)
0
10
15
20
30
45

%A

%B

5
10
15
25
40
5

95
90
85
75
60
95

Flujo
(mLmin -1)
0,7
0,7
0,7
0,7
0,7
0,7

Tabla 10. Desglose de las distintas etapas que conforman el gradiente n 1. A: Acetonitrilo (ACN) y B:
4% de cido actico en agua Milli-Q.

67

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Gradiente n 1
Cuando la mezcla de las seis substancias se cromatografa en las condiciones del
anlisis en gradiente n 1, se separan los seis picos (Fig. 14 y Tabla 11). Sus tR oscilan
entre 15,24 min y 27,91 min y entre todos ellos se logra resolucin. El clculo exacto
de k, Rs, y 2:1, as como de N, se mostrar una vez analizados los tres gradientes que
se plantean. En la Fig. 15 se observa el cromatograma original obtenido con este tipo
de gradiente, de manera que el alumno pueda triangular los picos sobre l y calcular
matemticamente los parmetros.
Cromatograma obtenido mediante las condiciones de anlisis del gradiente n1

Figura 14. Cromatograma del anlisis en el gradiente n 1 de la mezcla de los seis fenoles.

Pico (nmero)

Resultado (%)

tR (min)

Cuentas de rea ( 106)

1
2
3
4
5
6

28,65
19,96
6,58
21,37
13,13
9,91

15,24
16,46
19,01
21,14
26,15
27,91

168,94
117,67
38,79
126
77,44
58,44

Tabla 11. Tabla del cromatograma del anlisis en el gradiente n 1 de la mezcla de los seis fenoles.

68

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Figura 15. Ampliacin del cromatograma del anlisis en el gradiente n 1 para la triangulacin de
picos.

Gradiente n 2
El gradiente n 2 es un gradiente lineal en 30 min de anlisis donde se comienza
en ausencia de disolvente fuerte (ACN) y ste alcanza un 30% en 30 min (Tabla 12). La
Fig. 13 muestra el re-equilibrado de 15 min en este tipo de gradiente.
TIEMPO
(min)

%A

%B

Flujo
(mLmin -1)

0
30
45

0
30
0

100
70
100

0,7
0,7
0,7

Tabla 12. Desglose de las distintas etapas que conforman el gradiente n 2. A: Acetonitrilo (ACN) y B:
4% de cido actico en agua Milli-Q.

La muestra de los seis analitos cromatografiada en las condiciones del anlisis en


gradiente n2 se resuelve en seis picos que se corresponden con los seis cidos
fenlicos. Los tR oscilan entre 17,80 min y 31,18 min, apareciendo todos ellos resueltos
entre s (Fig. 16 y Tabla 13). El clculo exacto de k, Rs, y 2:1, as como de N, se
mostrar una vez analizados los tres gradientes que se plantean. En la Fig. 17 se
observa el cromatograma original obtenido con este tipo de gradiente, de manera que
el alumno pueda triangular los picos sobre l y calcular matemticamente los
parmetros.
Cromatograma obtenido mediante las condiciones de anlisis del gradiente n 2

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Unidades de Absorbancia

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Tiempo (minutos)

Figura 16. Cromatograma del anlisis en el gradiente n 2 de la mezcla de los seis fenoles.

Pico (nmero) Resultado (%)


1
2
3
4
5
6

21,68
17,77
12,4
19,18
18,92
9,31

tR (min)

Cuentas de rea ( 106)

17,8
19,75
21,64
23,74
28,85
31,18

115,19
94,4
65,9
101,88
100,53
49,49

Tabla 13. Tabla del cromatograma del anlisis en el gradiente n 2 de la mezcla de los seis fenoles.

Figura 17. Ampliacin del cromatograma del anlisis en el gradiente n 2 para la triangulacin de
picos.

70

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Gradiente n 3
El gradiente n 3 es un gradiente de tipo cncavo porque durante dos min
mantiene la ausencia del disolvente fuerte (Tabla 14 y Fig. 13). A partir de ese tiempo
existe un incremento casi lineal del porcentaje de ACN hasta conseguir un 80% en 25
min. Despus se mantiene en estas condiciones durante otros 15 min. Tambin se
muestra el re-equilibrado de la columna que permite que las sucesivas inyecciones
sean repetitivas.
TIEMPO
(min)

%A

%B

Flujo
(mLmin -1)

0
2
25
40
55

0
0
20
20
0

100
100
80
80
100

0,7
0,7
0,7
0,7
0,7

Tabla 14. Desglose de las distintas etapas que conforman el gradiente n 3. A: Acetonitrilo (ACN) y B:
4% de cido actico en agua Milli-Q.

En la Fig. 18 y en la Tabla 15 se muestran los resultados de la separacin de los


seis analitos en las condiciones de anlisis en gradiente n 3. Los t R de los picos oscilan
entre los 20,28 min y los 37,22 min. Como se observa, aunque todos los picos estan
bien resueltos entre s, los tiempos de retencin son mayores que los obtenidos en
otras condiciones de gradiente planteadas.

Unidades de Absorbancia

Cromatograma obtenido mediante las condiciones de anlisis del gradiente n 3

Tiempo (minutos)

Figura 18. Cromatograma del anlisis en el gradiente n 3 de la mezcla de los seis fenoles.

71

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Pico (nmero) Resultado (%)


1
21,85
2
18,13
3
6,61
4
17,85
5
17,73
6
9,16

tR (min)
20,28
23,99
25,53
28,36
33,69
37,22

Cuentas de rea ( 106)


119,1
9,88
3,6
9,73
9,66
4,99

Tabla 15. Tabla del cromatograma del anlisis en el gradiente n 3 de la mezcla de los seis fenoles.

A la vista de los resultados obtenidos, se procede a realizar una cuantificacin de


los parmetros de retencin ms importantes, as como de la eficiencia obtenida para
cada pico. Se han escogido los gradientes n 1 y n 2 para la cuantificacin ya que,
como se explicaba anteriormente, el tiempo de anlisis se alarga excesivamente
cuando se utiliza el gradiente n 3. No obstante, ste ltimo gradiente resulta
interesante en el sentido de permitir una discusin con los alumnos en torno a que la
mejor separacin cromatogrfica es la que se lleva a cabo en el menor tiempo y con los
mejores resultados de resolucin.
En la Tabla 16 se resumen los resultados en cuanto a t R de los picos obtenidos en
los tres tipos de gradiente.
Gradiente
(n)
1
2
3

n picos
6
6
6

tR pico 1
(min)
15,24
17,8
20,28

tR pico 2
(min)
16,46
19,75
23,99

tR pico 3
(min)
19,01
21,64
25,53

tR pico 4
(min)
21,14
23,74
28,36

tR pico 5
(min)
26,15
28,84
33,69

tR pico 6
(min)
27,91
31,18
37,22

Tabla 16. Tiempos de retencin de cada uno de los seis picos de la mezcla de seis fenoles, obtenidos
en cada uno de los tres gradientes realizados.

ANLISIS DE LOS GRADIENTES 1 Y 2


Utilizando los cromatogramas originales ampliados (Figs. 15 y 17), el alumno
puede hacer la triangulacin de los picos segn se explic en la Parte I. Para ello, hay
que tener en cuenta cul ha sido la ampliacin y proporcionar la escala utilizada. Una
vez triangulados los picos, se calcularn matemticamente algunos de los parmetros
de retencin (k, Rs, y 2:1) y la eficiencia (N).
Nota importante
Los valores que se muestran en las Tablas 17 y 18, se han obtenido como
resultado de la triangulacin de cada uno de los seis analitos de la muestra problema
en los diferentes gradientes, una vez ampliado el cromatograma (Figs 15 y 17), para
72

Reduca (Biologa). Serie Tcnicas y Mtodos. 4 (3): 48-78, 2011.


ISSN: 1989-3620

mayor comodidad en el tratamiento de las medidas. Cualquier alteracin de la imagen


que pudiera modificar estas medidas, repercutira en los resultados. Se recomienda,
por tanto, que la impresin en papel se haga conservando el tamao del
cromatograma.
Gradiente 1
En la Tabla 17 se muestran los resultados de los parmetros de retencin y
eficiencia obtenidos mediante la triangulacin de los picos sobre la Fig. 15, en las
condiciones del anlisis isocrtico n 1. En este caso, 1 min equivale a 17,2 mm.
b

tR

tM

tR

tR

pico

(mm)

(min)

(min)

(min)

(mm)

(mm)

1
2
3
4
5
6

7,5
8
8
7,5
6
5,5

0,44
0,47
0,47
0,44
0,35
0,32

15,24 3,46 262,09 11,78


16,46
283,04
13
19,01
327,06 15,56
21,14
363,61 17,68
26,15
449,75 22,69
27,91
480
24,45

Rs (1)

2:1

Rs (2)

3,41 19.539
------3,76 20.028 1,1 2,68 2,54
4,5 26.742 1,2 5,42 5,58
5,12 37.607 1,14 4,68 5,68
6,57 89.898 1,28 12,68 14,23
7,07 121.865 1,08 5,26 5,66

*1 min =17,2 mm

*1min = 17,2 mm

Tabla 17. Clculo de algunos parmetros cromatogrficos relacionados con la retencin, resolucin y
eficiencia de los solutos, analizados segn las condiciones de fase mvil del gradiente n 1.
(1), Clculo de Rs segn la ecuacin: Rs = (2tR) / (b1 + b2).
(2), Clculo de Rs segn la ecuacin: Rs = (N / 4) ( / -1)(k2 /1+ k2).

Gradiente 2
En la Tabla 18 se muestran los resultados de los parmetros de retencin y
eficiencia obtenidos mediante la triangulacin de los picos sobre la Fig. 17, en las
condiciones del anlisis isocrtico n 2. En este caso, 1 min equivale a 13,6 mm.
b

tR

tM

tR

tR

pico

(mm)

(min)

(min)

(min)

(mm)

(mm)

1
2
3
4
5
6

8
7
7
7
8
8

0,59
0,51
0,51
0,51
0,59
0,59

17,8 4,61 242,13 13,19 2,86


19,75
168,64 15,15 3,29
21,64
294,37 17,04 3,7
23,74
322,93 19,14 4,15
28,85
392,31 24,24 5,26
31,18
424,02 26,57 5,77

14.657
23.565
28.295
34.052
38.476
44.948

2:1

--1,15
1,12
1,12
1,27
1,1

Rs (1)

Rs (2)

--3,54
3,7
4,12
9,29
3,95

--3,84
3,54
3,98
8,76
4,11

*1 min =13,6 mm

*1min = 13,6 mm

Tabla 18. Clculo de algunos parmetros cromatogrficos relacionados con la retencin, resolucin y
eficiencia de los solutos, analizados segn las condiciones de fase mvil del gradiente n 2.
(1), Clculo de Rs segn la ecuacin: Rs = (2tR) / (b1 + b2).
(2), Clculo de Rs segn la ecuacin: Rs = (N / 4) ( / -1)(k2 /1+ k2).

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El anlisis comparativo de los resultados sobre parmetros de retencin y


eficiencia obtenidos mediante el uso de los gradientes 1 y 2, mostrados en las Tablas
17 y 18, respectivamente, nos permite sacar las siguientes conclusiones:
El gradiente n1 permite la separacin de todos los compuestos en 28 min
mientras que en el gradiente n2 se necesitan 31 min. En el gradiente n 1 los picos
eluyen entre 15,24 min y 27,91 min, es decir, en 12,67 min. En el gradiente n 2 los
picos eluyen entre el min 17,80 y el min 31, 18, es decir, en 13,38 min. Por tanto, en
este sentido son bastante parecidos ambos gradientes.
El factor de capacidad (k) oscila entre 3,41 y 7,07 en el gradiente n 1 y entre
2,86 y 5,77 en el gradiente n 2. En ambos casos el valor es alto y diferente para cada
analito.
La selectividad ( ) es mayor entre los picos 1 y 2 y entre los picos 5 y 6 en el
gradientes n 2 que en el gradiente n 1. Entre el resto de las parejas de picos, es
mayor en el gradiente n 1. Parece por tanto que el gradiente n 1 de fase mvil
permite una mayor selectividad, en trminos generales.
La resolucin (Rs), entre las parejas de picos contiguos, es siempre superior a 1,5
lo que indica que los picos estn resueltos hasta lnea base en ambos tipos de
gradiente. Excepto el valor de Rs, calculada como Rs = (2tR) / (b1 + b2) entre los
picos 1 y 2 (3,54) en el gradiente n 2, en el resto de los casos siempre es mayor en
el gradiente n 1.
La eficiencia de todos los picos (N), excepto el del que eluye en primer lugar, es
siempre superior en el gradiente n 1 que en el gradiente n 2, por tanto, las
condiciones de fase mvil empleadas en el gradiente n 1 permiten separaciones ms
eficientes que en el gradiente n 2.
En definitiva, sin ser inadecuado el gradiente n 2, parece que sera ms
conveniente utilizar en gradiente n 1 para la separacin de estos seis analitos. La
diferencia principal entre los dos gradientes estriba en el hecho de que en el gradiente
n 1 la fase mvil inicial tiene un 5% de ACN y alcanza en 30 min un 40 % mientras que
el gradiente n 2 comienza con una fase mvil sin ACN y ste slo alcanza un valor del
30% en el mismo espacio de tiempo. Por tanto, parece deducirse que es necesario un
cierto valor de fuerza eluotrpica inicial que permita la salida ms temprana de los
analitos y adems lo hagan con mayor eficiencia. De hecho, la concavidad del
gradiente n 3 retrasa la elucin de los picos en casi 7 min (Fig. 13 y Tabla 12) respecto
a los otros dos gradientes. Se han calculado estos parmetros de retencin y eficiencia
como los ms significativos aunque se pueden calcular otros muchos.
ORDEN DE ELUCIN DE LOS SEIS ANALITOS EN EL GRADIENTE 1
Para establecer el orden de elucin en la mezcla de analitos hay que tener en
cuenta varios factores:

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1 La naturaleza de la fase estacionaria, en este caso apolar.


2 La naturaleza polar de la fase mvil en funcin del gradiente aplicado.
3 La masa molecular del analito.
4 La zona apolar del analito susceptible de interaccionar con la fase estacionaria
(efecto solvfobo).
5 El nmero y la naturaleza de las funciones polares de cada analito.
Anlisis de las caractersticas de los analitos a separar
El cido clorognico (Fig. 3) es el analito de mayor masa molecular (354,31) y el
que mayor nmero de grupos polares (8) posee, a gran distancia del resto de las
molculas en la mezcla. Sin embargo, no slo la elevada masa molecular, sino tambin
el efecto solvfobo juega en su contra, ya que posee dos ncleos de 6C, uno saturado y
otro insaturado y una cadena isoprnica tetra-atmica. En otras palabras, su gran
superficie apolar debe interaccionar fuertemente con la fase estacionaria,
compensando en gran manera la afinidad de sus ocho grupos polares por la fase mvil
en su ms alto grado de polaridad, al comienzo del gradiente ACN:4% cido actico en
agua Milli-Q (5:95, v/v). Adems, como el porcentaje de ACN va aumentando la
apolaridad de esta fase, debe esperarse que la elucin del analito se retrase a favor de
otros que posean menor superficie apolar (menor efecto solvfobo por tanto) y
suficiente nmero de grupos polares. Hay que hacer notar que el cido clorognico es,
adems, el nico analito de la mezcla que no posee ninguna funcin carboxilo.
Cul sera la alternativa, si es que existe, en la mezcla? El resto de los analitos
(Fig. 3) tiene masas moleculares muy semejantes, variando en un margen muy
estrecho, tres de ellas entre 180,2 y 198,2 y otras dos entre 138,1 y 164,2. Todas ellas
tambin, salvo los cidos cafeico y ferlico que tienen tres, poseen dos funciones
polares, siendo siempre una de ellas un grupo carboxilo. Pero an con respecto a esta
ltima caracterstica, hay una variacin significativa. Este carboxilo est en un
sustituyente monocarbonado (cidos p-hidroxibenzoico y sirngico) o en una cadena
insaturada de 3C (cidos p-cumrico, cafeico y ferlico). A su vez, los cidos ferlico y
sirngico poseen una y dos funciones metoxilo respectivamente, lo que aumenta su
apolaridad. Por tanto, la nica alternativa frente al cido clorognico como primer
analito eluido sera el cido p-hidroxibenzoico, ya que posee la masa molecular ms
pequea de la serie (138,1), un nico anillo bencnico como nico soporte del efecto
solvfobo y dos funciones polares, siendo una de ellas un carboxilo que aparece como
sustituyente monocarbonado. Por lo tanto, el cido p-hidroxibenzoico sera el primer
analito eludo (tR = 15,24 min) y el segundo, el cido clorognico (tR = 16,46 min); ver
Tabla 17.
Por una razn semejante a la descrita, el cido sirngico debera ser el tercer
analito eluido. Sin embargo, dos grados de metoxilacin no slo aumentan su
apolaridad sino tambin su masa molecular. Jugara a favor suyo un sustituyente
carboxilo monocarbonado, ms polar que la misma funcin en una cadena 3C
insaturada. En resumen, el cido cafeico, de masa molecular 180,2, un ncleo
bencnico y una cadena insaturada de 3C, pero con tres funciones polares y ningn

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sustituyente metoxilo, tendra mayor polaridad y sufrira menor retencin debida al


efecto solvfovo que el cido sirngico. Por tanto, el cido cafeico es, en efecto, el
tercer analito eluido (tR = 19,01 min); ver Tabla 17.
A partir de este tercer analito, el efecto solvfobo aumenta con los diferentes
grados de metoxilacin, por lo que ser necesario un aumento de la apolaridad de la
fase mvil para compensar tal efecto. De los tres analitos restantes, el cido sirngico
es el nico que no aumenta de forma notable su superficie de interaccin con la fase
estacionaria apolar al no poseer una cadena 3C insaturada. Por ello, debera ser el
siguiente en eluir de la columna cuando el incremento en la proporcin de ACN en la
fase mvil sea suficiente. De hecho, la separacin experimental demuestra que el
cido sirngico es el metabolito que eluye en cuarta posicin (t R = 21,14 min), ya
netamente distanciado de los anteriores (Tabla 17). Ntese que el acido cafeico es
eluido unos minutos antes de que se alcance aproximadamente el 70% del incremento
total del contenido en ACN de la fase mvil, proporcin sta que prcticamente
coincide con la elucin del cido sirngico.
De los dos ltimos analitos que restan por salir de la columna el orden no es
dudoso. El cido ferlico es ms apolar que el cido p-cumrico gracias a una funcin
metoxilo suplementaria. El cido p-cumrico eluye en quinta posicin (tR = 26,15 min)
y, por ltimo, el cido ferlico (tR = 27,91 min); ver Tabla 17. En la Tabla 19 se
muestran los seis analitos objeto de separacin, sus masas moleculares y el orden de
elucin obtenido en el gradiente n 1.
Compuesto
cido p-hidroxibenzoico
cido clorognico
cido cafeico
cido sirngico
cido p-cumrico
cido ferlico

M.M.
138,1
354,31
180,2
198,2
164,2
194,2

Orden de elucin obtenido


1
2
3
4
5
6

Tabla 19. Orden de elucin de los seis analitos de la muestra problema en las condiciones de anlisis
del gradiente n 1.

BIBLIOGRAFA

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en: http://www.forumsci.co.il/HPLC/program.html
Study HPLC. Consultada: 3 septiembre 2011. Disponible en:
http://www.studyhplc.com/index.php
LCGCs Chrom Academy. Consultada: 3 septiembre 2011. Disponible en:
http://www.chromacademy.com/
Chemguide. Consultada: 3 septiembre 2011. Disponible en:
http://www.chemguide.co.uk/
HPLC. Consultada: 3 septiembre 2011. Disponible en:
http://www.separationsnow.com/coi/cda/list.cda?catId=2737&type=Link&sort=
az&chId=4
Recibido: 14 junio 2010.
Aceptado: 3 de agosto 2011.

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