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TRABAJO PRCTICO

MICROORGANISMOS EN LA NATURALEZA:
DIVERSIDAD MICROBIANA

OBJETIVOS:
- Realizar aislamientos de microorganismos a partir de distintos
nichos ecolgicos
- Caracterizar macro y microscpicamente los aislamientos mediante
las tcnicas aprendidas en el TP2.
Identificar
microorganismos
biotecnolgicas.

con

potenciales

aplicaciones

Metodologa general:
A lo largo del TP4 realizaremos aislamientos bacterianos a partir de
los distintos nichos propuestos, utilizando el siguiente esquema
general de trabajo:
- En los casos que sea requerido, inocular la muestra en un
caldo de enriquecimiento (que puede o no ser selectivo al mismo
tiempo), para favorecer el crecimiento del microorganismo de inters.
Incubar durante toda la noche (ON) a la temperatura adecuada.
- Tomar una alcuota de la muestra (o del caldo de
enriquecimiento) y estriar con un ansa en un medio slido que sea
selectivo, para inhibir la flora acompaante del microorganismo que
se quiere aislar, y obtener colonias del mismo. Este medio puede a la
vez ser diferencial (que permita diferenciar cepas o especies
bacterianas en base a alguna caracterstica de las colonias).
Alternativamente se sembrarn diluciones con esptula de Drigalsky.
- Incubar a temperatura y tiempo adecuados.
- Observar crecimiento de colonias aisladas.

Recuerden SIEMPRE rotular debidamente las placas, frascos y tubos

(Grupo, Comisin, y detalles relativos al experimento).

PARTE 1: Aislamiento de microorganismos del suelo.

El objetivo de este ejercicio prctico es evidenciar la enorme
diversidad microbiana presente en los distintos tipos de suelo.
Buscaremos adems identificar algunos rasgos tpicos de
microorganismos presentes en estos hbitats y que han sido de
enorme utilidad para el hombre: la produccin de antibiticos y de
exoenzimas. Cada grupo trabajar con una muestra de suelo nica. A
fin de lograr un desarrollo adecuado de las colonias, el tratamiento
inicial y siembra primaria de estas muestras lo realizaremos durante
el TP2.
Se trabajar con los siguientes tipos de muestras de suelo (los grupos
utilizarn diferentes muestras):
a) muestra de suelo seco provista por la ctedra
b) muestra de suelo secos obtenida por los alumnos (preferentemente
dos grupos)
c) muestra de suelo fresco (puede utilizarse la muestra de barro para
la columna de Winogradsky).

Tratamiento y procedimientos especficos de las muestras de

suelo:
Esta parte del prctico se realizar durante el TP2 (da2).
1- Resuspender aproximadamente 1 g de suelo en 10 ml de agua
estril en un frasco de cultivo (vortex). Dejar decantar.
2- Realizar una dilucin 1/100 en un tubo eppendorf con 1 ml de agua
estril.
3- Sembrar 100 l de la dilucin con esptula de Drigalsky en placas
con los siguientes medios de cultivo:
a- Agar Almidn-Casena (AAC)
b- AAC suplementado con cido nalidxico 50 g/ml
c- Agar Nutritivo (AN).
3- Calentar el tubo a 80C por 10 minutos. Este tratamiento elimina
las clulas vegetativas pero no a las esporas. Luego de calentar,

sembrar 100 l con esptula de Drigalsky en placas con los siguientes

medios de cultivo:
a- AAC
b- AAC suplementado con cido nalidxico 50 g/ml
c- AN
4- Incubar las placas a 30C durante 5-7 das (controlar
peridicamente que no haya deshidratacin de las placas ni
crecimientos invasivos desmedidos de bacterias u hongos).
Observar la variedad de organismos presentes en las distintas placas
y sus interacciones. Comparar adems la morfologa de las colonias
desarrolladas a partir de las muestras tratadas y no tratadas con
temperatura (microorganismos formadores de endosporas).
Las placas resultantes de este ejercicio sern la fuente de
microorganismos para utilizar en los ejercicios siguientes
(conservarlas a 4C para microscopas y como reserva).

Anlisis de los microorganismos del suelo: produccin de

antibiticos y exoenzimas
Esta parte del prctico se realizar durante el TP3 (da 2).
Analizaremos las caractersticas macroscpicas de las colonias
bacterianas obtenidas en el ejercicio anterior, observando diversidad
de tamaos, morfologas, pigmentaciones, formacin de esporas,
texturas
(colonias
secas,
cremosas,
etc.)
y
evaluando
comparativamente en las distintas condiciones de crecimiento y
orgenes de las muestras (comparar entre grupos). Particularmente,
buscaremos detectar la presencia de pigmentos secretados, y halos
de inhibicin de crecimiento, indicativos de un posible
microorganismo productor de antibiticos. Pondremos especial
atencin en la deteccin de colonias que presenten caractersticas
habituales en bacterias del gnero Streptomyces (destacadas por ser
productoras de gran variedad de metabolitos secundarios bioactivos),
como ser:
- resistentes al Ac. nalidxico
- resistentes al tratamiento trmico
- formadoras de micelio areo (colonias color tiza)
- formadoras de micelio sustrato (colonias ancladas al medio
slido donde crecieron)
- secretan diversos pigmentos
- secretan amilasas

Buscaremos adems posibles productores de exoenzimas. Un primer

indicador de la produccin de exoenzimas lo constituye el medio AAC,
ya que la secrecin de amilasas puede evidenciarse como un halo
clarificado alrededor de la colonia, en contraste con la leve
opalescencia que presenta este medio de cultivo debida al almidn.
Bacterias del gnero Bacillus suelen ser productoras de exoenzimas, y
pueden presentar colonias con morfologa seca y achatada, y
resistentes al tratamiento trmico (forman endoesporas).
Se realizarn repiques de las cepas de inters con el esquema
detallado a continuacin, a fin de contar con cultivos puros y
adecuadamente aislados para analizar la produccin de metabolitos
secundarios durante el TP5:

Cepas productoras de antibiticos

1- Elegir una cepa productora de antibitico y hacer una estra
con ansa en una placa de AAC en forma lineal a lo largo de la placa
como se muestra en la figura.
2- Sembrar varias (hasta 8) cepas potencialmente productoras
de antibiticos en AAC como se muestra en la figura. Incluir en esta
siembra alguna cepa control productora de antibiticos provista por el
docente: Streptomyces coelicolor, Saccharopolyspora erythraea,
Streptomyces B13, etc. En caso que sea posible, repicar adems las
cepas cuyo crecimiento haya sido inhibido por alguna potencial
productora de antibiticos (rotularlas adecuadamente). La siembra de
las productoras de antibiticos se har de manera tal que formen un
"parche" de crecimiento confluente (ver el TP5).

3- Incubar en estufa a 30 C durante 5-7 das, controlando

peridicamente que no haya deshidratacin ni contaminaciones
(contina en TP5).

Cepas productoras de exoenzimas:

1- Sembrar como mnimo cuatro cepas que puedan ser
potenciales productoras de exoenzimas en una placa de AN (rotularlas
adecuadamente).
2- Incubar en estufa a 30 C durante 1-2 das (contina en TP5).

DA 1 TP4:
PRODUCCIN DE ANTIBITICOS
Con las cepas obtenidas, se proceder a realizar una serie de ensayos
simples que permitirn evidenciar la produccin de estos compuestos
al enfrentarlos con cepas bacterianas sensibles. La inhibicin del
crecimiento de estas cepas por proximidad al microorganismo
productor es indicador de la actividad antibitica de los metabolitos
secretados.

Test de inhibicin en estra:

Utilizando placa sembrada en forma vertical en el TP4 con el posible
productor de antibitico, evaluaremos la sensibilidad de distintas
cepas a este antibitico realizando estriados prximos a la estra del
microorganismo productor. Para ello se tomar una muestra con ansa
estril de cultivos frescos de cepas sensibles provistas por la Ctedra,
o cepas aisladas en el TP4, estriando de forma perpendicular a la
estra de la cepa productora. Esta estra se har desde adentro hacia
fuera de la placa, evitando absolutamente tocar y arrastrar al
productor de antibitico (se marcar con un punto la base de la placa
el lugar exacto donde se inicia esta estra) (Figura 1.A).

Incubar ON a 30 C y observar el desarrollo de las cepas evaluadas

(Figura 1.B).

Figura 1. A). El microorganismo productor de antibiticos se siembra

como una nica estra en el medio de la placa. Luego de incubarlo el
tiempo requerido para la produccin de metabolitos secundarios, se
siembran las cepas cuya sensibilidad al antibitico producido va a ser
evaluada. stas se siembran perpendicularmente a la estra del
microorganismo productor con un ansa (lneas punteadas). B) Luego
de incubar la placa ON a 30 C, se evala el crecimiento de las cepas
testeadas en funcin de la proximidad a la productora de antibiticos.

Test de difusin en agar:

A partir de la placa sembrada con diferentes cepas aisladas
productoras de antibiticos se realizarn pruebas de inhibicin con
cepas testigos. Para esto se utilizar una porcin de agar proveniente
de estas placas y se lo colocar sobre una placa de agar nutritivo
previamente inoculada con la cepa testigo como se muestra en la
figura.
- Inocular el medio fundido y entibiado (aprox. 40 C) con un cultivo
de la cepa testigo Micrococcus luteus crecido ON en medio lquido, en
una concentracin final de 0,2% v/v, y dejar solidificar.
- Utilizando un tip estril transferir una porcin de Agar tomada del
centro de una colonia productora de antibitico sobre la superficie de
la placa sembrada con la cepa testigo.
- Incubar ON a 30 C y observar la aparicin de los halos de inhibicin.

PRODUCCIN DE EXOENZIMAS
Se evaluar la capacidad de algunos microorganismos (cepas
bacterianas obtenidas en el TP4 o provistas por la Ctedra) para
sintetizar exoenzimas con actividades lipasa, proteasa o amilasa.
Como metodologa general, se emplear el sistema de deteccin en
placa por la formacin de halos de degradacin. Esto se realiza en
forma directa por inspeccin de la placa, o por un revelado especifico
para generar una coloracin diferencial en las zonas degradadas
respecto del fondo no hidrolizado. En todos los casos se comparar la
actividad con respecto a cepas control.

Produccin de amilasas.
1. Sembrar los microorganismos en estudio por estriado en una placa
de Agar Almidn subdividida en cuatro. Inocular un microorganismo
control (Bacillus subtillis).
2. Incubar a 30 C durante 48 hs o hasta observar desarrollo.
3. Evaluar la hidrlisis del almidn por accin del microorganismo
cubriendo la superficie de la placa con una solucin de ioduro de
potasio/ I2 (lugol)
4. Dejar actuar 2 min.
5. Observar la coloracin: halos de degradacin (marrones o
transparentes) alrededor de las colonias sobre fondo azul. Comparar
con los controles ensayados.

Produccin de proteasas
1. Sembrar el microorganismo en estudio por estriado en una placa
de Agar Leche subdividida en cuatro. Inocular un microorganismo
control (B. subtillis).

2. Incubar a 30 C durante 48 hs o hasta observar desarrollo.

3. Colocar las placas sobre una superficie negra y analizar la
presencia o ausencia de zonas claras (halos de degradacin)
alrededor del rea de crecimiento de los microorganismos evaluados.
Comparar con los controles ensayados.

Produccin de lipasas
1. Sembrar el microorganismo en estudio por estra en una placa de
Agar Triolena/Rhodamina (para evidenciar lipasas), y en una placa de
Agar Yema de huevo (para evidenciar lecitinasas). Inocular con cepas
control provistas por el docente (B. cereus, S. aureus, etc).
2. Incubar a 30 C durante 48 hs. o hasta observar desarrollo.
3. La presencia de un precipitado blanco insoluble alrededor de la
estra en las placas de Agar Yema de huevo es evidencia de la
presencia de lecitinasas. La produccin de lipasas en el Agar
Triolena/Rhodamina se evidencia por la formacin de un halo rosa
alrededor de la estra al exponer la placa a la luz uv.

PARTE 2: Aislado de microorganismos de diferentes nichos

ecolgicos.
Determinaremos la presencia y diversidad de microorganismos en
distintos nichos ecolgicos, buscando adems aislar e identificar
algunas cepas bacterianas particulares. Cada grupo trabajar
individualmente con algunas de las siguientes muestras, y los
procedimientos y resultados se discutirn en conjunto con toda la
Comisin:

- Grupo 1: Agua estancada

- Grupo 2: Muestras de alimentos I (ricota)
- Grupo 3: Muestras de alimentos II (arroz)
- Grupo 4: Muestras de alimentos III (alimento en descomposicin)

Procedimientos
muestra:

especficos

para

procesar

cada

tipo

de

Agua estancada.
Se sembrarn diluciones de la muestra sin enriquecer en placas
Agar Nutritivo, a fin de analizar la diversidad microbiana de
muestra original. Para esto, se harn diluciones 1/10 y 1/100
solucin fisiolgica, sembrando 100 l de las mismas con esptula
Drigalsky.

de
la
en
de

I. Aislamiento de Enterobacterias
1- Tomar 2,5 ml de muestra de agua estancada e inocular un
frasco conteniendo 2,5 ml de Caldo Mac Conkey doble concentrado.
2- Incubar durante 24 hs a 37C con agitacin.
3- Observar crecimiento (la formacin de gas y viraje del
indicador Prpura de Bromocresol a amarillo indica probable
presencia de E. coli).
4- Dividir la placa de Agar Mac Conkey a la mitad.
5- Tomar una muestra con el ansa a partir del Caldo Mac Conkey
y estriar sobre una de las mitades de la placa Agar Mac Conkey.
6- Tomar una muestra con el ansa a partir la muestra original (sin
enriquecer) y estriar sobre la otra mitad de la placa Agar Mac Conkey.
7- Incubar durante 24 hs a 37C.
8- Observar colonias con distinta morfologa y color.

II. Aislamiento de Pseudomonas sp.

1- Dividir la placa de Agar Cetrimida en dos partes iguales.
2- A partir del Caldo Mac Conkey inoculado anteriormente,
sembrar con el ansa en una de las mitades de la placa de Agar
Cetrimida.
3- Tomar una muestra con el ansa a partir la muestra original (sin
enriquecer) y estriar sobre la otra mitad de la placa Agar Cetrimida.
4- Incubar 24 hs a 37C.
5- Observar crecimiento de colonias con pigmento verde.

Ricota: Aislamiento de Staphylococcus sp.

1- Agregar aproximadamente 1 g de ricota a un frasco con 10 ml

de agua peptonada estril (1/1000 peptona de casena en agua
destilada).
2- Agitar bien y dejar decantar. Separar 1 ml de la muestra en un
tubo eppendorf, para sembrar en el paso 6 y el resto procesar como
indica el paso 3.
3- Mezclar 5 ml de Caldo Cerebro Corazn (BHI) con 13% de
NaCl, con 5 ml de la ricota disuelta en agua peptonada (caldo de
enriquecimiento).
4- Incubar 24 hs a 37C con agitacin.
5- Dividir las placas de Agar Manitol Salado y Agar BHI con Azida
en dos partes iguales.
6- En cada mitad de las placas de Agar Manitol Salado y Agar
BHI-Azida, inocular estriando con el ansa a partir de la muestra
original y de la muestra enriquecida.
7- Sembrar 100 l de la muestra original con esptula de
Drigalsky en una placa de Agar Nutritivo y una placa de Agar Mac
Conkey.
8- Incubar 24 hs. a 37C.
9- Observar crecimiento de colonias (forma y color).

Arroz: Aislamiento de Bacillus sp.

1- Agregar aproximadamente 1 g de arroz (preferentemente
proveniente de Dietticas) a un frasco conteniendo 10 ml. de agua
estril.
2- Agitar bien y dejar decantar. Separar 1 ml de la muestra en un
tubo eppendorf, para inocular en el paso 8 y el resto procesar como
indica el paso 3.
3- Tomar una alcuota de 1 ml y calentar a 80C durante 10
minutos.
4- Tomar 0,5 ml de la alcuota calentada e inocular un frasco con
5 ml de Caldo Nutritivo (caldo de enriquecimiento).
5- Incubar 24 hs. a 37 C con agitacin.
6- Dividir una placa de Agar Mossel con yema de huevo en dos
partes iguales.
7- Estriar en una de las mitades del Agar Mossel la muestra
original y en la otra la muestra enriquecida.

8- Sembrar 100 l de la muestra original con esptula de

Drigalsky en una placa de Agar Nutritivo y una placa de Agar Mac
Conkey.
9- Incubar 24 hs. a 37 C
10- Observar el crecimiento de colonias fucsia y precipitado de
lecitina (B. cereus, manitol -, lecitinasa +) y colonias con halo amarillo
sin precipitado (B. subtilis, manitol +, lecitinasa -).

Alimentos en descomposicin.
1- Tomar con el ansa una muestra de alimento y estriar una placa
de Agar Nutritivo, Agar Cetrimida, Agar Mac Conkey y Agar Manitol
Salado.
2- Incubar 48 horas a 30 C.
3- Observar la morfologa de las distintas colonias.

La composicin, caractersticas y fundamentos

tericos de los medios utilizados a lo largo de estos
prcticos se encuentran al final de la gua.
DA 2 TP4:
Se observarn las diferentes colonias obtenidas de la muestra de
suelo y se compararn los resultados obtenidos en la produccin de
antibiticos y exoenzimas.
Se analizarn los resultados de los repiques de cada nicho, donde
cada grupo expondr sus resultados al resto de la Comisin.
Las colonias aisladas en cada caso se analizarn por microscopas
tanto en fresco como con tinciones (Gram, Shaeffer y Fulton).

Materiales Trabajo Prctico N 4:

Material que deben traer los alumnos (por comisin)
-Guantes
- Arroz
- Ricota
-Un alimento en descomposicin
-Agua de zanja/charco/ro (no ms de 50 ml)