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ISSN: 1989-3620
INTRODUCCIN
tM Ldc2/2F
48
49
Momento Dipolar,
(debyes)
Grupo Funcional
Amina
-N=
0,8 a 1,4
ter
-O-
1,2
Sulfuro
-S-
1,4
Tiol
-SH
1,4
cido Carboxlico
-COOH
1,7
Hidroxilo
-OH
1,7
Halgenos
-F
-Cl
1,6 a 1,8
-Br
-I
ster
-COO-
2,3
Aldehdo
-CHO-
2,5
Cetona
-CO-
2,7
Nitro
-NO2-
3,2
Nitrilo
-C=N-
3,5
Sulfxido
-SO-
3,5
CADENA HIDROCARBONADA
DE LA FASE ESTACIONARIA
PARTE POLAR
REDUCCIN DE CAVIDAD
EN EL DISOLVENTE
Figura 1. Ilustracin esquemtica de la asociacin entre una molcula de un soluto que contiene una
parte polar y otra apolar con una cadena hidrocarbonada de la fase estacionaria, efecto solvfobo. Las
flechas rellenas en color gris indican las fuerzas que tienden a unir y las flechas vacas, las fuerzas que
tienden a separar.
50
0,5 k 20
Rs 2
P 15 MPa (150 bar)
0,9 factor asimetra (As)
1,5
51
1
2
3
4
5
6
7
8
9
CONCENTRACIN
INICIAL DE
A EN (A+B)
TIEMPO
53
ndice de
refraccin
Lmite
inferior de
transparencia
en el UV
Punto de
ebullicin
( C)
Viscosidad a
20 C (cP)
Parmetro
de
Hildebrand
iso-octano
n-hexano
ciclohexano
n-decano
tetracloruro de
carbono
iso-propil ter
tolueno
benceno
cloroformo
diclorometano
cloruro de
metileno
tetrahidrofurano
dicloruro de
etileno
metil etil cetona
Acetona
Acetonitrilo
Acetato de etilo
1,404
1,375
1,427
1,412
197-210
195
200
210
99,2
68,9
80,7
174,1
()
0,5
0.313
0,98
0,92
( )
7
7,3
8,2
7,8
0,4
0
0
0,3
0,01
0,01
0,04
0,04
0,01
0,03
0,04
1,466
265
76,5
0,97
8,6
1,7
0,18
0,12
1,368
1,496
1,501
1,443
1,424
220
285
280
245
232
68,3
101,6
80,1
61,2
40
0,33-0,37
0,59
0,65
0,57
0,44
7,3
8,9
9,2
9,2
9,6
2,2
2,3
3
3,4-4,4
3,4
0,28
0,29
0,32
0,36-0,4
0,4
0,22
0,23
0,25
0,26
0,32
1,424
233
39,8
0,44
9,7
3,4
0,42
0,32
1,408
212-230
66
0,55
9,1
4,2
0,45
0,35
1,445
230
83,5
0,79
9,7
3,7
0,49
0,38
1,379
1,359
1,344
1,37
330
330
190
256
80
56,3
81,6
77,1
0,43
0,32
0,37
0,46-0,47
9,3
9,6
11,7
9,1
4,5
5,4
6,2
4,3
0,51
0,56-0,58
0,55-0,65
0,58
0,39
0,47-0,53
0,46
0,41
Acetato de metilo
1,362
260
56,3
0,37-0,45
9,2
4,4
0,6
Dimetil sulfxido
Piridina
2-metoxietanol
2-propanol
Etanol
Metanol
cido actico
agua
1,478
1,51
1,401
1,38
1,361
1,329
1,372
1,333
305-330
220
210+
205-210
205
210
180
189
115,3
124,6
82,4
117,7
78,3
64,7
117,9
2,24
0,94
1,72
2,35
1,2
0,6
1,1-1,26
1
12,8
10,7
6,5
5,3
5,7
4,3
5,2
6,6
6,2
9
0,62
0,71
0,74
0,82
0,88
0,95
alto
alto
Disolvente
12
13,7
12,4
21
Fuerza
ndice de
eluotrpica
polaridad (P)
( oenAl2O 3)
Fuerza
eluotrpica
( o en SiO 2)
0,68
0,73
(slice)= 0,77
(almina)
Siempre y cuando los disolventes sean miscibles (ver Tabla. 3), se pueden hacer
combinaciones binarias, ternarias o incluso cuaternarias variando las proporciones de
cada uno de ellos con objeto de obtener una amplia gama de valores de o. Aunque
54
%mezcla=
o
1
%1 +
o
2
%2
, mayor es la polaridad
55
c) Si una vez realizado el paso anterior, se elige hacer un gradiente, eliminar las
porciones de ste, anterior a la elucin del primer pico y posterior a la elucin
del ltimo pico. Hacer entonces el mismo gradiente mencionado en b).
d) Si la separacin que se obtiene es aceptable, hay que intentar reducir el tiempo
del gradiente para reducir el tiempo de anlisis. Si la separacin no es aceptable
intentar otro tipo de gradiente no lineal.
Una vez terminado el anlisis en gradiente, la columna debe ser equilibrada de
nuevo antes de hacer la siguiente inyeccin. Para ello se realiza un re-equilibrado
que consiste en volver a las condiciones iniciales de composicin de la fase mvil.
Normalmente se realiza en unos 20 minutos pero es el cromatografista quien lo decide
en funcin de las propiedades de la muestra y el sistema cromatogrfico.
En la prctica que se plantea a continuacin, se realizarn eluciones con fases
mviles isocrticas y en gradiente, sin modificaciones de la fase estacionaria ni
variacin de la temperatura con objeto de obtener los valores ms indicados de k.
56
OBJETIVO DE LA PRCTICA
MATERIAL Y MTODOS
Equipo cromatogrfico. Cromatgrafo de Lquidos de Alta Resolucin
Cromatgrafo lquido. Spectra Physics 8810 (Thermo Electron Corporation, Asheville,
NC, USA), con un loop de inyeccin de 20 L.
Bomba. SP 8810 LC (Thermo Electron Corporation, Asheville, NC, USA), elctrica
alternante de pistn recproco.
Fase estacionaria.
Columna: Mediterranea sea C18 (Teknokroma, S.C.L. Spain).
Tipo: Fase Reversa.
Longitud (L): 120 mm.
Dimetro de partcula (dp): 5m.
Dimetro interno (di): 4,6 mm.
Temperatura. 25oC.
Fase mvil.
Reservorio A: Acetonitrilo (ACN).
Reservorio B: 4% de cido actico en agua Milli-Q.
Fase mvil: Segn se especifique en cada condicin.
Flujo de fase mvil: Segn se especifique en cada condicin, en (mLmin 1).
57
O
HO
O
OH
O
HO
OH
OH
cido clorognico
(M.M.=354,31)
COOH
CH=CH-COOH
CH3 O
CH3 O
OCH3
OH
OH
cido ferlico
(M.M.=194,2)
cido sirngico
(M.M.=198,2)
CH=CH-COOH
COOH
CH=CH-COOH
HO
OH
cido p-hidroxibenzoico
(M.M.=138,1)
OH
cido cafeico
(M.M.=180,2)
OH
cido p-cumrico
(M.M.=164,2)
Figura 3. Estructura molecular de los cidos clorognico, ferlico, sirngico, p-hidroxibenzoico, cafeico
y p-cumrico.
58
Composicin cuantitativa
La concentracin de todos ellos, excepto la de cido clorognico, es igual, 0,16
mgmL-1, lo que da una masa inyectada de 3,3 ng. El cido clorognico se prepara a una
concentracin casi tres veces mayor, 0,5 mgmL-1, que da una masa inyectada de 10 ng.
La composicin cuantitativa de la muestra se muestra en la Tabla 4.
Sustancia
Concentracin
(mgmL-1)
Masa inyectada
(ng)
cido cafeico
cido clorognico
cido ferlico
cido p-cumrico
cido p-hidroxibenzoico
cido sirngico
0,16
0,5
0,16
0,16
0,16
0,16
3,3
10
3,3
3,3
3,3
3,3
RESULTADOS Y DISCUSIN
Lo primero que debe realizarse, como en los casos anteriores, es un espectro de
absorbancia de cada uno de los analitos disueltos en 4% cido actico en agua MilliQ:ACN (80:20, v/v). En las Figs. 4 a 9 se muestran estos espectros. Excepto los cidos
sirngico y p-hidroxibenzoico que slo muestran un mximo principal de absorbancia,
todos tienen dos mximos, uno en el entorno de 235-240 nm y el otro a 325-330 nm.
Sobre esta base, se elige una longitud de onda de anlisis a la que todos los analitos
muestren una cierta absorbancia. La situacin de compromiso que se acepta es 280
nm, aunque podra haberse escogido otra longitud de onda en el entorno, siempre
teniendo en cuenta los criterios de absortividad de todos los analitos presentes en la
muestra problema.
59
-1
Figura 4. Espectro de absorcin del cido clorognico a una concentracin de 5 gmL disuelto en 4%
cido actico en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v). Sobre la curva, los nmeros 1 y 2 representan los
mximos de absorcin a 235 nm y 330 nm respectivamente.
-1
Figura 5. Espectro de absorcin del cido ferlico a una concentracin de 5 gmL disuelto en 4%
cido actico en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v). Sobre la curva, los nmeros 1 y 2 representan los
mximos de absorcin a 240 nm y 325 nm respectivamente.
60
-1
Figura 6. Espectro de absorcin del cido sirngico a una concentracin de 5 gmL disuelto en 4%
cido actico en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v). Sobre la curva, el nmero 1 representa el mximo
principal de absorcin a 280 nm.
-1
Figura 7. Espectro de absorcin del cido p-hidroxibenzoico a una concentracin de 5 gmL disuelto
en 4% cido actico en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v). Sobre la curva, el nmero 1 representa el
mximo principal de absorcin a 256 nm.
61
-1
Figura 8. Espectro de absorcin del cido cafeico a una concentracin de 5 gmL disuelto en 4%
cido actico en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v). Sobre la curva, los nmeros 1 y 2 representan los
mximos de absorcin a 235 nm y 325 nm respectivamente.
-1
Figura 9. Espectro de absorcin del cido p-cumrico a una concentracin de 5 gmL disuelto en 4%
cido actico en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v). Sobre la curva, los nmeros 1 y 2 representan los
mximos de absorcin a 235 nm y 310 nm respectivamente.
62
Una vez escogida la longitud de onda de anlisis, 280 nm, sin modificar la fase
estacionaria, se procede a trabajar con diferentes fases mviles. Segn se coment,
estas fases pueden ser constantes en su composicin a lo largo del tiempo de anlisis
(procedimiento isocrtico) o variar a lo largo del tiempo (procedimiento en gradiente).
Si vamos de lo ms sencillo a lo ms complejo, debemos empezar por los anlisis
isocrticos.
1. Anlisis isocrticos
Se plantean tres tipos de anlisis isocrticos, segn se muestra a continuacin en
la Tabla 5.
Anlisis
Reservorio Reservorio
Flujo
isocrtico (n)
A (%)
B (%)
(mLmin-1)
1
2
3
70
30
20
30
70
80
0,7
0,7
0,7
Tabla 5. Anlisis isocrticos planteados. A: Acetonitrilo (ACN) y B: 4% de cido actico en agua Milli-Q.
63
Unidades de Absorbancia
ISSN: 1989-3620
Tiempo (minutos)
Figura 10. Cromatograma de la mezcla de los seis fenoles, realizado segn las condiciones del anlisis
isocrtico n 1, con una composicin de fase mvil: ACN: 4% cido actico en agua Milli-Q) (70:30, v/v)
-1
y una velocidad de flujo 0,7 mLmin .
Pico (nmero)
Resultado (%)
tR (min)
99,5
3,17
318,07
Tabla 6. Tabla del cromatograma de la mezcla de los seis fenoles, realizado segn las condiciones del
anlisis isocrtico n 1, con una composicin de fase mvil: ACN: 4% cido actico en agua Milli-Q
-1
(70:30, v/v) y una velocidad de flujo 0,7 mLmin .
64
Unidades de Absorbancia
ISSN: 1989-3620
Tiempo (minutos)
Figura 11. Cromatograma de la mezcla de los seis fenoles, realizado segn las condiciones del anlisis
isocrtico n 2, con una composicin de fase mvil: ACN: 4% cido actico en agua Milli-Q (30:70, v/v)
-1
y una velocidad de flujo 0,7 mLmin .
16,17
8,38
44,31
20,96
10,18
tR (min)
3,39
4,18
4,36
5,39
5,71
57,66
29,89
158,03
74,74
36,3
Tabla 7. Tabla del cromatograma de la mezcla de los seis fenoles, realizado segn las condiciones del
anlisis isocrtico n 2, con una composicin de fase mvil: ACN: 4% cido actico en agua Milli-Q
-1
(30:70, v/v) y un flujo 0,7 mLmin .
65
Unidades de Absorbancia
ISSN: 1989-3620
Tiempo (minutos)
Figura 12. Cromatograma de la mezcla de los seis fenoles, realizado segn las condiciones del anlisis
isocrtico n 3, con una composicin de fase mvil: ACN: 4% cido actico en agua Milli-Q (20:80, v/v)
-1
y una velocidad de flujo 0,7 mLmin .
Pico (nmero)
Resultado (%)
tR (min)
1
2
3
4
5
20,9
8,21
54,48
9,7
6,72
4,88
5,66
5,96
8,47
9,44
59,8
23,49
155,9
27,76
19,22
Tabla 8. Tabla del cromatograma de la mezcla de los seis fenoles, realizado segn las condiciones del
anlisis isocrtico n 3, con una composicin de fase mvil: ACN: 4% cido actico en agua Milli-Q
-1
(20:80, v/v) y un flujo 0,7 mLmin .
Anlisis Isocrtico
(n)
1
Reservorio A
(%)
70
Reservorio B
(%)
30
30
70
20
80
Flujo
Tiempos de
n de picos
retencin (min)
(mLmin-1)
0,7
1
tR1=3,17
tR1=3,39
tR2=4,18
tR3=4,36
0,7
5
tR4=5,39
tR5=5,71
tR1=4,88
tR2=5,66
tR3=5,96
0,7
5
tR4=8,47
tR5=9,44
Tabla 9. Resultados de los anlisis isocrticos. A: Acetonitrilo (ACN) y B: 4% de cido actico en agua
Milli-Q.
66
2. Anlisis en gradiente
A la vista de los resultados obtenidos mediante procedimientos isocrticos, se
plantea la posibilidad de realizar un gradiente con objeto de obtener la separacin
completa de los seis solutos componentes de la muestra. El primer gradiente que se
plantea es el que se refleja en la Tabla 10. Se trata de un gradiente lineal con dos
pendientes diferentes; en los primeros 15 min ms suave y algo ms pronunciada
entre los 15 y los 30 min, de forma tambin lineal. En la Fig. 13 se representa de forma
grfica, explicando tambin el re-equilibrado programado para la recuperacin de la
columna y la vuelta a las condiciones iniciales de fase mvil.
50
% A en (A+B)
40
30
Gradiente 1
re-equilibrado
Gradiente 2
20
Gradiente 3
re-equilibrado
10
0
0
10
20
30
40
50
60
Tiempo (minutos)
TIEMPO
(min)
0
10
15
20
30
45
%A
%B
5
10
15
25
40
5
95
90
85
75
60
95
Flujo
(mLmin -1)
0,7
0,7
0,7
0,7
0,7
0,7
Tabla 10. Desglose de las distintas etapas que conforman el gradiente n 1. A: Acetonitrilo (ACN) y B:
4% de cido actico en agua Milli-Q.
67
Gradiente n 1
Cuando la mezcla de las seis substancias se cromatografa en las condiciones del
anlisis en gradiente n 1, se separan los seis picos (Fig. 14 y Tabla 11). Sus tR oscilan
entre 15,24 min y 27,91 min y entre todos ellos se logra resolucin. El clculo exacto
de k, Rs, y 2:1, as como de N, se mostrar una vez analizados los tres gradientes que
se plantean. En la Fig. 15 se observa el cromatograma original obtenido con este tipo
de gradiente, de manera que el alumno pueda triangular los picos sobre l y calcular
matemticamente los parmetros.
Cromatograma obtenido mediante las condiciones de anlisis del gradiente n1
Figura 14. Cromatograma del anlisis en el gradiente n 1 de la mezcla de los seis fenoles.
Pico (nmero)
Resultado (%)
tR (min)
1
2
3
4
5
6
28,65
19,96
6,58
21,37
13,13
9,91
15,24
16,46
19,01
21,14
26,15
27,91
168,94
117,67
38,79
126
77,44
58,44
Tabla 11. Tabla del cromatograma del anlisis en el gradiente n 1 de la mezcla de los seis fenoles.
68
Figura 15. Ampliacin del cromatograma del anlisis en el gradiente n 1 para la triangulacin de
picos.
Gradiente n 2
El gradiente n 2 es un gradiente lineal en 30 min de anlisis donde se comienza
en ausencia de disolvente fuerte (ACN) y ste alcanza un 30% en 30 min (Tabla 12). La
Fig. 13 muestra el re-equilibrado de 15 min en este tipo de gradiente.
TIEMPO
(min)
%A
%B
Flujo
(mLmin -1)
0
30
45
0
30
0
100
70
100
0,7
0,7
0,7
Tabla 12. Desglose de las distintas etapas que conforman el gradiente n 2. A: Acetonitrilo (ACN) y B:
4% de cido actico en agua Milli-Q.
69
Unidades de Absorbancia
ISSN: 1989-3620
Tiempo (minutos)
Figura 16. Cromatograma del anlisis en el gradiente n 2 de la mezcla de los seis fenoles.
21,68
17,77
12,4
19,18
18,92
9,31
tR (min)
17,8
19,75
21,64
23,74
28,85
31,18
115,19
94,4
65,9
101,88
100,53
49,49
Tabla 13. Tabla del cromatograma del anlisis en el gradiente n 2 de la mezcla de los seis fenoles.
Figura 17. Ampliacin del cromatograma del anlisis en el gradiente n 2 para la triangulacin de
picos.
70
Gradiente n 3
El gradiente n 3 es un gradiente de tipo cncavo porque durante dos min
mantiene la ausencia del disolvente fuerte (Tabla 14 y Fig. 13). A partir de ese tiempo
existe un incremento casi lineal del porcentaje de ACN hasta conseguir un 80% en 25
min. Despus se mantiene en estas condiciones durante otros 15 min. Tambin se
muestra el re-equilibrado de la columna que permite que las sucesivas inyecciones
sean repetitivas.
TIEMPO
(min)
%A
%B
Flujo
(mLmin -1)
0
2
25
40
55
0
0
20
20
0
100
100
80
80
100
0,7
0,7
0,7
0,7
0,7
Tabla 14. Desglose de las distintas etapas que conforman el gradiente n 3. A: Acetonitrilo (ACN) y B:
4% de cido actico en agua Milli-Q.
Unidades de Absorbancia
Tiempo (minutos)
Figura 18. Cromatograma del anlisis en el gradiente n 3 de la mezcla de los seis fenoles.
71
tR (min)
20,28
23,99
25,53
28,36
33,69
37,22
Tabla 15. Tabla del cromatograma del anlisis en el gradiente n 3 de la mezcla de los seis fenoles.
n picos
6
6
6
tR pico 1
(min)
15,24
17,8
20,28
tR pico 2
(min)
16,46
19,75
23,99
tR pico 3
(min)
19,01
21,64
25,53
tR pico 4
(min)
21,14
23,74
28,36
tR pico 5
(min)
26,15
28,84
33,69
tR pico 6
(min)
27,91
31,18
37,22
Tabla 16. Tiempos de retencin de cada uno de los seis picos de la mezcla de seis fenoles, obtenidos
en cada uno de los tres gradientes realizados.
tR
tM
tR
tR
pico
(mm)
(min)
(min)
(min)
(mm)
(mm)
1
2
3
4
5
6
7,5
8
8
7,5
6
5,5
0,44
0,47
0,47
0,44
0,35
0,32
Rs (1)
2:1
Rs (2)
3,41 19.539
------3,76 20.028 1,1 2,68 2,54
4,5 26.742 1,2 5,42 5,58
5,12 37.607 1,14 4,68 5,68
6,57 89.898 1,28 12,68 14,23
7,07 121.865 1,08 5,26 5,66
*1 min =17,2 mm
*1min = 17,2 mm
Tabla 17. Clculo de algunos parmetros cromatogrficos relacionados con la retencin, resolucin y
eficiencia de los solutos, analizados segn las condiciones de fase mvil del gradiente n 1.
(1), Clculo de Rs segn la ecuacin: Rs = (2tR) / (b1 + b2).
(2), Clculo de Rs segn la ecuacin: Rs = (N / 4) ( / -1)(k2 /1+ k2).
Gradiente 2
En la Tabla 18 se muestran los resultados de los parmetros de retencin y
eficiencia obtenidos mediante la triangulacin de los picos sobre la Fig. 17, en las
condiciones del anlisis isocrtico n 2. En este caso, 1 min equivale a 13,6 mm.
b
tR
tM
tR
tR
pico
(mm)
(min)
(min)
(min)
(mm)
(mm)
1
2
3
4
5
6
8
7
7
7
8
8
0,59
0,51
0,51
0,51
0,59
0,59
14.657
23.565
28.295
34.052
38.476
44.948
2:1
--1,15
1,12
1,12
1,27
1,1
Rs (1)
Rs (2)
--3,54
3,7
4,12
9,29
3,95
--3,84
3,54
3,98
8,76
4,11
*1 min =13,6 mm
*1min = 13,6 mm
Tabla 18. Clculo de algunos parmetros cromatogrficos relacionados con la retencin, resolucin y
eficiencia de los solutos, analizados segn las condiciones de fase mvil del gradiente n 2.
(1), Clculo de Rs segn la ecuacin: Rs = (2tR) / (b1 + b2).
(2), Clculo de Rs segn la ecuacin: Rs = (N / 4) ( / -1)(k2 /1+ k2).
73
74
75
M.M.
138,1
354,31
180,2
198,2
164,2
194,2
Tabla 19. Orden de elucin de los seis analitos de la muestra problema en las condiciones de anlisis
del gradiente n 1.
BIBLIOGRAFA
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BIBLIOGRAFA DE CONSULTA
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RECURSOS ELECTRNICOS
Shula Levin's WebSite of HPLC and LC-MS. Consultada: 3 septiembre 2011. Disponible
en: http://www.forumsci.co.il/HPLC/program.html
Study HPLC. Consultada: 3 septiembre 2011. Disponible en:
http://www.studyhplc.com/index.php
LCGCs Chrom Academy. Consultada: 3 septiembre 2011. Disponible en:
http://www.chromacademy.com/
Chemguide. Consultada: 3 septiembre 2011. Disponible en:
http://www.chemguide.co.uk/
HPLC. Consultada: 3 septiembre 2011. Disponible en:
http://www.separationsnow.com/coi/cda/list.cda?catId=2737&type=Link&sort=
az&chId=4
Recibido: 14 junio 2010.
Aceptado: 3 de agosto 2011.
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