La cromatografa es un conjunto de tcnicas que permiten identificar, separar y determinar

compuestos qumicos en mezclas complejas.

Cabe destacar desde un principio que en todas las tcnicas cromatogrficas hay:

Una Fase estacionaria y una Fase mvil.

En Cromatografa de gases, la fase mvil es un gas, el cual se hace pasar a

travs de una fase estacionaria.

En Cromatografa Lquida, la fase mvil es un lquido que se hace pasar a

travs de una fase estacionaria.
Una de las caractersticas fundamentales en las cromatografas es que los componentes de la
mezcla que queremos separar / identificar / cuantificar, se separan cuando susvelocidades de
migracin son distintas.
La cromatografa puede cumplir dos funciones bsicas que no se excluyen mutuamente:

Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos ms puros y que puedan ser
usados posteriormente (etapa final de muchas sntesis).

Medir la proporcin de los componentes de la mezcla (finalidad analtica). En este

caso, las cantidades de material empleadas son pequeas.

La cromatografa no solo permite la separacin de los componentes de una mezcla, sino

tambin su identificacin y cuantificacin.
El anlisis cualitativo est basado en la medida de parmetros cromatogrficos (tiempos y
volmenes de retencin) mientras que el anlisis cuantitativo est basado en la medida de
alturas o reas de picos cromatogrficos que se relacionan con la concentracin. La columna
cromatogrfica y la forma con la que se disea, constituye el corazn de la separacin. El
detector, situado al final de la columna es el que garantiza la respuesta de los componentes
que se separan.
El anlisis cualitativo est basado en la medida de parmetros cromatogrficos (tiempos y
volmenes de retencin) mientras que el anlisis cuantitativo est basado en la medida de
alturas o reas de picos cromatogrficos que se relacionan con la concentracin. La columna
cromatogrfica y la forma con la que se disea, constituye el corazn de la separacin. El
detector, situado al final de la columna es el que garantiza la respuesta de los componentes
que se separan.
2da diapositiva
En esta tcnica cromatogrfica, la muestra se inyecta y volatiliza en la cabeza de una columna
cromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de una fase mvil de un gas inerte y a
diferencia de la mayora de las tcnicas cromatogrficas la fase mvil no interacciona con las
molculas del analito; su nica misin es transportar el analito a travs de la columna.

Cromatografa Gas - Slido: La fase estacionaria es un slido de gran

rea superficial sobre el que se adsorbe el analito. Actualmente slo se aplica a la
separacin de especies de bajo peso molecular (CO2, O2, N2 e hidrocarburos). Los
compuestos ms polares son retenidos en la fase estacionaria de manera
semipermanente.

Cromatografa Gas - Lquido: La fase estacionaria es un lquido no voltil

inmovilizado sobre la superficie de un soporte slido inerte. La velocidad de
migracin de un analito est determinada por su distribucin entre la fase lquida
inmovilizada y la fase gaseosa. La temperatura, la volatilidad del analito (Peb) y su
solubilidad en la fase estacionaria son los factores que regulan su retencin.
En la cromatografa de gases (que uno de los objetos de estudio en este trabajo:
Cromatografa Gas - Lquido), se usa como fase estacionaria un compuesto orgnico
polimrico de baja volatilidad, estable trmicamente y con adecuadas caractersticas de
disolvente. Es preciso sealar que deben usarse fases estacionarias, similares funcionalmente
al compuesto a analizar.
3.- CROMATOGRAFA DE LQUIDOS.
En cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que circula a travs de una columna en la
que est contenida la fase estacionaria. La fase mvil no slo arrastra al analito, sino que
existen interacciones intensas entre el analito y la fase mvil.
La retencin cromatogrfica es funcin de:

La fase mvil.

La fase estacionaria.

El analito.
Todas las especies que pueden disolverse pueden separarse eligiendo la combinacin
adecuada de fase mvil y fase estacionaria.
La cromatografa lquida se clasifica segn el lecho cromatogrfico:

Cromatografa Lquida Clsica: La columna es de vidrio y se usa para

mezclas complejas.

Cromatografa de alta resolucin o HPLC: La columna es de acero

inoxidable. Va a ser objeto de estudio en este trabajo.
La HPLC consta de una columna de acero inoxidable de 10 30 cm de longitud, y un dimetro
interno de 4 - 10 mm. Las partculas de la fase estacionara son de un tamao aproximado a
las 5 - 10m.
Cabe destacar que separa con gran eficacia, identifica los compuestos separados por la
columna y adems lo cuantifica por su altura o rea de picos en el cromatograma.
3.1.- Componentes bsicos en un equipo de HPLC:
De forma esquemtica los componentes bsicos son:
Sistema de suministro, Inyector Columna Detector Registrador

Bombeo y conducciones
de la fase mvil
En esta figura pueden observarse con ms detalle:

Componentes del cromatograma

Diapositiva
Normalizacin por area

Curva de calibrado
La curva de calibrado es un mtodo de qumica analtica empleado para medir la concentracin de
una sustancia en una muestra por comparacin con una serie de elementos de concentracin
conocida. Se basa en la existencia de una relacin en principio lineal entre un carcter medible (por
ejemplo la absorbancia en los enfoques de espectrofotometra) y la variable a determinar (la
concentracin). Para ello, se efectan diluciones de unas muestras de contenido conocido y se
produce su lectura y el consiguiente establecimiento de una funcin matemtica que relacione
ambas; despus, se lee el mismo carcter en la muestra problema y, mediante la sustitucin de la
variable independiente de esa funcin, se obtiene la concentracin de esta

Normalizacin de rea
La normalizacin de rea es un medio para establecer el porcentaje de
cada componente en
la muestra. Se calcula dividiendo el rea de cada componente entre el
rea total y
multiplicando por 100%, es decir:
% *100
Area total
Area de A
A = ec. 16
Este trmino es independiente del volumen de inyeccin de muestra y
debe cumplirse que
todos los picos deben estar separados. Sin embargo, esta ecuacin solo
se puede aplicar
para una serie homologa de compuestos de punto de ebullicin muy
parecidos y con

similares respuestas del detector, algo mas acorde con la realidad es

usar el factor de
respuesta. Sin embargo el factor de respuesta depende del tipo de
detector utilizado el
clculo mas sencillo se aplica para el factor de respuesta cuando se
utiliza en cromatografa
de gases un detector de ionizacin a la llama y este es el que se
explicara a continuacin.
Factor de Respuesta (clculos para el FID): Cada detector tiene su forma
particular de
respuesta para cada analito, es por ello, que la composicin de cada
componente en la
muestra no se puede relacionar directamente a menos que se unifique la
respuesta del
detector para cada componente.
La respuesta de un detector de ionizacin a la llama (FID) es
independiente de la
temperatura, del flujo de gas de arrastre y de la velocidad de flujo. Esto
hace ms sencillos
los clculos, ya que se puede realizar relaciones directas de peso de
muestra, lo cual
contribuye a que este sea el detector ideal para el anlisis cuantitativo.
El clculo de factor de respuesta se realiza experimentalmente de la
siguiente forma. Se
pesa una cantidad exactamente conocida del patrn del analito a
estudiar, se determina su
rea en el cromatgrafo y luego se realiza el clculo,

()
A
A

A
F = W ec. 17
As sucesivamente para todos los componentes en la muestra.
Una vez conocido el factor de respuesta de cada componente en la
muestra, se puede
realizar el clculo de normalizacin de rea con factor de respuesta.
RA

()
()
N

nR
ARA

AF
A*F
A

%A
n

ec. 18
Es de hacer notar, que en algunos libros se utiliza el factor de correccin
o la sensibilidad
del detector para realizar estos clculos, en ese caso observara las
siguientes ecuaciones.
ec.19
Note que al final las reas corregidas sern iguales, solo se invierte los
dividendos y
productos. Eso si es sumamente importante que no mezcle las dos
ecuaciones o se confunda
en los calculas, ya que los resultados sern errneos.
donde, Ax es el rea del componente X y en el denominador, la suma de
todas las reas. Para que este mtodo sea preciso, se debe cumplir que
todos los analitos eluyan, se detecten y tengan la misma sensibilidad bajo
el detector. Normalmente, slo se aplica a compuestos de una serie
homloga.

Absoluta

Las desventajas de este mtodo son que la inyeccin de la muestra

debe ser exacta y que las
condiciones del sistema no deben cambiar de una inyeccin a la otra.
Las inyecciones
exactas se logran mas con un sistema automatizado de inyeccin o con
el uso de vlvulas
de inyeccin manuales con lazo de volmenes exactos como el caso de
cromatografa
liquida de alta resolucin

Para realizar el clculo de la composicin de la muestra, se inyectan masas

exactas y conocidas de analito puro (patrn) y se determina su rea (A p). A
continuacin se hace una grfica relacionando el rea del pico (A p) con su
masa (mp), obteniendo entonces una curva de calibracin que debe ser

lineal y pasar por el origen del eje de coordenadas (Fig. 1). As se realizar
despus con cada uno de los patrones.

Se inyecta entonces una masa exacta de la muestra problema (m x) y se

determina el rea del componente a analizar (Ax). La masa de cada
componente se obtendr interpolando el valor del rea en la ecuacin
correspondiente a cada patrn, de forma que:

Curva de calibracin con adicin estndar

En ocasiones la matriz de la muestra es compleja y/o desconocida. Por ejemplo una
muestra de sangre contiene muchos constituyentes que no pueden ser incorporados a los
estndares en las disoluciones de los utilizados para la curva de calibracin ; en este caso
lo que se recomienda es aadir a la muestra pequeos volmenes de una disolucin de
un estndar concentrado; de esta manera la matriz que contiene el estndar no difiere
mucho de la propia muestra.
Consideremos, por ejemplo, que una muestra de un analito X en concentracin
inicial desconocida Cx da una seal Mx proporcional a dicha concentracin;
cuando a esta muestra se le aade un pequeo volumen de un estndar C es del
mismo analito, se obtendr una seal Mx+es . Como la seal es proporcional a la
concentracin del analito y como la matriz es la misma , es posible escribir:

Ultima diapo

En este mtodo, el patrn elegido no puede ser un analito de la muestra.

Este patrn se aade a la muestra a analizar en una concentracin
conocida; de ah el nombre de patrn interno. Este patrn interno debe
cumplir una serie de requisitos: eluir cerca de los picos de inters, estar
resuelto de ellos, ser de naturaleza qumica similar a los analitos de inters
y no reaccionar con ellos y debe existir en estado puro.
La forma experimental de realizar este proceso es la siguiente: se preparan
muestras que contengan dos patrones, uno, el del analito presente en la
muestra a concentracin variable y otro, el elegido como patrn interno, a
una concentracin fija. Se cromatografan estas muestras y se realiza una
curva de calibracin que debe ser lineal. A continuacin, se representa el
cociente de reas del analito patrn a concentracin variable (A x), respecto
al patrn interno, a concentracin fija (Api), frente a la masa variable del
analito patrn (mx). La calibracin se representa en la Fig. 2. Cuando se
cromatografa la muestra problema en presencia de una concentracin
dada de patrn interno, se obtienen las reas del analito problema y del
patrn interno. Basta entonces, interpolar el cociente de reas en la recta
de calibracin para conocer la masa del analito problema.