Medios de cultivo

Publicado en septiembre 26, 2012

1.- INTRODUCCION
Koch realiz sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas
de patata como soporte nutritivo slido, pero no tard en recurrir al caldo
de carne lquido, diseado por Loeffler, al que, en 1881, aadi gelatina,
logrando un medio slido transparente ideal para la observacin de la
morfologa macroscpica de las colonias microbianas. En 1887 un ayudante
de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal planas, que se
llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clsicas bandejas
de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces.
Actualmente se han preparado ms de 10.000 medios de cultivo diferentes.
Uno

de

los

sistemas

ms

importantes

para

la

identificacin

de

microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias

artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que
crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los
microorganismos

es

elCultivo.

Para

que

las

bacterias

crezcan

adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de

condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de
oxgeno adecuadas, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un
medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento
necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.
2.- MEDIOS DE CULTIVO La mayora de las bacterias patgenas requieren
nutrientes complejos similares en composicin a los lquidos orgnicos del
cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una
infusin de estractos de carne y Peptona a la que se aadirn otros
ingredientes.
2.1.-

CONDICIONES

GENERALES

PARA

EL

CULTIVO

DE

MICROORGANISMOS El desarrollo adecuado de los microorganismos en

un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran
importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio
medio.
2.1.1.- DISPONIBILIDAD DE NUTRIENTES ADECUADOS

Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de

contener, como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales
inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras
sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las
sustacnias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones
para las reacciones qumicas que tengan lugar. Todas estas sustancias se
suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de
carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparacin de estas
sustancias para su aplicacin a los medios de cultivo provocaban la prdida
de los factores nutritivos lbiles. Actualmente, la forma ms extendida de
aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, adems,
representa una fuente fcilmente asequible de nitrgeno y carbn ya que la
mayora de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las
protenas naturales, tienen capacidad de atacar los aminocidos y otros
compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la peptona. Ciertas
bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que se aade a
muchos medios sustancias como suero, sangre, lquido asctico, etc.
Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales
como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias
promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamnica. Muy a
menudo se aaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como
indicadores de ciertas actividades metablicas o bien por sus capacidades
de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.
2.1.2.- CONSISTENCIA ADECUADA DEL MEDIO Partiendo de un medio
lquido podemos modificar su consistencia aadiendo productos como
albmina, gelatina o agar, con lo que obtendramos medios en estado
semislido o slido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran
inconveniente

de

que

muchos

microorganismos

no

se

desarrollan

adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusin de este

solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los
medios slidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero
hay tambin gran cantidad de medios lquidos cuyo uso est ampliamente
extendido en el laboratorio.

2.1.3.- ESTERILIDAD DEL MEDIO Todos los medios de cultivo han de

estar perfectamente estriles para evitar la aparicin de formas de vida que
puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano
normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema
clsico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza
vapor de agua a presin como agente esterilizante)
2.2.-

CLASIFICACION Se

pueden

realizar

distintas

clasificaciones

atendiendo a su estado fsico, composicin, el uso al que se destinan:

2.2.1.- SEGN SU ESTADO FISICO Se dividen en slidos, semislidos y
lquidos:

Slidos, presentan en su composicin una agente solidificante

(AGAR) en proporcin de 12 a 15 gramos por litro.

Semislidos, presentan AGAR en su composicin, pero a una

concentracin mucho menor, entre 2,5 a 4 gramos del agente
solidificante

Lquidos, no presenta ningn agente solidificante

2.2.2.- SEGN SU COMPOSICION Se dividen en empricos, sintticos y

semisintticos;

empricos, en su composicin aparecen sustancias orgnicas.

sintticos, en

su

composicin

aparecen

sustancias

qumicas

definidas

semisintticos, en su composicin aparecen molculas naturales

hidrolizadas

2.2.3.-

SEGN

AL

USO

AL

QUE

SE

DESTINEN Se

dividen

en: enriquecidos, diferenciales o aislamiento, selectivos e inhibidores,

transporte y mantenimiento, uso general, para filtros de membrana.

enriquecidos, suelen ser medios con un nutriente simple que

presentan enriquecedores, tales como sangre de caballo, etc.

diferenciales o de aislamiento, contienen colorantes, azucares e

indicadores para provocar la respuesta bioqumica conocida

selectivos e inhibidores, adems de los componentes de los

medios diferenciales, contienen en su composicin una serie de
agentes que sirven para inhibir la flora acompaante de la muestra a
estudiar, y aislar, de esta forma, el microorganismo que se busca.

transporte y mantenimiento, se utilizan en la recogida, transporte

y conservacin de muestras biolgicas. son medios muy reductores
que inhiben las reacciones enzimticas autodestructivas dentro de las
clulas evitando los efectos destructivos de la oxidacin.

uso general, son medios que soportan el crecimiento de una amplia

variedad de microorganismos fastidiosos.

filtros de membrana, son medios que permiten el examen de

grandes volmenes con un baja concentracin de microorganismos, la
separacin de los microorganismos del medio de cultivo e incluso su
cambio de un medio de cultivo a otro, permite el crecimiento sin
interrupcin del microorganismo.

2.3.- COMPOSICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Los constituyentes

mas utilizados en la composicin de los medios de cultivo son: agar,
peptona, extracto de carne, extracto de levadura, sangre, plasma, suero,
bilis, sales biliares, gelatina, carbohidratos, indicadores,

Agar,

comercialmente

se

presenta

en

grnulos

polvos,

la

concentracin en la que se encuentra en los medios de cultivo,

depender del uso que quiera darse al medio.

Peptona,

es

un

producto

de

composicin

variable,

obtenido

generalmente de la hidrlisis cida o enzimtica de las protenas

vegetales o animales.

Extracto de carne, contiene bases orgnicas solubles, productos de

degradacin de las protenas, vitaminas y minerales.

Extracto de levadura, se consigue a partir de levadura de pan o de

cerveza y es una fuente de aminocidos y vitaminas del complejo B.

Sangre, las mas utilizada es la de sangre o carnero, tiene que estar

libre

de

agentes

antimicrobianos

para

evitar

la

inhibicin

el

crecimiento de los microorganismos. Se debe de comprobar siempre la

esterilidad, as como la ausencia de citratos ya que inhiben el
crecimiento de estafilococos.

Plasma, se utiliza para emplear la actividad coagulasa de las

bacterias, se emplea plasma humano o de conejo.

Suero, se prepara a partir de sangre recolectada sin adicin de

anticoagulante, eliminando el lquido que se separa cuando se contrae
el cogulo.

Bilis, contiene varios cidos biliares, como compuestos conjugados

con aminocidos, bilirrubina y biliverdina.

Sales biliares, inhiben el crecimiento de bacterias grampositivas y

bacilos en forma de esporas, sin afectar el desarrollo de los bacilos
entricos gramnegativos.

Gelatina,

protena

obtenida

mediante

extraccin

de

material

colgeno a partir de tejidos animales Es un agente solidificante pero

se emplea poco ya que bastantes bacterias provocan su licuacin.

Carbohidratos se adicionan por dos motivos fundamentales: para

incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de
fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos.

Indicadores, para detectar, por ejemplo, la formacin de cido o

como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el
Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH bsico y
amarillo en pH cido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya
que impide el crecimiento de la mayora de las bacterias Grampositivas).

2.4.- CONTROL DE CALIDAD Los medios de cultivo pueden prepararse en

el laboratorio a partir de diferentes ingredientes qumicos o a partir de
productos en polvo deshidratados comerciales, pero tambin pueden
adquirirse medios listos para su uso. El laboratorio debe asegurarse de que
la calidad de los medios de cultivo y reactivos es apropiada para los
ensayos realizados. Se recomienda que provengan de empresas certificadas
segn ISO 9000. El laboratorio debe asegurarse de que la certificacin
cubre todas las operaciones relevantes, entre ellas las de suministro y
entrega, cuando estas influyan en la calidad de los productos, deber
solicitar tambin, una copia del certificado de registro ISO 9000 a los
proveedores de los productos. El fabricante debera aportar, inicialmente,
una especificacin de calidad que incluya el mayor nmero posible de los
puntos siguientes:

caducidad del producto

condiciones de almacenamiento

control de esterilidad, incluyendo criterios de aceptabilidad

controles de la eficacia, incluyendo el microorganismo usado,

referencia de la coleccin de cultivos y criterios de aceptabilidad

fecha de emisin de la especificacin, plan y frecuencia de muestreo

Se recomienda realizar controles adicionales con carcter aleatorio, para

asegurarse de que los productos siguen cumpliendo las especificaciones
requeridas. Estos controles pueden incluirse en el programa interno de
control de calidad. Los medios de cultivo, productos en polvo deshidratados
y reactivos comerciales deben consumirse antes de la fecha de caducidad.
El laboratorio debe registrar la fecha de recepcin, la fecha de caducidad y
la fecha de apertura del envase. El almacenamiento debe realizarse en las
condiciones

apropiadas.

Todos

los

envases,

especialmente

los

que

contengan medios deshidratados, deben estar hermticamente cerrados.

No deben utilizarse medios deshidratados que presenten apelmazamiento o
un cambio de color.
Los lotes de medios preparados segn formula en el laboratorio deben
verificarse para comprobar que facilitan el crecimiento de determinados
cultivos microbianos procedentes de una coleccin reconocida y debe
verificarse

que

los

medios

selectivos

inhiben

el

crecimiento

de

microorganismos no deseados, as como demostrar su esterilidad. Si se

dispone

de

aislados

bien

caracterizados

reconocidos

por

otros

laboratorios, pueden tambin ser utilizados como cepas para el control de

calidad de los medios. En lugar de utilizar el mtodo frecuente de cultivo en
lnea, se recomienda utilizar un procedimiento cuantitativo que consiste en
inocular en el medio un nmero conocido, normalmente pequeo, de
microorganismos y evaluar el nmero de microorganismos recuperados.
Este mtodo puede utilizarse para establecer el nivel de recuperacin por
debajo del cual se rechaza un lote. Atendiendo a los factores que hemos
comentado el control de calidad se puede clasificar atendiendo, a su
presentacin y almacenamiento: Atendiendo a su presentacin:
Placa Petri : 2,5meses
Tubo: 6 meses
Vial: 6 meses

Frasco: 8 meses
Laminocultivos: 6 meses:
Almacenamiento, encamaras fras a una temperatura entre 4-8 C 8
3.- PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO La preparacin de los
medios de cultivo deshidratados, es en esencia, una simple manipulacin
que pone especial atencin en la calidad del medio y en la esterilidad del
proceso. Si se utiliza un medio comercializado, las instrucciones de uso
vienen detalladas en cada envase y debe seguirse de forma estricta. La
preparacin de los medios de cultivo, consta de tres partes, medios
deshidratados (seguir instrucciones del fabricante), material (agua y
esterilizacin). Respecto al agua, esta debe de ser destilada y no debe de
contener cloro, adems debe de presentar una conductividad adecuada y
un contenido inico tal como indican las especificaciones de agua
purificadas de la USP.
3.1.- MODELO ESTANDAR DE PREPARACION En la preparacin de los
medios de cultivo en un laboratorio de Microbiologa, se siguen los
siguientes pasos:
Paso 1, se disuelve la cantidad de medio que aconsejan los manuales de
microbiologa del medio que se va a fabricar en el volumen de agua
destilada o desionizada que se nos indique. La disolucin se debe hacer
calentando y agitando al mismo tiempo, cuando se trata de un medio de
cultivo slido o semislido, hasta que se disuelva por completo. Si el medio
de cultivo es lquido con una fuerte agitacin e suficiente.
Paso 2, se esteriliza el medio de cultivo, ya disuelto, en autoclave. Despus
de permanecer en el autoclave el tiempo requerido, (1litro de medio
necesita 15 minutos de autoclave a 121C, ciclo de esterilizacin), se abre
lentamente y se deja que se atempere.
Paso 3, los medios se trasladan a una zona estril, para irlos enfriando
lentamente y aadirles, si procede, los suplementos requeridos para cada
medio (sangre, antibiticos, vitamins,etc).

Paso 4, se dosifica el medio de cultivo, la temperatura oscila entre 45-50C,

en el tipo de envase que se vaya a requerir en condiciones totalmente
aspticas.
5.- INCUBACION A la hora del crecimiento bacteriano, existen una serie
de factores que pueden modificar dicho desarrollo, para la cual debemos de
utilizar unos parmetros correctos de incubacin para que posteriormente
permita realizar una buena identificacin.
5.1.- CONDICIONES ADECUADAS DE HUMEDAD Un nivel mnimo de
humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es imprescindible para
un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en los cultivos.
Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mnimas en las
estufas de cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de agua
que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y
evitar as que se deseque el medio.
5.2.- PRESENCIA (O AUSENCIA) DE OXGENO Y OTROS GASES Gran
cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de
oxgeno normal (aerobios estrictos). Algunas pueden obtener el oxgeno
directamente de variados sustratos (anaerobios facultativos) Pero los
microorganismos anaerobios estrictos slo se desarrollarn adecuadamente
en una atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto intermedio, los
microorganismos microaerfilos crecen mejor en condiciones atmosfricas
parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy reducida), mientras los
anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a
cualquiera de las citadas condiciones.
5.3.- HUMEDAD Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en
la atmsfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las clulas
vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento
de estas condiciones mnimas en las estufas de cultivo a 35-37C
proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad
necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar as que se deseque el
medio.
5.4.- LUZ AMBIENTAL La mayora de los microorganismos crecen mucho
mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones
evidentes como sera el caso de los microorganismos fotosintticos.

5.5.- pH La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el

crecimiento de los microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan
mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios
ms o menos cidos. No se debe olvidar que la presencia de cidos o bases
en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin
embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metablicos normales.
5.6. TEMPERATURA Los microorganismos mesfilos crecen de forma
ptima a temperaturas entre 15 y 43C. Otros como los psicrfilos crecen a
0C y los termfilos a 80C o incluso a temperaturas superiores
(hipertemfilos). En lneas generales, los patgenos humanos crecen en
rangos de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C, y los
saprofitos tienen rangos ms amplios.
6.- SIEMBRA E INOCULACION. La siembra consiste en disponer las
bacterias que queremos estudiar en un medio de cultivo de una forma
adecuada, La siembra puede ser: Para aislamiento, para poder llevar a
trmino el estudio de un microorganismo es condicin necesaria aislarle del
resto de microorganismos acompaantes. Otras tcnicas, son pruebas que
no permiten aislamento, en este caso se pueden utilizar tantos medios
slidos como lquidos.
6.1.- SIEMBRA EN TUBO EN MEDIO LQUIDO Se puede realizar
atendiendo al instrumento con que siembre, bien asa de siembra, pipeta o
hisopo.
Asa de siembra, los tubos, del que se a va a sembrar y el que contiene el
medio, se toman con la mano izquierda, colocando las bocas a la misma
altura. Con la mano derecha se toma el asa de siembra, se esteriliza en la
llama en posicin vertical hasta que se ponga incandascente. Se destapan
los tubos, tomando se esterilizan las bocas de los tubos pasndolos por la
llama, se introduce el asa en el material y se introduce en el medio de
cultivo hasta el borde de lquido. Por ultimo se esteriliza el asa y el tubo se
agita para una buena homogenizacin del inculo.
Tubo, se puede utilizar cualquier pipeta, pero generalmente se utiliza la
pipeta PASTEUR, se utiliza la tcnica expuesta anteriormente, pero esta vez
el inculo el liquido.

Hisopo, el hisopo o torunda debe de ser estril y viene protegido dentro de

un tubo de plstico
6.2.- SIEMBRA EN TUBO EN MEDIO SLIDO Atendiendo al tipo de
medio slido, nos podemos encontrar que sean en tubo, placa PETRI
6.2.1.- TUBO. El agar tiene que estar en posicion inclinada, dejando una
lengeta en la parte superior y en la parte inferior una parte ms ancha. Se
pueden realizar dos tcnicas, por estra y picadura, en ambos casos nos
dice las caractersticas bioqumicas de la bacteria a estudiar (fermentacin
de azucares, movilidad, reduccin de metales, etc.)
6.2.2.- PLACA PETRI.
Se realiza en agar, se emplea para aislamiento de bacterias y para la
realizacin de antibiogramas. En este ltimo caso, previamente se tiene
que realizar una dilucin de la muestra (con la bacteria totalmente aislada)
y se siembra con el hisopo en el medio en el cual se va a realizar el
antibiograma, generalmente Mueller-Hinton, aunque atendiendo al tipo de
bacterias podemos emplear agar sangre (hemlisis) y agar chocolate
(factores X y V).
https://conalepfelixtovar.wordpress.com/2012/09/26/medios-de-cultivo/
Tovar, F, 2012