14. Pruebos bioquimicas para Ia identificacién de bacterias La propiedad termorresistente es la base para la diferenciacion de algunas especies del género Pseudomonas. A) B) c) IV. REACTIVOS EMPLEADOS pnitrofenil fostato.? Preparar en concentracion del 0,1. % en agua destiladautilizando. un frasco volumé ico. 2. Guardar en un frasco de vidrio color caramelo. Evitar la exposicién ala luz 3. Rotular correctamente. Buffer Tris, 0,02 M, pH:8 1, Disolver 3.02 g (0,025 moles, peso mol, 121) detrissdlido (hidroximetil) aminometano (0 2-amino-2-hidro- ximetil-1.3-propandiol) en 100 ml aproximadamente de agua destila- da en un frasco volumétrico de un litvo. Hervir el agua destilada para que se desprenda el CO." 2. Agregar 25 ml de CH LN (0,025 moles de CIH) y cs.p. 1.000 ml con agua destilada hervida. 3. Controlar el pH; a 37° C debe ser 8. 4. Rotular correctamente. Método de utilizacién (de ambos reac- tivos).” 1. Con una torunda estévil retirar las células que se desarrollan en un medio de agar adecuado y preparar una suspension celular del organis- mo bajo sospecha, en buffer T (pH:8) con una densidad igual al N°3 del nefeloémetro de MeFar land. a) Estandarizar las densidades de células por ml b) Preparar diez tubos patron nu- merados desde el 1 hasta el 10. 1. Cada tubo contiene un multi- plo de 300.000.000 de orga- hismos por ml Numero del tubo patron por 300,000,000 es igual al mti- mero de organismos por ml (Tubo 3 = 9 x 10* cél/mb), oH Fosfatasa b—on OH paitrofenil fostato, Gncoloro) Colocar 0,5 ml de la suspensién de microorganismo en buffer en dos tubos, y rotularlos tubos 1 y 2. Colocar el Tubo 1 en un baito de agua a 70°C durante 20° min EI Tubo 2 es el control no calentado. Despueés de la incubacién del Tubo 1, agregar 0,5 ml de una solucién de-prnitrofenil fosfato al 01% (in- colora) a ambos tubos. Segunda incubacién, ambos _tubos, nun bafo de agua MG, b) Desde 1h hasta el dia siguiente. es negativa (no aparece color amarillo en ninguno de los tu- bos), incubar 24 h. 7. Registrar las reacciones de color D) Control de calidad. Antes de adoptarlos para su empleo general, deben contro- Larse los reactivos con cultivos positives y negativos conocidos. El Staphylococcus epidermidis y ka P. aeruginosa constituyen Duenos controles porque se obtiencn hacilmente y no crean problemas cuan- do se los conserva como cultivos madre, epidermidis: prueba de la fostatasa negativa, no se produce fosfatasa® P. aeruginosa: prucba de la fostatasa positi- va, resistente al calor. BE) Conservacion: Guardar ambos reacti- vos en un reftigerador (a 4° C) cuando no se los emplea. Su estabilidad es variable: por lo tanto, periddicamente habra que hacer un control de calidad. desechandolos si muestran una reac- cion negativa o débil con un organismo positive conocido. F) Quimica de la accion del reactivo: El Prnitrofenil fosfato es un reactivo ineo- loro que se desclobla para dar p-nitrofe- nol (un compuesto de color amarillo) y fosfato inorginico cuando sobre él acttia ‘la enzima fosfatasa.’ Las sales coloreadas de los p-nitrofenoles se for- man con bases (buffer Tris); probable- mente son sales de una estructura quinoide.” as sales de nitrofenol son de color amarillo intenso.” Fosfato inorginico pritvoenot i (amarillo)PRUEBAS BIOQUIMICAS INDIVIDUALES Prueba de la fosfatasa alcalina termorresistente I. PRINCIPIO Determinar la actividad enzimatica termo- labil de la fosfatasa alcalina de un organismo. Il. OBJETIVO (Véase también Ia Seccin III, cap. 33) EL organismo que se va a estudiar con respecto a la actividad de la fosfatasa alcalina debe ser identificado previamente como miem- bro del género Pseudomonas. Muchos miem- bros de las Enterobacteriaceae son resistentes al calor " y esta prueba no diferencia entre el género Psewlomonay y otros géneros entéricos. Diferenciacién de especies de Pseudomonas A) Termorresistentes *: 1) Pseudomonas aeruginosa; 2) Pseudomonas pseudomallei: 3) Pseudomonas boreopalis B) Termolabiles: todas las demas especies de Pseudomonas.? III. BASES BIOQUIMICAS La enzima fosfatasa es una fosfomonoeste- rasa ® que acttia sobre los sustratos monoéste- res fosfatos.2* La hidrélisis del esterfosfato produce fosfato inorganico (Pi) y alcohol (R-OH)* El enlace entre el oxigeno y el fosforo se rompe por hidrdlisis (C-O!P), liberando el fosfato inorginico del monoéster fosfato.* La enzima_ fosfatasa alcalina tiene su actividad catalitica éptima cuando existe un pH alcalino, de alli su nombre de fosfatasa alealina* Algunas enzimas fosfatasas alealinas son resistentes al calor, mientras que otras son destruidas cuando son sometidas a una temperatura cle 70° C durante cierto tiempo. ° Po ° Fostito inorginien H oH Fosfatasa alealina 5 Wonka + HO i (Hidrilisis) oO Ester de fosfate onginico Fosfato, inorgainico AlcoholV. RESULTADOS La fotografia en colores de | Ios resultados puede verse en la Figura 1-1 (Apéndice 1), “VI. INTERPRETACION A) Termorresistentes: P. aeruginosa, P. seu- domallei, P. boreopotis 1. Tubo calentado: marillo). 2. Tubo de control no calentado: posi- tiva (color amarillo). B) Termolibiles: Especies de Pseudomonas que no sean las mencionadas en A). 1. Tubo calentado: negativa (incolora). 2. Tubo de control no calentado: posi- tiva (color amarillo), ©) No se trata de una especie de Psewdo- monas. 1. Tubo calentado: negativa (incolora). 2. Tubo de control no calentado: ne- gativa (incolora). Una reaccién fuertemente positiva puede producirse a la hora de la incubacién; sin embargo, una rea cin débil puede requerir la incuba- cién durante 24 h (de un dia para el otro)." positiva (color VII. PRECAUCIONES A) EL organismo debe ser identificado como miembro del género Pseudomonas antes de probar su actividad de la fosfatasa alea- lina. Muchos miembros de las Enterobac- teriaceae producen Ia enzima fosfatasa Proteus, Providence, Salmonella, Shigella, Klebsiella y Escherichia coli; y muchas de estas fosfatasas son resistentes al calor." Esta prueba silo diferencia las especies dentro del género Pseudomonas.? Todas las especies de Pseudomonas tienen flagelos polares y la prueba de OF es oxidativa para la glucosa, lo que descarta posibles 1, Bailey, R. W., and Seott, E.G. Diagnos- tie Microbiology, 2nd ed., St. Louis: C. 'Y. Mosby Company, 1966, p. $29. it 2. Cantarow, A., and Schepartz, B. Bio. chemistry, $rd ed., Philadelphia: W. B. ‘Saunders Company, 1962, p. 239. 3. Cowan, S. T., and Steel, K. J. Manual for the Identification of Medical Bacte- 6. Fosfatasa alcalina termorresistente 15 miembros de las Enterobacteriaceae. Asi- mismo las especies de Pseudomonas tienen requerimientos de temperatura variables para su crecimiento Gptimo, Muchas especies de Pseudomonas no se desarrollan a 37° C y, sin embargo, todas las especies de P. aeruginosa y P. pseudomallei crecen bien a 37°C7 B) Todas las especies dle Pyeudomonas produ cen la enzima fosfatasa, pero la mayoria son inactivadas cuando son calentadas a 70° C durante 20 min. Solamente la P. aeruginosa, P. pseudomallei y P. boreopolis son termorresistentes; otras especies de Pseudomonas son termolabiles (sensibles al calor).7 Hasta el momento no existe medio bioquimico para diferenciar la P. aeruginosa de la P. pseudomallei.? La dife- renclacién se hace seroldgicamente, util zando antigenos solubles especificos para la especie.’ ©) La enzima fosfatasa es producida por las especies de Pseudomonas y algunos miem- bros de las Enterobacteriaceae " sinica- ‘mente cuando son cultivadas en un medio que contenga una concentracién suma mente reducida de fosfato.” Por lo tanto, emplear un medio que no contenga fostato adicional, como el agar-extracto de glucosa-triptona 0 cualquier medio que no contenga mas de un 0.2 % de peptona y 0,05 % de extracto de leva- dura? D) La suspensién de células en buffer debe serincolora antes del agregado del reactivo p-nitrofenil fosfato.” Un caldo de cultivo no es conveniente como medio para la suspensin celular, ya que la peptona imparte a la suspensidn un color amarillo. Asimismo, muchas especies de Pseudoma- nas producen un pigmento amarillo yer- doso, fluoresceina, que puede ocultar una reaccién negativa.” Sin embargo, silo se forma fluoresceina cuando el cultivo se efectia en un medio que contiene fos- fato."* E) No se deben preparar suspensiones celu- lares utilizando un buffer fosfato ya que éste inhibe la actividad de la fosfatasa.? BIBLIOGRAFIA ria, Cambridge: Cambridge University Press, 1966, pp. 35 and 162 Davidson, I., and Henry, J. B. Todd- Sanford Clinical Diagnosis by Labora- tory Methods, 14th ed., Philadelphia: W.B. Saunders Company, 1969, p. 1259 Fioser, L. F., and Fieser, M. Organic16 Pruebas bioquimicas para Ia identificacién de bacterias Chemistry, 3rd ed., New York: Reinhold Publishing Corporation, 1956, p. 461, Harrow, B., and Mazur, A., Textbook of Biochemistry, 9th ed., Philadelphia: W. B. Saunders Company, 1966, pp. 111 and 144. Liu, P. V. (1966) Differentiation of patn. ogenic pseudomonads by heat resist- ance of alkaline phosphatase. Am. J. Clin, Pathol., 5, 689. Lynch, 8. S., Mellor, L. D., Spare, P. D., and Inwood, M. J. H. Medical Labo- ratory Technology and Clinical Pathot- ogy, 2nd ed., Philadelphia: W. B. Saun- ders Company, 1969, p. 307 .Noller, C. R: Chemistry of Organic Com- pounds, ard ed., Philadelphia: W. B. ‘Saunders Company, 1965, p. 555. 10, Rice, E. W. Principles and Methods of Clinicas Chemistry for Medical Technol- — ogists, Springfield, Ill: Charles C ‘homes, Publisher, 1960, pp. 38-89. 11, Torriani, A. (1960) Influence ot inor- ganic phosphate in the formation of phosphatases by Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta, $8, 460. 12, Whitmore, F. C. Organic Chemistry, New York: D. Van Nostrand Company, Inc., 1997, p. 782 18, Wilson, Sir G. S., and Miles, A. A. To- ley and Wilson's Principles of Bacteriol- ogy and Immunity, Vol. I, 5th ed., Balti- ‘more: The Williams & ‘Wilkins Com- pany, 1964, p. 639. 4Prueba de la esculina en medio con bilis I. PRINCIPIO Determinar la facultad de un organismo de hidrolizar el glucésido esculina en esculetina y glucosa, en presencia de bilis (10 a 40 %). Il. OBJETIVO (Véase también la Seccién III, cap. 32) A) Ayudar a la diferenciacién de los estrep- tococos del grupo D de otros estreptoco- cos que no pertenecen a dicho grupo. B) Ayudar a la diferenciacién de la Listeria monocytogenes (+). H Deglucost. No hidracarbonauto (B-D-glucopiranosi) Ho, oJ HOH icles) a a 2 gd gt o 4 \ Acido Hidralisis HOH he Vn HOW Eseulina (CisHyeOs) 6 ,g-glucésido-7-hidroxicumarina HI. BASES BIOQUIMICAS La esculina es un glucdsido; un acetal derivado de monosacaridos simples. Cuando un elemento que no es un hidrato de carbono se une a un aziicar por medio de un enlace acetal, el acetal resultante se denomina glucésido y la mitad no hidrocarbonada aglucona.' La aglucona esti unida al azicar madre por medio de un atomo de oxigeno (enlace glucosidico LO- )2 Los acetales son répidamente hidrolizados por los icidos; ? la base de la prueba de la esculina es la hidrélisis de la esculina en esculetina, liberando la molécula de glucosa. La produccién de esculina puede ser HOA 09 any Hon LI Ko Axghtcona Non af) ON HE Enlace ghueosidien hon Fsculinsa Glucéside (derivado acetal) Ganon a) on ee vu A F a \\oH H/, Ho SS wo? yh HOH Esculetina (aglucona) B-D-glucosa 6.7-dihidroxieumarina18 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias demostrada por cualquiera de los dos me- dios.* Método de rutina La esculetina reacciona con una sal de hierro para formar un complejo castano oscuro o negro. Elcitrato dehierro (FeCgH;O;) se incorpora al medio de esculina con bilis en una concentracién del 0,05 % como indicador de la hidrélisis de la esculina y de la formacién de esculetina resultant HO. : Eseuletina Complejo de hier Kendilico (colar negro: feastao oscuro) ones férricos Se desconoce el mecanismo exacto, pero se supone asi on eee ie oe u 9 Método alternativo La produccién de acido con formacién de gases (CO2 y Ha) 0 sin ella en la mitad ghucosa, puede indicar también la descomposicion de la esculina. IV. MEDIO EMPLEADO: MEDIO DE ESCULINA ‘CON BILIS (pH: 7) A) Ingredientes (medio general) 1, Peptona Bg 2. Extracto de ca 3g 3. Bilis de buey 40g 4 culina 1g 5. Citrato de hierro (FeCgH3O7) 05 ¢ Agar bg 6, 5g 7. Agua destilada 1.000 ml B) Productos que se encuentran en el comercio (véase Apéndice V). 1. Pfizer: medio selectivo para enteroco- cos (MSE). 2. Difco: dos variedades. c) G H) a) Medio de esculina y bilis (MEB) b) Medio de esculina y bilis modifi- cado (MEBM) (modificacién, sin agregado de sucro equino) 3. BioQuest (BBL): medio de esculina y bilis (MEB, agar selectivo para entero ‘cocos), Diferencias generales entre los medios comerciales 1. Goncentracién de bilis. a) 40 % (Difco). b) 10 % (Pfizer y BBL). 2. Azida sédica (NaNa), 0,25 gflitro. a) Presente en Jos medios de Pfizer y BBL. b) Ausente en los medios de Difco. Método de preparacién. 1. Medir exactamente la cantidad que indica el prospecto; los diferentes productos pueden variar ligeramente. 2. Rehidratar con agua destilada o de: mineralizada 3, Calentar suavemente la solucion. 4. Colocar aproximadamente 5 ml en un tubo con tapa de rosea (16 x 125 mm), Método de esterilizacion. 1, Autoclave. 2 121°C, 15 libras, 15 min, Dejar enfiiar manteniendo el tubo énetli- nado (para obtener una gran superficie en pico de flauta. Refrigerar para su conservacién (4-10° ©). Método de inoculacién. 1. Inéculo de un caldo de Todd-Hewitt de 24 h, cultivo puro. Agregar 2 goras a la superficie del pico de flauta con na pipeta de Pasteur 0 un asa de inoculacién. Incubacién. 35° C. 48h. 1. Pueden controlarse periédicamente los tubos y si la reacts anotar el resultado. 9. Esperar hasta las 72 h antes de hacer un informe negativo.V. INTERPRETACIONES A) Prueba EB positiva (hidrélisis de la esculina): presencia de un color negro a castanio oscuro en el pico de flauta La mitad 0 mis de la superficie del medio aparece negra. i En cualquier intervalo de tiempo? B) Prueba EB negativa (hidrélisis de la esculina). 1._Nose ha producido el ennegrecimien- to del medio, 2. Ennegrecimiento de menos de la mitad del tubo después de 72 h de incuba- cion (reaccion +/-)* 3. Puede producirse crecimiento, pero esto no indica la descomposicién de la esculina; solamente indica que la con- centracién de bilis. no inhibio cl crecimiento normal de los organismos que no corresponden a los estrepto- cocos del grupo D. VI. PRUEBA RAPIDA: PRUEBA CON LA TIRA REACTIVA IMPREGNADA. CON ESCULINA Y BILIS. (PATHOTEC) A) Fabricante: General Diagnosties Division, Warner-Lambert Company B) Resultados: dentro de 1 a 4h de la cubacién. C) Método: seguir las indicaciones del fabri- cante. D) Correlacién con la prueba patron 1, 98 %* 75%! A veces, falsos positivos: * a) Excheri- chia; b) Citrobacter; ©) Proteus morganit \ veces, falsos negatives: * a) Klebsie- Ila; b) Enterobacter: 0) Serratia Esculina en medio con bilis 19 4. Dific de interpretar el color.! VII. PRECAUCIONES A) La prueba con esculina y bilis se utiliz6 originariamente para identificar a los enterococos; sin embargo, otros estrepto- cocos del grupo D y a veces que no son del grupo D y otros géneros, Arrororeus® y Listeria, pueden tolerar la concentracién de bilis y desdoblar la esculina. Las propiedades de crecimiento en medios con 40 % de bilis y acido de la esculina (hidrélisis) no son tinicas de los estrepto- cocos del grupo D, sino que son caracte risticas que comparten con la mayoria de las cepas del grupo D.! La prueba con esculina y bilis no puede ser usada para identificar a los entero- cocos, pero puede utilizarse una reaccién positiva eu enubinacivn eon otras pruchas para identificar presuutivameate a las espe- cies de Streptocorrus del grupo D. Véase la Seccién IIT, Capitulo 32, donde se halls un esquema de identificacién detallado para la diferenciacién del grupo D. Las reacciones serolégicas son el rinica medio para coufirmar ki identificacién de los estreptococos del grupo D.' No debe confiarse en una prueba aislada para identifica presunticamente a los es- treptococos del grupo D, sean entero- cocos no. Facklam ' y Facklam y col recomiendan una combina n de las pruebas con esculina ybilis y de tolerancia a la sal (crecimiento en cloruro de sodio al 65“). como puede verse en el cuadro 2-1 Las dilerencias de los medios de esculina y bilis que se encuentran en el comercio justifican las diversas reacciones de los organismos.* La azida sodica inhibe a los organismos gramnegativos, haciendo que el medio, resulte selective para los estrep- B) oi} Cuadro 2-1" MSE, MER o MEBM CING 65% + Creciniiento . No se observ No se obsersis ‘erp 1D No del gry D Crecimiento : Mentificacrin Enteracoce grape D No enteroroco, Neenteronorn Pasties Siey «#0 y. exp, Shiprocarens viridans Si son p-hemoliticas, verifiear vise trata det let grapes Si si pehemicicos, conti pare cl grupo B, Sison a oy controlar: la purer del call, con sil: volver a sislar en phe de ag sangre de earner nar la procter20 Pruebas bioquimicas pora la identificacién de bacterias tococos; sin embargo, los medios de Difco no contienen azida y no son selectivos. Los medios de cultivo de Difco contie- nen cuatro veces mas de bilis (40 %) que los de Pfizer y BioQuest (10%), y la menor concentrac de bilis es menos inhibidora para los estreptococos que no pertenecen al grupo D.' Otros estrepto= cocos, como algunas especies viridans, son capaces de descomponer la esculina: S. sanguis, S, mutans y S. anginosus (Strepto- coccus MG de la_antigua clasificaciin), pero estas especies por lo general no pueden tolerar una mayor concentracién de bilis del 40 % ¢ hidrolizar la esculina en combinacidn. No obstante, con la baja concentracin de bilis de los medios de Pfizer y BioQuest. se puede producir el crecimiento y la hidrolisis* Los estudios BIBLIOGRAFIA de Sabbaj y col” demostraron que todas las cepas de S. mutans (grupo viridans) hidrolizaban la esculina. Algunas cepas poctian crecer en bilis al 40%. pero no ke hacian en el medio con 6.5 % de sal. Ota especie de estreptococos del grupo. viri- dans que a veces podia hidrolizar la esculina y crecer en un medio de mayor concentracién era el S, sanguin. Por lo tanto, ef medio que contiene azida es mejor como medio selectivo primavio, pero aquel con mavor concen- tracion de bilis (40%) y sin azida (Difco) €s mejor para la diferenciaciin, Los est dios de Facklam * demostraron que el medio MSE. (Pfizer) no es conveniente para diferenciar con precision los estrep- tococos del grupo D- de les que no pertenecen a dicho grupo. 1. Blazevie, D. J., Schrenckenberger, P. C. and Matsen. J, M. (1973) Evaluation of the PathoTec "Rapid I-D system.” Appl Microbiol, 26, 886. 2. Cantarow, A., and Schepartz, B. Bio chemistry, 3rd ed., Philadelphia: W. B Saunders Company, 1962, pp. 10-11 3. Cowan, 8. T., and Steel, K. J. Manual for the Identification of Medical Bacteria, Cambridge: Cambridge University Press, 1966, p. 24 4, Facklam, R. (1972) Recognition of group D streptococcal species of human origin by biochemical and physiological test, Appl. Microhiol.,. 23, 1181, 5, Facklam, R. R. (1973) Comparison of sev- eral laboratory media for presumptive identification of enterococci and group D streptococei. Appl. Microbiol.,.26, 138. 6. Facklam, R. R., Padula, J. F., Thacker, L.G., Wortham, E. C., and Sconyers, B. J. (1974) Presumptive identification of group A, B, and D streptococci. Appl. Microbiol., 27, 107. 7. Norris, J. R., and Ribbons, D. W. Meth- ‘ods in Microbiology, Vol. 6A, New York: ‘Academie Press, 1971, p. 11 8. Rosner, R (1978) Evaluation of the Path ‘otec "Rapid I-D system” and two addi tional experimental reagent-impreg- nated paper strips. Appl. Microbiol., 26, 890. 8. Sabbaj. J., Sutter, V. L., and Finegold, S. M. (1971) Comparison of selective me- dia for isolation of presumptive group D streptococe! from human feces. Appl. Mie crobiol., 22, 1008Prueba de solubilidad en la bilis I. PRINCIPIO Para controlar la capacidad de las células bacterianas de producir lisis en presencia de sales biliares, en un tiempo y con una temperatura especificos. Il. OBJETIVO (Véase también la Seccién III, cap. 32) A) Se utiliza especificamente para difere! ciar entre el Streptococcus pneumoniae solu- ble en bilis y otras especies de Streptococcus alfa-hemoliticas no solubles en bil Puede ayudar a la diferenciacion del Haemophilus influenzae y el H. aegyptins solubles en bilis, de otras especies de Haemophilus insolubles en bilis, B) IIL. BASES BIOQUIMICAS Las sales biliares son sales sddicas de los cidos biliares sintetizadas de un compuesto comuin, el colesterol."" Downie y col."® sepa- raron los dciclos biliares en dos categorias: 1) Acidos no combinados cuyos diversos tipos solo difieren en su estructura quimica; 2) Jcidos coleicos, que son compuestos por adicion del acido desoxicélico y que varian de acuerdo con el tipo de agregados que se producen. Las sales biliares son dcidos biliares conju- gados con aminoacidos por medio de liga duras amidas (C=O) entre el grupo carboxi (COOH) del cido y el grupo amino (NH) de la_glicina_ (NH,CH,COOH) o Ia taurina (NH,CHsCH,SO3H).4 I aminoacido taurina deriva de otro aminoacido, la cist y su forma conju- gada con el Acido célico se denomina acido taurocélico. El acido célico conjugado con la glicina recibe el nombre de seido glicocélico, HOw coon eng oH Acide eslico chuig oo, Gomenason HO: . WW ‘ OH Acido taurncsitien22 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias El dcido desoxicslico es un dihidroxiteido; el acido célico y el taurocélico son trihidroxi- Acids. Todos los acidos biliares tienen un nticleo biisico comin, el anillo ciclopentano: perhidrofenantreno.® Ania cclopentane: pethidrolenanteeno Las sales biliares que carecen de grupos oxhidrilos (OH) son inaetions, mientras que las sales del acido desoxicélico, un compuesto dihidyoxi con grupos oxhidrilos en los carbo- nos 3 y 12, son mis activos que los trihidroxi- Jos, colico_o wurocélico, que poscen grupos oxhidrilos en los carbonos 3,7 y 12 del nicleo basico." Downie y col." afirman que la lisis rapida del S. prenmoniae por los cidos biliares esta relacionada con el ntimero y posicién de los grupos oxhidrilo y su capacidad para formar compuestos de adi- Anicas. Las sales biliares utilizadas en las pruebas de solubilidad en bilis son, por lo general, desoxicolato de sodio 0 taurocolato de socio. ya que estos dos son los compuestos liticos mis activos entre los diversos dicidos.biliares. Estos se encuentian como aniones cuando estin en un pH alealino, y por ello se los denomina sales biliates." El desoxicolato es un dcido monobasico que tiene un pH. ligeramente alcalino cuando esta en soluciin acuosa tal como una sal sddica.' Las sales biliares hacen descender ka tensién superficial en ke interfase medio-membra- na!!! y también provocan una descompo- sicién de ka membrana celular." Sin embargo. este descenso de la tension superficial no es la linica causa de lisis del S. pneumoniae; inter- vienen otros mecanismos no aclarados.'"!1 ELS, pnewnoniae produce una enzima in lular autolitica (autolisina) que hace que el organismo sulra una autdlisis rapide (lisis) cuando es cultivado en un medio atifi- cial 1-821 Mair,"® Downie y col!” y Bus rrows y Moulder * afirman que el papel de las sales biliares es acelerar el proceso autolitico natural; los acidos biliares se combinan con as células neumocécieas y las alteran de manera que la enzima autolitica es activa- da." Downie y col.!® asevéran que las sales biliares aparentemente no lisan las células neumocicicas si esti ausente la autolisina natural; ambos procesos son similares." Goe- bel_y Avery ™ sefialan, no obstante, que la accién de las sales biliares es independiente de la enzima autolitica Burrows y Moulder,* Gowan y Steel? y Dubos v Hirsch " aseguran que si-un cultivo de S. pnewnoniae es destruido por el calor (65° C. 30 min) inactivando la enzima autoli- fica, no se produce la lisis ni naturalmente ni por aclicién de sales biliares. Dubos y Hirsch afirman que la activacién por las sales biliares, de la enzima autolitiea, que se_ produce naturalmente, se debe a la alteracion o a la extraccién de un inhibidor autolitico normal de las células neumocécicas. Goebel y Avery hallaron también que ka autdlisis normal por el S. pneumoniae puede ser inhibida si se emplea una alta concentracién de sales biliares para la prueba de solubilidad en bilis. También pueden emplearse aur de sodio, dodecilsulfato de sodio y otros detergentes que hacen descender la tensién superficial para lisar el 8. pneumoniae: 1 sin embargo, el laurilsulfato es menos especi- fico que el desoxicolato de sodio."* Leifson ® dice que en algunos experimen- tos preliminares hay indices de que otros organismos, adenuis del S. pnermoniae, son solubles en el desoxicolato de sodio. sulfate IV. REACTIVOS EMPLEADOS A) Desoxicolato de sodio 0 taurocolato de sodiv (10 %). 1. Productos que existen en el comercio. aw BBL: reactivo desoxicolato.* b) Difco, 1) Desoxicolato de sodio* 2) ‘Taurocolato de sodio* El extracto comercial de bilis de buey (BBL, Difco) es bilis deshidratada que puede ser reconstituida, pero se prefiere el desoxico- lato! 2. Método de preparaci6n. a) Pesar una cantidad de sal biliar, 10 g/100 ml (concentracién 10 %). y csp. 100 ml.con agua destilada. ‘Ambas sales biliares son Cicilmente solubles en agua destilada." 1) Desoxicolato de sodio: solucion incolora.® 2) Taurocolato de sodio: solucién color dimbar clavo* b) Las sales de bilis comerciales son. neutras (pH: 7) y no requieren ajuste del pH# Las sales biliares deshidratadas que se encuentran en el comer: