CONTROL MICROBIOLOGICO

PROCEDIMIENTO PARA EL MANEJO DE CEPAS

SMMIPR-015

1. OBJETO
Asegurar que las cepas de microorganismos usadas en los diferentes anlisis microbiolgicos se
manejan bajo condiciones adecuadas para evitar mutaciones o inactivaciones.
2. ALCANCE
Aplica para el personal del laboratorio de Control de Calidad encargado de la manipulacin de
cepas.
3. DEFINICIONES:

Cepas de Referencia: material biolgico de referencia certificado. La coleccin certifica

que se suministra una determinada cepa, que es un cultivo puro, estable y homogneo, y
con determinadas caractersticas fenotpicas y genotpicas. Estas pueden ser obtenidas de:

Coleccin internacional: se obtienen directamente a partir de una coleccin nacional

e internacional reconocida. Ejemplos: ATCC (American Type Culture Collection), SVM
(Foundation for the Advancement of Public and Environmental Protection), CECT
(Coleccin espaola de cultivos tipos),
CNCM (Collection Nationale Cultures
Microorganismes) lnst.Pasteur, Fance, NCCB (The Netherlands Culture Collection of
Bacteria, Holanda), NRRL: (ARS Culture Collection, USA), UKNCC: (United Kingdom
National Culture Collections, (Reino Unido).

Proveedores comerciales: proveedores comerciales licenciados por las empresas de

la coleccin reconocida internacional y certificados por ISO 9001.
Ejemplo:
La
empresa Microbiologics es licenciada por la ATCC para la preparacin y
comercializacin de microorganismos.

Cepas de Reserva: cepas idnticas obtenidas mediante un nico subcultivo de una cepa
de referencia suministrada por el proveedor.

Cepas de Trabajo: subcultivos primarios obtenidos de una cepa de reserva.

Cepas aisladas en Planta: corresponden a microorganismos hallados en estudios de

determinacin de la biocarga de los diferentes procesos.

Repique: se define como la transferencia de un microorganismo de un medio de cultivo a

otro.

4. GENERALIDADES:

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El manejo de estos microorganismos debe realizarse en la Cabina de Bioseguridad

dispuesta en el rea de promocin de crecimiento y teniendo en cuenta los siguientes
requerimientos:
Uniforme estril.
Uso de monogafas, mascara con filtros especiales para microbiologa y guantes
estriles.
En caso de derrames se debe tener a disposicin agentes desinfectantes como
Hipoclorito de sodio al 1% acido perclrico al 1%; el cual se deposita sobre el
derrame se deja actuar por ms de 5 minutos y se recoge con la ayuda de una
servilleta, para proceder a esterilizar y descarta.
Dentro del rea evitar movimientos bruscos y contacto de los guantes con partes del
cuerpo.
Al finalizar desinfectar toda el rea con la solucin que corresponda.
Al salir del rea lavar muy bien las manos y el rostro.

Con el objetivo de evitar cambios en las caractersticas de los cultivos de referencia, el

nmero de repiques a partir de la cepa de referencia, dependiendo del pase que se haya
comprado, debe ser limitado y no puede exceder al 5 pase.

La manipulacin y modo de conservacin de los cultivos de referencia tienen que cumplir:

La pureza supone ausencia de contaminacin, lo que se consigue trabajando en

condiciones aspticas.
La autenticidad requiere disponer de personal calificado con buenos conocimientos en
Microbiologa.
La estabilidad est inversamente relacionada con el nmero de subcultivos, por lo que
stos deben reducirse al mnimo.

5. PROCEDIMIENTO
5.1 Ingreso al laboratorio: Toda cepa de referencia debe estar acompaada del certificado de
calidad, copia de la factura de compra o remisin y estos documentos se almacenan en la
carpeta de certificados del laboratorio de Control Calidad.
5.2 Registro: Cada vez que se utilice una cepa de referencia o de trabajo, se debe diligencias el
formato SMMIFO-020 REGISTRO Y CONTROL DE CEPAS.
5.3 Rotulacin:
Nombre
N Control
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Fecha De Apertura
Fecha De Vencimiento
Condiciones De Almacenamiento
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Pictograma De Peligro

5.4 Almacenamiento: Almacenar en condiciones que no afecten sus caractersticas (Segn

indicaciones del proveedor o rtulo del recipiente).
Cuando la nevera en la que se almacenan las cepas de referencia, salga de funcionamiento,
estas deben ser trasladadas a otra nevera hasta que sea reparada la nevera destinada a su
almacenamiento.
5.5 Reposicin Solicitar a compras las cepas de referencia por cercana de fecha de vencimiento
cantidad prxima a agotarse.
5.6 Reconstitucin Seguir las instrucciones de: activacin, siembra,
medios de cultivo,
condiciones de incubacin y el procedimiento indicado para cada microorganismo dadas por el
proveedor.
5.7 Condiciones de incubacin de las cepas de microorganismos
Microorganismo
S. Aureus
E. Coli
B. Subtilis
P. Aeruginosa
C. Albicans
A. Brasiliensis

Condiciones de incubacin de cepas

Agar

Temperatura

Tiempo

Casoy

30 - 35 C

3 das

Sabouraud

20 - 25 C

5 das

Tabla N 1. Condiciones de incubacin de las cepas

5.8 Almacenamiento de cepas
Almacenamiento de cepas
Microorganismo

Liofilizados
Cepas activadas

S. Aureus
E. Coli
B. Subtilis
P. Aeruginosa
C. Albicans
A. Brasiliensis

Almacenar las pastillas

liofilizadas de los
microorganismos entre
2 8 C hasta su fecha
de vencimiento

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Las cepas de referencia

y las cepas de trabajo
debern almacenarse
por no ms de ocho das
entre 2 8 C despus
de incubadas

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Cepas de reserva en
cryobank a - 4 C
6 meses
10 meses
9 meses
6 meses
6 meses
4 meses

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Tabla N 2. Condiciones de almacenamiento de las cepas

6.

Reconstitucin de cepas KWICK STIKTM

Permitir que la bolsa sin abrir alcance la temperatura

ambiente. Abrir la bolsa por la muesca y retirar una
unidad de KWIK STIK.

Pinchar (slo una vez)la ampolla en la parte superior

de la KWIK-Stik '"(justo por debajo del menisco de
fluido de la ampolla) para liberar el fluido hidratante

Apretar el pellet con el lquido hasta que la suspensin

sea homognea

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Arrancar la etiqueta y adjuntarla a la placa de cultivo

primario o registro de control de calidad. No desarmar
el dispositivo durante la hidratacin

Sostener verticalmente para que el fluido fluya a travs

del mango de la torunda y en la parte inferior de la
unidad que contiene el pellet.

Saturar
el hisopo con el material hidratado
transferirlos a un medio de agar

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Inocular la placa de cultivo primario(s) haciendo rodar Utilizar un asa estril para facilitar el aislamiento de
suavemente el hisopo en ms de un tercio de la placa colonias
INMEDIATAMENTE incubar la placa de cultivo primaria inoculado a temperatura y condiciones
adecuadas para el microorganismo.
7. Obtencin de una cepa de reserva: despus de activar la cepa de referencia y obtener
crecimiento en la caja de Petri al terminar el tiempo de incubacin, proceder a preparar la cepa
de reserva:

Con la ayuda de un asa estril tomar una cantidad de

microorganismos y llevarla a un tubo de CrioBank
sumergiendo el asa en el lquido y girndola suavemente
para depositarlos en el lquido.

Cerrar el tubo para homogenizar con un leve

movimiento paralelo

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Con la ayuda de una pipeta estril retirar la

solucin de glicerol y descartarlo

Identificacin de la cepa, Tipo y N

de coleccin, fecha de realizacin
de la cepa de reserva, fecha de
vencimiento.
Almacenar a temperatura de congelacin de 0C
a -20C

8. Obtencin de una cepa de trabajo: Se obtienen por subcultivo de las Cepas de Reserva
Tomar una perla del microorganismo
requerido con la ayuda de un asa en
punta estril

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Realizar una siembra por agotamiento en

el agar que corresponda y llevar a
incubar segn el microorganismo

Despus del tiempo de incubacin se

cuenta con microrganismo para hacer las
pruebas necesarias durante 1 semana

Nota: Se debe verificar la morfologa tpica del subcultivo, realizando una tincin de gram para
observar al microscopio
Nunca subcultivarlas para sustituir a las cepas de Reserva.
8.1 Cepas aisladas en planta: Cuando se encuentre un crecimiento atpico de UFC en las
pruebas realizadas a la planta de anestsicos, y en la tincin de gram se observan
bacterias gram negativas presuntivamente esporuladas, enviar el cultivo a tipificar con un
ente externo.
8.2 Posibles causas de que no se presente crecimiento de una cepa:

Se almaceno correctamente? Refrigerar los microorganismos liofilizados entre 2 y 8C al

recibirlos.
Se hidrato correctamente la pastilla liofilizada? No incubar la suspensin hidratada.
Usar la pastilla hidratada dentro de 30 minutos.

Se utilizaron los medios correctos? Algunos microorganismos requieren medios

especiales. Es preferible activar los microorganismos liofilizados en medios no selectivos.

Incubo el microorganismo a la temperatura correcta? Verifique que su sensor reporta la

temperatura correcta.

Incubo el microorganismo el tiempo suficiente? Algunos microorganismos toman varios

das en crecer.

Contaminacin:

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Resultados de ensayo inesperados:

Hizo crecer el microorganismo en caldo? Los contaminantes se multiplican

rpidamente en caldo, es mejor activarlos en agar.

Se reemplaz el microorganismo correctamente? Nunca hacer las pruebas durante

el crecimiento de la pastilla. El subcultivo repetido puede provocar mutacin. Usar
siempre un crecimiento fresco.

Almacenamiento incorrecto: Si se abren los frascos fros, puede formarse condensacin

en el vial. La combinacin de la humedad y el oxgeno puede producir radicales libres
txicos que puede reducir la recuperacin de los microorganismos liofilizados.

ANEXOS
Libro: quality control microorganism EZ-product refernce guide, Microbiologic

10 FORMATOS
SMMIFO-020 Registro y control de cepas
11 BIBLIOGRAFA

http://www.microbiologics.com/site/index.html.

12 RESPONSABLES

Analista Control de Calidad encargado del rea de microbiologa

Auxiliar operativo Control de Calidad

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