Biocatlise

Biocatlise em solventes orgnicos

Maria Raquel Aires-Barros

Centro de Engenharia Biolgica e Qumica
Instituto Superior Tcnico, Av. Rovisco Pais, 1049-001 Lisboa.

1. Introduo

bioprocesso no seja condicionado pelo biocatalisador.

Os termos biocatlise ou biotransformao abrangem os

processos em que um catalisador biolgico utilizado
para converter um substrato num nmero limitado de
etapas enzimticas. Por forma a estabelecer um processo
de biotransformao ecaz, necessria a anlise detalhada
dos factores que condicionam o desenvolvimento e optimizao integrados de um processo biotecnolgico

A Bioconverso, inclui a seleco do meio reaccional, que

pode ser um meio convencional (meio aquoso) ou meios
no-convencionais, e o projecto do reactor. As caractersticas do biorreactor a utilizar devem compreender simplicidade de concepo, exibilidade, segurana de operao
e possibilidade de monitorizao e controlo de parmetros
operacionais. A concepo do biorreactor requer um
conhecimento adequado da cintica reaccional, da hidrodinmica do sistema e dos mecanismos de transferncia de
massa. No caso de bioconverses em sistemas multifsicos
devem ser ainda tomados em conta os fenmenos interfaciais, a partio do substrato e do produto entre as duas
fases e a facilidade de separao das duas fases, com vista
a uma integrao ecaz das etapas de bioconverso e de
recuperao do produto.

A estratgia de desenvolvimento e optimizao de um

Bioprocesso depende de trs contribuies: Biocatalisador,
Bioconverso e Isolamento e Puricao do Produto
(Figura 1).
Uma vez identicada a matria prima mais adequada para
substrato da bioconverso pretendida, deve seleccionar-se
o biocatalisador que apresente nveis adequados de actividade cataltica, selectividade e estabilidade para operar nas
condies seleccionadas de temperatura, fora inica, pH
e natureza da soluo tampo, concentrao de substrato
e produto e ainda na eventual presena de solventes orgnicos. Trs abordagens podem ser consideradas visando a
triagem e seleco de um biocatalisador para a converso
pretendida: (i)biocatalisadores existentes; (ii) modicao
de biocatalisadores existentes recorrendo a tcnicas de
engenharia gentica; e (iii) rastreio para isolamento de
novos biocatalisadores (clulas inteiras de extremlos ou
de enzimas derivados destes organismos).
O biocatalisador produzido por fermentao, e neste
passo geralmente requerido um hospedeiro robusto, com
um crescimento rpido, levando a densidades celulares
elevadas e nveis de expresso elevados, o que facilita a
recuperao do produto e minimiza o volume de fermentao. O crescente desenvolvimento da tecnologia de DNA
recombinado, possibilitando a expresso de enzimas em
diferentes hospedeiros, tem permitido a obteno de biocatalisadores mais adequados. Enzimas isolados ou clulas
inteiras, quer na forma livre quer na forma imobilizada,
tm sido usados como biocatalisadores. O isolamento e
puricao do biocatalisador (enzimas), consiste em
geral numa etapa de concentrao, seguida da puricao
propriamente dita, por processos cromatogrcos.
A obteno de novos biocatalisadores, baseados na
Engenharia do Biocatalisador permite modicar e melhorar as caractersticas do biocatalisador de forma a que o

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O Isolamento e Puricao do produto obtido da bioconverso, depende das caractersticas do produto que vo
inuenciar a sua recuperao, e a qualidade, pureza e escala
pretendidas.

2. Principais razes para a utilizao de

meios no-convencionais
Atendendo a que o conceito de biotransformao est
associado ao uso de biocatalisadores, nas quais a gua o
solvente preponderante, fcil compreender que a mesma
funo tenha sido desempenhada por este solvente em
inmeros estudos de cintica enzimtica. Observou-se,
no entanto, que o uso exclusivo de gua como solvente de
meios de biotransformao restringia a gama de aplicaes
da biocatlise, bem como limitava a produtividade de
diversos processos, nomeadamente os que envolviam
substratos hidrfobos. Por outro lado, a constatao de
que muitos enzimas operam in vivo em ambientes ricos em
lpidos hidrfobos, levou a concluso de que estes meios
predominantemente no-aquosos so igualmente adequados expresso de actividade biocataltica. A convergncia
destes dois aspectos conduziu incorporao no meio
reaccional, de solventes orgnicos, uidos supercrticos,
fases gasosas ou fases slidas, aos quais se convencionou
atribuir a designao de meios no-convencionais.
As principais razes para a utilizao de meios no-con-

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Figura 1- Bioprocesso para obteno de bioprodutos.

vencionais so essencialmente o facto destes permitirem:

1) a solubilizao de substratos e/ou produtos hidrfobos
, levando ao desenvolvimento de processos com produtividade volumtrica elevada.; 2) a reduo de possveis
efeitos inibitrios ou/e txicos por parte do substrato
e/ou produto, em que o solvente orgnico pode ser seleccionado de modo a funcionar como diluente, reduzindo a
concentrao interfacial e na fase aquosa (por partio) de
substratos e/ou produtos; e 3) o deslocamento do equilbrio
qumico, nomeadamente no caso de enzimas hidrolases,
que em meio aquoso catalisam reaces de hidrlise, e o
equilbrio pode ser deslocado no sentido do favorecimento
de reaces de sntese, atravs do controlo da actividade da
gua. O equilbrio da reaco pode ser tambm deslocado
no sentido do favorecimento da formao do produto,
mediante a remoo contnua deste para a fase orgnica.

3. Biocatlise em solventes orgnicos

As bioconverses em sistemas multifsicos em que uma das
fases um solvente orgnico tem vantagens e desvantagens
associadas ao uso de uma fase orgnica. Uma vez que
aps a etapa de bioconverso se seque a recuperaodo
produto, em termos de integrao ecaz das duas etapas de
forma a optimizao do bioprocesso global, importante
considerar as potenciais vantagens e desvantagens destes
sistemas em termos de operao do reactor e recuperao
do produto (Tabela 1).

Relativamente operao do reactor, h vantagens em usar

um solvente orgnico, pois este vai permitir a solubilizao
de compostos hidrfobos (substratos e produtos), a reduo
de efeitos inibitrios/txicos de substratos e/ou produtos,
e o deslocamento do equilbrio da reaco atravs do
Os meios no convencionais para biocatlise podem ser controlo da actividade da gua. As principais desvantagens
solventes orgnicos, udos supercrticos, sistemas em associadas ao uso de solventes orgnicos como meios de
que no so utilizados solventes orgnicos (fases slidas, bioconverso, so o aumento das limitaes difusionais
transferncia de massa de substratos e/ou produtos, uma
lquidas e gasosas), e recentemente udos inicos.
vez que se introduz mais uma fase (orgnica) alm da fase
aquosa (e de uma fase slida se o biocatalisador estiver
imobilizado), e a toxicidade
do solvente orgnico para o
Tabela 1: Vantagens e limitaes do uso de solventes orgnicos
biocatalisador.
Caractersticas do processo
Operao do reactor

Vantagens e desvantagens
(+) Solubilizao de substratos/produtos hidrfobos
(+) Reduo da inibio/toxicidade de substratos/produtos
(+) Deslocamento do equilbrio qumico
(-) Limitaes transferncia de massa
(-) Toxicidade para o biocatalisador

Isolamento e puricao
(+) Recuperao de substratos/produtos
(+) Concentraes elevadas de produtos
(-) Formao de emulses

Em termos de isolamento
e puricao do produto
da bioconverso , esta
facilitada se o substrato e
o produto estiveram em
fases diferentes (nomeadamente se o produto
for hidrfobo), e por se
obterem
concentraes
mais elevadas de produto. A
principal desvantagem, so
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a formao de emulses estveis, normalmente devido a
efeitos interfaciais. A presena de reas interfaciais elevadas
pode levantar srios problemas na etapa de recuperao do
produto do reactor, podendo tornar-se o factor limitante do
processo global.
Adicionalmente a estes factores temos tambm de considerar os custos adicionais para a segurana do processo,
no processamento dos euentes do processo incluindo a
possvel reutilizao do solvente orgnico.

Tabela 2 : Critrios para a seleco do solvente

orgnico
Fsico Qumicos
- Capacidade para solubilizao do substrato e do produto
- Coeciente de partio
- Densidade
- Pontos de fuso e de ebulio
- Tenso supercial
- Viscosidade

Biolgicos
- Toxicidade para o biocatalisador

3.1 Seleco do solvente orgnico

As bioconverses em sistemas multifsicos dependem
da escolha do solvente mais adequado para o sistema
biocataltico.
Os principais critrios a considerar na seleco de um
solvente orgnico so apresentados na Tabela 2, e incluem
critrios fsico-qumicos, biolgicos, de segurana, logsticos e econmicos. Do ponto de vista fsico-qumico, os
aspectos mais importantes so a capacidade de extraco
(coeciente de partio) e solubilizao de substratos e/ou
produtos pelo solvente orgnico, e as suas propriedades
que vo determinar a facilidade de separao das fases
e a transferncia de massa. O solvente orgnico deve
ser qumica e termicamente estvel, no deve formar de
emulses em meio aquoso, por forma a facilitar a separao
de fases, a sua viscosidade deve ser reduzida, de forma a
facilitar a transferncia de massa, e no ser degradado pelo
biocatalisador. Do ponto de vista de segurana, o solvente
orgnico no deve apresentar toxicidade ambiental nem ser
prejudicial para a sade, e no ser inamvel .Em termos
logsticos, a sua disponibilidade dever ser elevada e a sua
reciclagem deve ser possvel. Em termos econmicos, o seu
custo deve ser baixo. O critrio biolgico, toxicidade do
solvente orgnico para o biocatalisador , de todos estes, o
que se apresenta mais restritivo.

3.1.1 Toxicidade molecular e toxicidade

de fase
O efeito txico do solvente pode ser devido a dois processos:
um resultante da difuso de molculas de solvente atravs
da membrana citoplsmtica (toxicidade molecular); e
outro associado ao contacto directo entre o biocatalisador
e o solvente orgnico (toxicidade de fase).
A presena de solvente orgnico dissolvido na fase aquosa
(toxicidade molecular), pode provocar inibio enzimtica,
desnaturao de protenas e alterao do DNA, e modicao da uidez da membrana citoplasmtica. A toxicidade de fase, que origina, para alm da desorganizao da
membrana citoplasmtica, a sua permeabilizao do que
resulta a perda de metabolitos essenciais e de co-factores,
pode levar extraco de nutrientes, agregao celular e
formao de emulses.

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Segurana
- Toxicidade
- Inamabilidade

Logsticos
- Facilidade de obteno
- Eliminao de resduos

Econmicos
- Custo

A toxicidade molecular do solvente usualmente avaliada

atravs do logaritmo do coeciente de partio do solvente
num sistema padro n-octanol/gua (log Po/w), conhecido
como parmetro de Hansch, o qual um indicador do grau
de hidrofobicidade do solvente em causa. O valor de log Po/w
de um dado solvente pode ser determinado experimentalmente ou calculado atravs do mtodo das constantes
hidrfobas fragmentadas de Rekker. Trabalhos realizados
com diferentes sistemas biocatalticos, envolvendo, em cada
caso, o uso de solventes com diferentes hidrofobicidades,
conrmaram a existncia de uma tendncia generalizada
para a relao entre a actividade cataltica e a hidrofobicidade do solvente, traduzida por uma curva sigmoidal. Em
mdia, solventes com log Po/w inferior a 2-3 so considerados txicos, enquanto aqueles com log Po/w superiores a 4-5
so considerados biocompatveis, muito embora os pontos
de inexo sejam dependentes do biocatalisador, nomeadamente do microrganismo, considerado. O deslocamento do
ponto de inexo tambm pode ser motivado pelo grau de
agitao do meio.
A aco txica de solventes orgnicos hidrfobos
essencialmente devida toxicidade de fase, dada a sua
baixa partio para o lme aquoso que rodeia o biocatalisador. Este factor minimiza a possibilidade de ser atingido
um valor de concentrao crtica do solvente na membrana
celular, a partir da qual observada a aco txica.
A toxicidade de fase pode ser reduzida, atravs da
utilizao de nutrientes e inculos mais concentrados,
para compensar a extraco de nutrientes, e diminuindo
a rea interfacial, usando uma agitao mais suave e/ou
diminuindo a razo volumtrica de fases orgnica/aquosa,
de modo a reduzir os fenmenos de agregao e emulso. A
imobilizao do biocatalisador e a utilizao de membranas
hidrfobas, que evitam o contacto do biocatalisador com a
interface lquido-lquido, e a engenharia do biocatalisador,
atravs do design de biocatalisadores mais resistentes e

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Figura 2 - Classicao de sistemas biocatalticos englobando solventes orgnicos:
(a) sistemas de duas fases lquidas orgnico-aquosas: emulso de meio aquoso
(disperso) em meio orgnico (contnuo);
(b) sistemas de duas fases lquidas orgnico-aquosas: emulso de meio orgnico
(disperso) em meio aquoso (contnuo);
(c) e (d) biocatalisador imobilizado
num suporte poroso, em presena de
um sistema bifsico; (e) biocatalisador
microencapsulado numa micela invertida; (f) biocatalisador modicado com
polietileno glicol e dissolvido em meio
orgnico; (g) biocatalisador imobilizado
ressuspenso em meio orgnico; (h) biocatalisador liolizado e na forma de cristais,
ressuspenso em meio orgnico.

apropriados a solventes orgnicos, so outras alternativas

possveis para diminuio da toxicidade de fase.

3.2.2 Sistemas de duas fases lquidas

orgnico-aquosas

3.2 Classicao dos sistemas biocatalticos

A estabilidade do biocatalisador num solvente orgnico

pode ser melhorada usando um solvente imiscvel em gua
(log P >4). Obtm-se um sistema bifsico com o enzima
e compostos hidrlos na fase aquosa e os substratos e
produtos hidrfobos na fase orgnica (Figura 2, a,b,c,d).

Os sistemas biocatalticos que utilizam solventes orgnicos

podem ser agrupados de acordo com a natureza da mistura: (1) mistura homognea de meio aquoso e solventes
orgnicos miscveis com gua; (2) mistura de duas fases
lquidas orgnico-aquosas; (3) biocatalisadores dissolvidos
em solventes orgnicos: micelas invertidas e enzimas modicados covalentemente e (4) biocatalisadores ressuspensos
em solventes orgnicos com baixos teores de gua: enzimas
em p (obtidos por liolizao ou cristalizao) ou biocatalisadores imobilizados, na ausncia de fase aquosa (Figura
2,a, b, c, d ,e, f , h).

3.2.1 Mistura homognea de meio

aquoso e solventes orgnicos miscveis
com gua
Uma forma simples de aumentar a solubilidade de um
substrato hidrfobo em meio aquoso, consiste na adio de
um solvente orgnico miscvel com gua (metanol, etanol,
dimetilformamida) ao meio de biotransformao. Dada
a sua homogeneidade, as resistncias transferncia de
massa so geralmente negligenciveis. Todavia a polaridade
elevada destes solventes, com valores de log Po/w inferiores
a 2, confere-lhes um carcter txico, acentuando-se este
efeito txico para concentraes elevadas de solvente.

Neste tipo de sistemas a fase orgnica pode constituir

ela prpria o substrato da bioconverso ou servir de
reservatrio a substratos e/ou produtos hidrfobos.
Podemos considerar sistemas em que a fase orgnica
contnua e a fase aquosa dispersa na fase orgnica, sendo o
biocatalisador solvel na fase aquosa;ou a fase contnua a
fase aquosa e a fase orgnica est dispersa na fase aquosa,
com o biocatalisador solvel na fase aquosa (Figura 2, a,b).
Podemos ter tambm, considerando as duas situaes
anteriores, a presena de uma terceira fase slida devido ao
biocatalisador imobilizado (Figura 2 c , d).
Nestes sistemas necessrio assegurar que a rea interfacial
seja sucientemente elevada para facilitar a transferncia
de massa de substratos/produtos atravs da interface
lquido-lquido e lquido-slido (se o biocatalisador estiver
imobilizado), atravs do controlo adequado da velocidade
de agitao e da razo volumtrica das fases aquosa e orgnica. A partio de substrato(s) e produto(s) entre as duas
fases pode ser controlada mediante a seleco adequada
do solvente orgnico. A partio de produto(s) para a fase
orgnica permite deslocar o equilbrio da reaco no sentido da formao do(s) mesmo(s). A acumulao preferencial de substrato(s) e produto(s) na fase orgnica minimiza
a sua potencial aco inibitria sobre o biocatalisador. A
razo volumtrica entre as duas fases pode ser escolhida
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com vista a optimizar a operao do reactor.

3.2.5 Classicao dos sistemas biocatalticos: Pers de concentrao

3.2.3 Biocatalisadores dissolvidos em

solventes orgnicos

Para a seleco do sistema biocataltico e do reactor mais

adequado para uma dada bioconverso importante classicar os vrios sistemas descritos de acordo com os pers
de concentrao do substrato e o volume relativo de fases
orgnico/aquosa.

Os sistemas de micelas invertidas constituem casos

particulares de microemulses, em que a fase aquosa no
macroscopicamente discernvel da fase orgnica (fase
contnua) (Figura 2 e). Estes sistemas reaccionais consistem
em agregados formados por molculas de agentes tensioactivos na presena de solventes apolares e de pequenas
quantidades de gua. A natureza anptica das molculas
dos agentes tensioactivos, compostas por um grupo polar
(hidrlo) e uma cauda apolar (hidrfoba), faz com que
elas se agrupem de modo a que as caudas hidrfobas se
encontram em contacto com o solvente apolar, enquanto
os grupos polares se direccionam para o interior do agregado, formando um ncleo interior aquoso. Deste modo
as micelas invertidas permitem a solubiizao de enzimas
no ncleo interior aquoso e a partio de substratos
e/ou produtos entre o ncleo aquoso e o solvente orgnico,
dependendo da sua hidrofobicidade.
A rea interfacial elevada das micelas invertidas, minimiza
as limitaes transferncia de massa. No entanto a presena do tensioactivo pode provocar alguma inactivao
do enzima e causar problemas na estapa de recuperao
do produto.
Alternativamente, os enzimas podem ser solubilizados
em solventes orgnicos por modicao covalente com
polietileno glicol (Figura 2 f).

3.2.4 Biocatalisadores ressuspensos em

solventes orgnicos
A reduo at valores praticamente vestigirios do teor de
gua presente no meio de biotransformao pode revelarse til em alguns sistemas biocatalticos. A seleco do
solvente um aspecto particularmente crtico neste tipo de
sistemas, na medida em que se estabelece uma competio
entre este e o enzima para as molculas de gua. A utilizao de solventes hidrlos pode levar remoo da camada
de hidratao da molcula do enzima, resultando na sua
alterao estrutural e consequente perda de actividade
cataltica.
A utilizao destes meios quase anidros em bioconverses
implica o uso de enzimas imobilizados num suporte slido
(Figura 2 g) ou na forma de p (liolizados ou em cristais)
(Figura 2 h).
Nos critrios de seleco do suporte de imobilizao, deve
ser tomada em conta a sua anidade para a gua, na medida
em que a gua presente no meio se particionar entre a
matriz de imobilizao, o enzima e o meio reaccional,
afectando o micro-ambiente deste.

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Podemos considerar trs tipos de pers de concentrao

tericos para o substrato, considerando um substrato
hidrfobo, e que as fases lquidas (aquosa e orgnica) se
encontram bem misturadas, isto no h limitaes
transferncia de massa dentro das fases (Figura-3,a), b)
e c)).
A gura 3 a) representa o perl de concentrao do
substrato, para o sistema de duas fases lquidas orgnicoaquosas, com o biocatalisador dissolvido na fase aquosa,
em que a fase aquosa pode ser a fase contnua ou a fase
dispersa (sistemas da Figura 2 a, b). Evidencia-se a variao
da concentrao de substrato na interface quer devido s
resistncias transferncia de massa atravs da interface,
quer a efeitos de partio. Uma vez que o substrato
hidrfobo, tem pouca anidade para a fase aquosa e a sua
concentrao na interface diminui, no s devido a efeitos
de transferncia de massa, mas tambm devido a efeitos de
partio.
Quando o biocatalisador se encontra imobilizado, alm das
duas fases lquidas aquosa/orgnica temos de considerar
uma terceira fase, uma fase slida, que corresponde a um
enzima ou clulas imobilizadas. Na Figura 3 b), apresentase o perl de concentrao terico para o substrato num
sistema de duas fases lquidas orgnico-aquosas, com o
biocatalisador insolvel na fase aquosa, considerando o
biocatalisador imobilizado num suporte hidrfobo poroso
(sistemas representados na Figura 2 c, d).
Deste modo, alm dos efeitos de transferncia de massa e
efeitos de partio na interface lquido-lquido, temos tambm de considerar os efeitos de partio e de transferncia
de massa relativamente ao biocatalisador imobilizado.
Neste caso, so importantes as caractersticas do suporte
(suporte hidrlo ou hidrfobo) e o facto de o suporte ser
ou no poroso. O facto de o suporte ser hidrfobo, permitiu
aumentar a concentrao de substrato junto ao enzima.
Se o volume de fase aquosa reduzido relativamente ao
volume da fase orgnica do biocatalisador insolvel, deixamos de ter uma fase aquosa discreta, entre a fase orgnica
e o biocatalisador. Esta situao corresponde ao terceiro
perl (Figura 3 c)), e engloba os sistemas de biocatalisadores ressuspensos em solventes orgnicos (Figura 2 g, h).
Neste caso a transferncia de massa entre a fase orgnica e
a fase aquosa no-discreta vai depender da rea especca
das partculas de biocatalisador, e no da rea interfacial
entre as fases lquidas.
Os sistemas de biocatalisadores solubilizados em solventes
orgnicos, micelas invertidas e modicao qumica com

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Figura 3 - Pers de concentrao tericos do substrato para os vrios sistemas biocatalticos

PEG, so casos particulares dos sistemas

bifsicos, em que macroscopicamente se
v uma nica fase, correspondendo ao
primeiro perl (Figura 3 a)).

3.2 Efeito da gua na

actividade e estabilidade do
biocatalisador
Mesmo num meio no-convencional
constitudo essencialmente por uma fase
orgnica, a quantidade de gua no sistema
inuencia fortemente a actividade cataltica
do enzima. Para baixos teores de gua, a
actividade enzimtica geralmente baixa.
Normalmente, a actividade enzimtica
aumenta com o aumento da camada de
hidratao do enzima, o que devido
aco lubricante da gua que aumenta a
exibilidade interna do enzima A curva tpica de variao
da actividade especca do enzima em funo da actividade
da gua, normalmente, apresenta um mximo. A diminuio
de actividade pode ser devida a limitaes transferncia de
massa devido ao transporte do substrato atravs de uma fase
aquosa, ou agregao das partculas de catalisador.
A estabilidade enzimtica, normalmente diminui com o
aumento da quantidade de gua. A gua participa numa
variedade de mecanismos que causam a desnaturao da

protena conduzindo inactivao dos enzimas.

Em micelas invertidas consegue-se uma estabilidade elevada
atravs do controlo da actividade da gua. Para biocatalisadores resuspensos em solventes orgnicos, obtm-se em
geral estabilidades elevadas, uma vez que a quantidade de
gua muito pequena (valores de actividade de gua >1)
e os enzimas adquirem uma maior rigidez conformacional
(num estado desidratado, sem gua). Alm disso no ocorre
protelise, outra causa comum de desnaturao em gua.

Figura 4 - Engenharia do Biocatalisador

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Por m, a gua actua como um substrato nas reaces de
hidrlise e deste modo este tipo de reaces so favorecidas
com o aumento da quantidade de gua, e inversamente o
rendimento das reaces de sntese menor.

3.3

Engenharia do Biocatalisador

O desenvolvimento da tecnologia de DNA recombinado

criou vias para a obteno de novos biocatalisadores,
baseados na engenharia de protenas, e que podem ser
utilizados em solventes orgnicos. Esta metodologia consiste
na modicao de protenas existentes ou na sntese de novo
de protenas, apresentando um conjunto de propriedades
pr-denidas. O design racional de protenas, levado a cabo
por mutagnese dirigida, requer a identicao da relao
estrutura-funo na molcula. O nmero reduzido de
enzimas cuja estrutura tridimensional est perfeitamente
resolvida limita consideravelmente a aplicao desta metodologia. Actualmente, as metodologias mais utilizadas, para
a pesquisa de novos biocatalisadores, so a evoluo dirigida
por mutagnese aleatria e/ou a recombinao de um ou
mais genes homlogos (DNA shuing)
O desenvolvimento do biocatalisador ideal para uma
dada bioconverso (identicada a caracterstica que se quer
modicar) resulta de uma aproximao multidisciplinar e
integrada de conhecimentos e tecnologias desenvolvidas nas
reas da biologia, qumica e engenharia (Figura 4). As disciplinas envolvidas incluem a Bioinformtica (que compila
toda a informao relativamente aos dados protena-funo
e genoma-protena), a Qumica de Protenas que atravs
de vrias tcnicas nos d informaes acerca das relaes
estrutura-funo e estrutura actividade de protenas; a

Engenharia Metablica que iclui a anlise dos uxos metablicos; a Engenharia de Protenas atravs diversas tcnicas
de recombinao gentica (nomeadamente, error-prone PCR
e DNA suing) combinadas com a metodologia da evoluo
dirigida, permitem a criao de bibliotecas de mutantes e,
aps a aplicao de mtodos de seleco e triagem, isolar
o melhor mutante (com a caracterstica melhorada necessria); a Engenharia de Processos, que permite optimizao
e integrao das operaes de fermentao e recuperao do
biocatalisador.
Deste modo, e com todas estas ferramentas os cientistas
so hoje em dia capazes de fazer o design do biocatalisador
ideal.
Alguns exemplos de vrias tecnologias que so usadas para
melhorar uma ou mais caractersticas do biocatalisador,
alm das tcnicas de recombinao gentica e evoluo
dirigida so apresentados na Tabela.3.

3.4. Reactores multifsicos

A seleco do reactor mais apropriado para um dado bioprocesso, depende das caractersticas da bioconverso e de
constrangimentos reaccionais, cinticos e do biocatalisador,
que vo determinar o modo de operao e as caractersticas
do uxo (Figura.5).
As caractersticas da bioconverso incluem, as propriedades
dos substratos/produtos (pontos de fuso e ebulio,
solubilidade em gua, estabilidade ao pH e temperatura); as
caractersticas reaccionais (nomeadamente, pH, temperatura, controlo da actividade da gua) e ; as caractersticas do
biocatalisador, que incluem a utilizao de enzimas (desin-

Tabela 3: Tecnologias disponveis para melhorar as caractersticas do biocatalisador

Objectivo

Tecnologia

Exemplo

Solubilizao do enzima

Solubilizao de subtilisina em micelas invertidasde AOT

Modicao qumica

Modicao da catalase com um tensioactivo (Brij 35)

Aplicao de hidrolases e lipases recobertas com lpidos em meio
orgnico

Aumento da actividade

Alterao da enantioselectividade
Alterao da funcionalidade

Melhoramento da enantioselectividade de lipases

Evoluo dirigida

Recombinao de genes obtendo-se um enzima recombinante

capaz de degradar benzeno e tolueno

Converso de substratos no naturais

Aumento da estabilidade

Alterao da actividade de isomerases, hidrolases e -galactosidase

Evoluo dirigida

Esterase termoestvel sem perda de actividade, subtlisina E

Ligao multicovalente/imobilizao

Hiperestabilizao de uma esterase termla

Modicao qumica
(Formao CLEC)

Reticulao e modicao qumica de subtilisina cristalizada

Evoluo dirigida

Aumento da actividade da subtilisina em meio aquoso/orgnico

(40% DMF)

Enzima liolizada na presena de NaCl

O sal induz a activao do enzima em hexano anidro

Modicao do meio reaccional

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Figura 5 - Seleco de reactores multifsicos

tegrao celular) ou clulas (necessidade de cofactores),

livres ou imobilizadas, a localizao da actividade enzimtica
(normalmente na fase aquosa, excepto para as lipases que so
activadas por interfaces), e por m os requisitos em gua por
parte do biocatalisador para manuteno da sua actividade
cataltica tambm importante considerar as interaces
entre o biocatalisador e os substratos e produtos
Os constrangimentos a considerar na seleco e operao
do reactor so constrangimentos reaccionais, cinticos e do
biocatalisador.
Os constrangimentos reaccionais, incluem o tipo de
sistema biocataltico; a razo de fases aquosa-orgnica
que condiciona a produtividade volumtrica no reactor e
a rea interfacial disponvel para a transferncia de massa
de substratos/produtos; a transferncia de massa atravs da
interfase lquido-lquido, slido-lquido, gs-lquido, e dentro da mesma fase; e efeitos de partio substratos/produtos.
Os constrangimentos cinticos comprendem a inibio pelo
substratos e/ou produtos.
Os constrangimentos do biocatalisador, incluem a concentrao mxima de biocatalisador permitida no reactor, a
desnaturao por agitao mecnica (no caso de reactores
mecanicamente agitados) e a baixa estabilidade do biocatalisador, devido a efeitos de temperatura, pH, presena de
compostos txicos, necessidades de co-factores, nutrientes,
co-substratos, e a toxicidade do solvente orgnico.
Os requisitos essenciais para seleco do reactor mais apropriado para uma dada bioconverso so, uma rea interfacial

elevada, de modo a permitir uma transferncia adequada de

substratos/produtos atravs da interface e um controlo ecaz
da rea interfacial.
Dentro dos reactores usados em sistemas multifsicos destacam-se, os reactores agitados mecanicamente (descontnuos
ou contnuos), os reactores de membranas, os reactores de
leito xo e os reactores agitados por uma fase lquida.

3.4.1 Reactor descontnuo perfeitamente

agitado
Este tipo de reactores so geralmente usados em, processos
em que intervm biocatalisadores solveis (Figura 6).
Os reactores agitados mecanicamente permitem um
controlo adequado da rea interfacial atravs da velocidade
de agitao (e da razo volumtrica das fases), de forma a
obterem-se velocidades de transferncia de massa elevadas.
No entanto, reas interfaciais elevadas podem levar formao de emulses estveis, dicultando o passo seguinte de
separao do produto. A maior parte dos exemplos referidos
na literatura so com este tipo de reactores.

3.4.2 Reactor contnuo perfeitamente

agitado
Este tipo de reactores so geralmente usados em processos
em que intervm biocatalisadores imobilizados, de modo
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Biocatlise
a reter o biocatalisador no interior do reactor
(Figura 7).
A imobilizao do biocatalisador pode reduzir
a formao de emulses estveis, facilitando a
separao posterior das fases. A presena de uma
terceira fase slida (biocatalisador imobilizado
num suporte, geralmente um suporte poroso)
implica que alm da transferncia de massa
atravs das fases e da interface aquosa/orgnica,
temos de considerar a difuso do substrato no
interior do suporte. A agitao mecnica pode
tambm, provocar destruio das partculas de
suporte.
Figura 6 - Reactor descontnuo perfeitamente agitado (BSTR).

Estes reactores so pouco usados para bioconverses em sistemas multifsicos devido sua
baixa ecincia.

3.4.3 Reactores de membrana (CSTR com

recirculao)
Este tipo de congurao em que acoplada uma membrana
de ultraltrao ao reactor contnuo com agitao (CSTR)
permite a utilizao de sistemas em que microscopicamente
temos duas fases lquidas, nas quais o biocatalisador pode
estar solvel (micelas invertidas) ou insolvel (clulas,
enzima liolizado ou em cristais) (Figura 8). A membrana
permite a reteno do biocatalisador dentro do reactor, uma
vez que no permevel ao biocatalisador, podendo tambm
apresentar alguma selectividade relativamente aos substratos
e produtos, permitindo por exemplo a recuperao selectiva
do produto no permeado.

3.4.4 Reactores de leito xo

Os reactores de leito xo so mais adequados para sistemas
correspondentes ao ltimo perl de concentrao (Figura 3
c)), que corresponde aos sistemas de biocatalisadores ressuspensos em solventes orgnicos (Figura 9). So cineticamente
mais favorveis que os reactores contnuos com agitao, e
no tm a desvantagem das elevadas tenses de corte devido

agitao mecnica. No entanto, a sua aplicao limitada

pelo tipo de substrato (viscoso, coloidal, partculas slidas
em suspenso) e a forma do biocatalisador imobilizado.
usado para reaces de sntese de steres, mono, di e triglicridos por lipases de Rhizomucor miehei, e resoluo ptica
de fenilalanina por -quimotripsina.

3.4.5 Reactores agitados por uma fase

lquida
Este tipo de reactores tem como base os princpios do reactor agitado por uma fase gasosa (air-lift), em que em vez
de uma fase gasosa, uma fase lquida dispersa que induz
a circulao de uma fase lquida contnua (Figura 10).
Quando a fase do solvente menos densa que a gua, esta
adicionada atravs dum difusor na parte de baixo do
reactor. Este tipo de reactor mais adequado para sistemas
constitudos por duas fases lquidas macroscopicamente
distintas, nas quais o biocatalisador pode estar dissolvido
na fase aquosa ou imobilizado.
Neste tipo de reactores combinam-se a mistura das fases
atravs do controlo das condies do uxo e baixas tenses
de corte (decorrentes da agitao mecnica), com as solubilidades elevadas para substratos/produtos hidrfobos,
obtendo-se velocidades de reaco elevadas e sendo facilitados a recuperao do produto por extraco. A diferena
de densidades entre as duas fases lquidas
pequena, o que diculta a concepo da
zona de decantao no topo do reactor. Este
problema agravado na presena de agentes
emulsicantes (presentes na soluo inicial
ou segregados pelas clulas). Usado a nvel
laboratorial para a produo de L-triptofano.

3.4.6 Reactores de membrana

Figura 7 - Reactor contnuo perfeitamente agitado (CSTR)

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Este tipo de reactores permite numa nica

operao em contnuo, a integrao da
bioconverso com a separao/concentrao
do produto e recuperao do biocatalisador

Biocatlise
Figura 8 - Reactor de
membrana (CSTR com
recirculao)

(Figura 11). A membrana vai funcionar

como interface entre
as duas fases lquidas
imiscveis (evitando o
seu contacto) e como
suporte para a imobilizao do biocatalisador (aumento da rea
interfacial de contacto
enzima/substrato).
Neste tipo de reactores
as fases aquosa e orgnica so mantidas separadas pela
membrana, o que evita o problema de formao de
emulses, e inactivao do enzima devido ao contacto
com o solvente. As principais desvantagens destes
reactores so: a nvel do biocatalisador de diminuio
da actividade cataltica por perdas do enzima da membrana, e diminuio da ecincia de transferncia de
massa devido diminuio de uxo de permeado. Os
dois fenmenos responsveis por esta diminuio, so
a concentrao de polarizao e o fouling da membrana, que levam aos baixos coecientes de transferncia
de massa e ao entupimento da membrana.
Este tipo de reacrores usado para a biotransformao
de lpidos (gorduras, leos, triglicridos, cidos gordos
e steres). A maior parte dos exemplos incluem a
hidrlise de lpidos e gorduras para a produo de cidos gordos, mono e di-glicridos e glicerol, ou a sntese
de steres incluindo reaces de tranestericao.
Figura 9 - Reactor de leito xo (PFR)

3.5 Exemplos de
processos industriais
As aplicaes de sistemas
biocatalticos na presena de
solventes orgnicos abrangem
uma vasta gama de processos,
nomeadamente a sntese de
pptidos utilizando quimotripsina, termolisina ou pepsina;
reaces de estericao, interestericao, trans-estericao
utilizando lipases; sntese de
compostos
enantiomricos
puros utilizando lipases ou
leveduras, desidrogenao de
esterides utilizando desidrogenases ou clulas inteiras de
Arthrobacter simplex.
Na Tabela 4 apresentam-se

Figura 10 - Reactor agitado por uma fase lquida.

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11

Biocatlise
alguns exemplos de processos industriais.

3.6 Perspectivas futuras

As aplicases de meios no-convencionais constituudos
por solventes orgnicos, so adequadas para bioconverses
envolvendo:
- substratos/produtos pouco solveis em gua, que so
inibitrios ou txicos para o biocatalisador
- Quando existem diferenas de solubilidade entre os
substratos e/ou produtos
- Substratos e/ou produtos que so slidos e inibitrios
ou txicos, e por isso difceis de alimentar de uma
forma adequada ao reactor
- Deslocamento do equilbrio qumico no sentido de
favorecer reaces de sntese atravs do controlo da
actividade da gua
A principal limitao das bioconverses em sistemas multifsicos, em que uma das fases um solvente orgnico, a
toxicidade do solvente orgnico, devido ao solvente orgnico
dissolvido na fase aquosa e presena da interface lquidolquido.
Os desenvolvimentos mais recentes em termos das bioconverses em sistemas multifsicos, envolvem o design de biocatalisadores mais adequados a solventes orgnicos, o design
de novos solventes, e a seleco do bioreactor multifsico e
do processo de recuperao do produto mais adequados de
modo a uma integrao das duas etapas do bioprocesso.
Atravs da engenharia do biocatalisador, usando de tcnicas
de engenharia gentica, possvel o desenvolvimento de
clulas mais tolerantes a solventes orgnico e a reduo de
excreco ou lise de material e/ou permeabilizao celular.
A metodologia da evoluo dirigida permite a obteno de
enzimas mais tolerantes a solventes orgnicos, e de enzimas
com actividades elevadas para substratos no-naturais.
A seleco de novos solventes, nomeadamente lquidos
inicos (hexauorofosfato de 1-butil-3-metil imidazole),
pode ser uma alternativa aos solventes orgnicos, devido a
constrangimentos ambientais.

Figura 11 - Reactor de membrana.

Em termos de reactores multifsicos, importante o

desenvolvimento de reactores mais adequados, nomeadamente reactores agitados por uma fase lquida e reactores de
membrana, que permitem simultaneamente a solubilizao
de substratos e produtos hidrfobos, obtendo-se velocidades
de reaco elevadas e a separao do produto, integrando a
etapa de bioconverso com a etapa de isolamento e recuperao do produto.
3.7 Bibliograa
Cabral, J.M.S., Mota, M. e Tramper, J., Multiphase Bioreactor
Design, Taylor and Francis Books, London, 2001.
Fernandes, P., Aires-Barros, M.R. e Cabral, J.M.S., Biocatlise
Aplicada em Biotecnologia: Fundamentos e Aplicaes
(N-Lima e M.Mota, eds.), LIDEL-Edies Tcnicas LDA, Cap.
10, 2001 (em impresso).
Petrounia, I.P., Arnold, F.H., Designed Evolution of Enzymatic
Properties, Curr. Op. Biotechnol., 11, 325-330.
Schmid, A, Dordick, J.S. et al., Industrial Biocatalysis Today
and Tomorrow, Nature 409, 258-268 (2000).
Straathof, A.J.J. e Adlercreutz, P., Applied Biocatalysis,
Harwood Academic Publishers, Amsterdam, 2000.

Tabela 4: Exemplos de processos industriais

Reaco

Biocatalisador

Solvente

Companhia

Epoxidao 1-octeno

Noccardia corallina

n-hexadecano

Nippon Mining

Hidrlise de steres

Subtilisina (imobilizada)
Lipase

Vrios

Bayer Sumitomo, Chemie Linz AG; BASF; Schering Plough

Desidrogenao de esterides

Arthrobacter simplex

Tolueno

Upjonh

Dessulfurizao

Rhodococcus sp.

leo (substrato)

Energy Biosystems

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